红细胞的处理的制作方法

红细胞的处理的制作方法
【专利摘要】本申请公开了处理红细胞的组合物和方法。所述方法包括使红细胞样品活体外与，足以使得红细胞样品中存在的至少部分胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮的化合物接触。在经所述的活体外处理后将红细胞施用于哺乳动物，降低了所施用的红细胞对被施用的哺乳动物的副作用。
【专利说明】红细胞的处理
[0001] 对相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2011年11月7日提交的美国临时专利申请No. 61/556, 661的优先权， 所述在先申请的全部内容通过参考的形式全部并入本申请。

【技术领域】
[0003] 本发明涉及在施用于哺乳动物之前处理红细胞的组合物和方法。
[0004] 发明背景
[0005] 储存长达两周以上的红细胞输血与感染率提高、住院时间延长，以及重症监护 治疗病房和正接受心血管手术的患者死亡率升高相关（Triulzi等人，Transfus Apher Sci2010 ;43:95-106)。延长的红细胞储存引起红细胞中显著的生化的，机械的以及功能性 的改变，总称为"储存性损伤（storage lesion)"。（Kim-Shapiro 等人，Transfusion2011; 51:844-51)。需要用于降低或去除用储存红细胞输血的副作用的组合物和方法。
[0006] 发明概沭
[0007] 本发明至少部分地基于下述发现，即用氧化氮活体外（ex vivo)处理储存的红细 胞可使得胞外亚铁血红蛋白氧化成为高铁血红蛋白，此种处理防止储存的红细胞在被施用 于哺乳动物后诱导血管收缩。氧化氮或释放氧化氮的化合物预处理储存的红细胞，可用作 减少或消除与用储存的血液输血相关的副作用的手段。在施用于哺乳动物之前对血液进行 处理，可免除为了解决由用储存的血液输血所导致的副作用，而对输血后的哺乳动物进行 治疗的需要。
[0008] 本申请公开了，通过使红细胞样品活体外与，足以使得红细胞样品中存在的至少 部分胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮的化合物接 触，对红细胞样品进行处理的方法。胞外亚铁血红蛋白包括无细胞血红蛋白和含胞外血红 蛋白的微颗粒（参见 Donadee 等人，Circulation2011 ; 124:465-76)。
[0009] 本申请还公开了，通过对哺乳动物施用下述的红细胞样品以防止或减少在施用红 细胞后哺乳动物中的血管收缩，所述的红细胞样品已活体外与，足以使得红细胞样品中存 在的至少部分胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮的化 合物接触。
[0010] 在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述的方法并不显著地氧化样品 中的红细胞或减弱它们的携氧能力（例如，红细胞中低于20%，低于15%，低于10%，或低 于5%的血红蛋白被转化成高铁血红蛋白）。
[0011] 本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述的红细胞样品在与氧化氮或释 放氧化氮的化合物接触前，已经历过一种或以上活体外，泵（例如，负压泵吸引），膜，和/或 气泡（air bubbles)处理。在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述的红细胞 样品在与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，已或活体外经历过，血液透析，术中血液 抢救，心切开吸引术。在这些方法中，所述的红细胞在遭受使其需要经本申请所公开的方法 进行处理的损伤之前，仅需要处于哺乳动物体外，一小段时间（例如，几秒或几分钟）。
[0012] 红细胞样品包含红细胞和上清液或血浆。所述的红细胞样品可以是，例如，全血或 浓缩红细胞。
[0013] 所述红细胞样品可活体外储存，例如，在从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化 氮的化合物接触前，至少24小时。在一些具体实施方案中，所述红细胞样品从供体中移除 后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，活体外储存至少7天，至少14天，至少28天， 至少42天或更长时间。所述红细胞样品在储存之前可任选地用储存溶液稀释。
