一种氨基酸及多肽物质的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种纯化方法，具体涉及一种氨基酸及多肽物质的纯化方法，尤其涉及一种用于处理含和/或氯盐的氨基酸或/和多肽粗品的纯化方法，属于蛋白质与多肽纯化技术领域。
【背景技术】
[0002]凝胶层析是根据分子大小分离蛋白混合物的方法之一，混合物随流动相流经装有凝胶固定相的层析柱时，由于混合物中各物质的分子大小和形状不同，因此，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，使其最后流出柱外，整个过程和过滤类似，故又名凝胶过滤。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐置换缓冲液以及利用分子量差异等除去热源。但需用大量的蒸镏水或其它稀溶液洗柱，溶剂量大，废水处理量大，工业化应用有待结合自身情况综合考虑。
[0003]置换层析是一种非线性的层析技术，与传统的洗脱层析技术相比有明显的优点，即高上样量高产率高分辨率，被分离样品在分离过程中有浓缩效应，这一技术已经越来越引起人们的关注，利用一种非线性层析技术，借助小分子高效置换剂交换色谱柱上的样品，从而达到分离的目的它具有分离组分含量较少成分的特性，研宄表明，置换剂的相对分子质量越低，越容易于与固定相结合，因此在分离相对分子质量较小的多肽时，需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来，处理量也随之增大。随着生物技术工业的发展，生物物质层析分离的工业化应用就显得越来越重要了。以往的制备性分离技术往往是将实验室里的线性分析型分离技术简单地进行扩大，但上样量的限制，低浓度洗脱和层析过程的稀释效应，使得样品组分的回收率很低，经济效益较低。
[0004]与离子色谱以及中低压色谱相比较，反相高效液相色谱(RP-HPLC)是以液体为流动相的色谱技术，具有高灵敏度高压高速，柱子可以反复使用，分离效果较好，比较稳定，回收方便，特别适用于分子量低于5000，尤其是10000以下的多肽的分离纯化.但由于肽在溶液中的扩散系数小，黏度比较大，介质的PH值，外界温度，有机溶剂性质等会导致有些结构改变，产生变性。这种分离纯化技术也存在其它劣势，如:对柱子要求严格，需要摸索最佳条件等。其它色谱方法，如疏水作用色谱(HIC)，金属离子亲和层析(IMAC)也有一些类似问题。
[0005]有机溶剂沉淀法是最传统方法之一，其原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些氨基酸及多肽在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下，有机溶剂的浓度不同，物质析出顺序也不一样，因此，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化氨基酸及多肽。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的氨基酸及多肽，可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂沉淀，它们有一定的亲水性和较强的亲脂性，是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出，用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法，不仅分辨率高，提纯效果好，可同时分离多种血浆成分，而且有抑菌、清除和灭病毒的作用。但此方法在处理某些产物时，一次不能很好地达到纯化效果，需多次醇析，损失大。
[0006]在实际工作中，有时很难用单一方法实现氨基酸及多肽等水溶性化合物的分离纯化，一种理想的分离提纯方法往往要求最终目的产品的纯度和回收率越高越好，但实际上两者难以兼顾。因此，考虑分离提纯的条件和方法时，不得不在两者之间作适当的平衡。因此当需要提纯氨基酸及多肽等产物时，要根据其物理、化学性质等特性，选择一套适当的提纯程序来获取高纯度的目标产物的同时，尽量得到多的产品。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种简单高效的分离纯化方法，解决在合成过程中铵盐等较难除去的盐对产品纯度和物性方面的影响，同时节约成本，溶剂处理量小，对环境污染小，工艺操作简单，生产成本低，特别适合工业化大生产。
[0008]为了达到上述发明目的，本发明的技术方案为:
本发明将含有铵盐等的水溶性氨基酸或/和多肽粗品溶于水、或含水的混合溶剂、或直接使用溶液，加特定的碱溶液，如水合肼、氢氧化锂等，调节PH值到7-14，优选为7-11，最优为9-10，将铵盐等杂质转换成与目标氨基酸或/和多肽(在有机溶剂沉淀法中析出)物性不同，可以溶于甲醇、乙醇、丙酮等适合工业化生产的有机溶剂的肼盐或锂盐，转化后的溶液可以减压浓缩干或部分浓缩，加水或不加水溶解，再加酸，如盐酸等调PH值到任何所需要的值(适合氨基酸或/和多肽沉淀的环境且保证肼盐或锂盐溶于后续处理的有机溶剂)，然后在合适温度下滴加有机溶剂析出目标产物，目标产物也可以继续加入有机溶剂在特定温度下洗涤或重结晶，直到得到合格产品，产品进一步冷却，抽滤和烘干等得到高纯度的精品O
[0009]具体地，该纯化方法为:使用具有调节pH作用的转化剂将氨基酸或/和多肽的粗品水溶液的pH调整为适合值(一般为7-14，优选为7-11，最优为9-10)，使与目标氨基酸或/和多肽在后续有机溶剂沉淀法中溶解性相似的杂质转化为溶解性不同的产物，加酸调整PH值后采用有机溶剂沉淀法得到精品。其中，在上述方法中需要去除的杂质包括铵盐和/或氯盐等，它们可能在氨解时产生，也可以因为酸碱中和而引入，转化后的溶解性不同的产物可以溶于后续有机溶剂沉淀法中使用的有机溶剂，包括肼盐或锂盐等，使用的转化剂可以包括水合肼或氢氧化锂等。
[0010]本发明实施例中的氨基酸包括天然与非天然氨基酸、如D或L氨基酸(该方法不影响目标物的构型)、以及它们的DL混合物；多肽包括含两个或多个氨基酸的直链肽或环肽，以及它们的衍生物，如酯或酰胺等。具体例子包括甘氨酸、精氨酸，水溶性的甘谷二肽、甘酪二肽、丙谷二肽等。
[0011]其中，加酸的作用为:加酸将待采用有机溶剂沉淀法的处理液调节为适合氨基酸或/和多肽沉淀的环境，具体在目标氨基酸或/和多肽等电点附近，并兼顾肼盐或锂盐在有机溶剂中的溶解性。
[0012]更具体地，该纯