[0014] 施用于哺乳动物之前，红细胞可来源于自体或同种异型供体。因此，所述红细胞样 品可包含自体红细胞或同种异型的红细胞。所述红细胞样品可储存于多种储存介质（例 如，Adsol)。在用氧化氮或释放氧化氮的化合物处理之前，所述红细胞样品可任选地被冻 融。
[0015] 本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述的处理使得所述红细胞样品中 至少20% (或至少50%，或至少80%)的胞外亚铁血红蛋白被转化成高铁血红蛋白。
[0016] 在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述红细胞样品与用惰性气体稀 释的、含气态氧化氮的治疗性气体接触。治疗性气体中所述气态氧化氮的浓度可以是，例如 至少 20ppm，至少 40ppm，至少 50ppm，至少 80ppm，至少 lOOppm，至少 200ppm，至少 300ppm, 或至少500ppm。在一些具体实施方案中，所述治疗性气体中气态氧化氮的浓度在50ppm到 800ppm(例如，40ppm 到 200ppm, 80ppm 到 200ppm, 80ppm 到 500ppm, lOOppm 到 800ppm,或 40ppm到3,000ppm)的范围。所述红细胞样品可与治疗性气体在不同长度的时间段（例如， 至少1秒，低于5秒，低于30秒，至少1秒但低于5秒，至少1秒但低于30秒，至少1分钟， 至少2分钟，至少3分钟，至少4分钟，至少5分钟，至少6分钟，至少7分钟，至少8分钟， 至少9分钟，至少10分钟，至少1小时，至少2小时，或更长的时间）内相接触。
[0017] 在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述红细胞样品与释放氧化氮的 化合物接触。所述释放氧化氮的化合物任选地包含亚硝酸盐。所述释放氧化氮的化合物 可以是超短作用（ultra-short-acting)释放氧化氮的化合物（例如，1-[2-(羧基）批咯 烷-1-基]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物（diolate)或（Z)-1-[N-甲基-N-[6-(N-甲基铵 基己基）氨基]]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物）或释放二醇二氮烯鎗（nonoate)的中间 物。
[0018] 本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述方法在无菌条件下进行。所述 红细胞样品在其从供体获得，乃至用氧化氮或释放氧化氮的化合物进行处理的整个过程 中，均保持在无囷条件之下。
[0019] 在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述红细胞样品与作为顺序 (in-line)输注（infusion)系统的一部分的氧化氮接触，其中，所述的红细胞样品从含所 述样品的容器流出，和与惰性气体中的氧化氮源相连的层流设备或第二流式气体交换设备 中的透气材料（例如微孔膜）接触，使红细胞样品暴露于氧化氮，并在暴露于氧化氮之后递 送至所述哺乳动物。所述的氧化氮源可以是例如，含压缩的氧化氮气体的罐或电动氧化氮 发生器（含或不含N0 2净化剂）。
[0020] 经本申请所描述的方法治疗的哺乳动物可以是人，或非人灵长类，或另外的哺乳 动物，如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、兔或仓鼠。
[0021] 本申请所提及的全部的出版物，专利申请，专利，序列，数据条目以及其他参考文 献，均以参考的形式全文并入本申请。除非另外定义，本申请所用的全部技术和科学术语具 有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。存在分歧时，包括定义在内，以本说明 书为准。下文中描述了用于本发明的材料和方法，但是类似或等价于本申请所描述的其他 合适的材料和方法也可以用于实施或检验本发明。所述的材料、方法和实施例仅作为示例， 并非旨在进行限定。
[0022] 本发明的其它特征和有益效果，在下述的详细描述以及权利要求中显而易见。
[0023] 附图简沭
[0024] 图1A-1D提供，在体外鼠 RBC中储存诱导的形态，生化和功能改变。㈧新鲜红细 胞（FRBC，上部的图）和储存的红细胞（SRBC，下部的图）的染色涂片，下部图中的箭头 显示储存两周后增多的异型RBC数量。（B)FRBC和SRBC的氧解离曲线（ODC)。P 5(l，定义 为Hb50%饱和时的氧分压，由所述的0DC计算出来。所述SRBC的0DC向左偏移，其P5Q为 21±lmmHg,相比之下，FRBC 的 P5。是 43±0mmHg。（C)FRBC(n = 5)和 SRBC(n = 5)与 P5。的 FRBC(n = 3)和SRBC(n = 3)的2, 3-DPG水平变化比较。（D)通过WT小鼠中输血后24小 时测定的、GFP-标记的RBC百分比除以在0时间GFP-标记的RBC的百分比，确定FRBC (η =6)或SRBC(n = 6)存活率。FRBC，新鲜红细胞（< 24h) ;SRBC，储存的红细胞（2周）。 *Ρ〈0. 01，与FRBC相比的差异。
[0025] 图2A-2C是显示用FRBC或SRBC输血2小时后，清醒的WT (A)，给予HFD的WT⑶ 以及db/db(C)小鼠中的血清铁水平的图表。对照，没有输血（n = 4/组）；FRBC，用FRBC(n =6/组）输血；SRBC,用SRBC (η = 6/组）输血。*Ρ〈0· 05,与对照和FRBC相比的差异。
[0026] 图3A-3C是显示用FRBC或SRBC输血2小时后，清醒的WT (A)，给予HFD的WT⑶ 以及db/db(C)小鼠中，IL-6(A)，Hp(B)，和Hx(C)的血浆水平的图表。对照，没有输血（η =4/组）；FRBC，用新鲜RBC(n = 6/组）输血；SRBC，用储存的RBC(n = 6/组）输血。 *P〈0. 05，与对照相比的差异；fP <〇.〇1，与FRBC相比的差异。
[0027] 图4A-4C是显示用FRBC或SRBC输血2小时后，清醒的WT (A)，给予HFD的WT⑶ 以及db/db(C)小鼠中，肝ΗΟ-lmRNA水平的图表。对照，没有输血（n = 4/组）；FRBC，用新 鲜RBC(n = 6/组）输血；SRBC，用储存的RBC(n = 6/组）输血。*Ρ〈0· 05,与对照和FRBC 相比的差异。
[0028] 图5A-5E是显示经历不同类型的输血（10%估算血容量）后，清醒的WT，给予HFD 的WT，或db/db小鼠中的体循环血压（SBP，mmHg)的图表。（A)清醒的WT小鼠中以FRBC(n =5)或SRBC (η = 6)输血。（B)清醒的给予HFD的WT小鼠中以FRBC (η = 6)或SRBC (η =6)输血。（C)清醒的db/db小鼠中，以呼吸了（η = 12)、或没有呼吸（η = 9)氧化氮 (iNO, 80ppm)的 FRBC (η = 9)或 SRBC 输血。（D)清醒的 db/db 小鼠中，以来自 FRBC (SFRBC，η =11)的上清液，来自SRBC(SSRBC，n = 7)的上清液，或氧化的SSRBC(n = 6)输血。（Ε)清 醒的db/db小鼠中以洗过的FRBC (η = 9)或洗过的SRBC (η = 6)输血。FRBC，新鲜红细胞； SRBC，储存的红细胞。*Ρ〈0. 05,与FRBC和SRBC+iNO相比的差异。
[0029] 图 6A-6B 是显示比较用 FRBC (SFRBC，η = 6)上清液，SRBC (SSRBC，η = 6)上清液， FRBC (η = 7)或SRBC (η = 7)输血之前之后，经麻醉的db/db小鼠中体循环血流动力测定 结果的变化的图表。（A)输血前和输血10分钟后LVESP(mmHg)的变化。（B)输血前和输 血10分钟后SVRI(%)的变化。LVESP，左心室收缩期末压力；SVRI，体循环血管阻力指标， *P〈0. 05,与FRBC上清液或FRBC组相比的差异。
[0030] 图7是显示在添加溶液-1 (additive solution-ι)中储存的、白细胞减少的 (leukoreduced)羊PRBC的体内存活率的图表。y-轴显示循环中的生物素化的PRBC。输血 后第一个24小时96 ± 4%的生物素化的新鲜PRBC存活，而76 ± 7 %的生物素化的储存PRBC 在输血后24小时在循环中。*P = 0. 001，与新鲜PRBC相比的差异值，tP=〇.〇〇2,与新鲜 PRBC相比的差异值，#P〈0. 001，与新鲜PRBC相比的差异值，§P = 0. 002,新鲜PRBC与储存 PRBC相比的差异值。PRBC=浓缩的红细胞。所有数据平均值土SD。
[0031] 图8A-8B是显示用新鲜的和储存的PRBC输血过程中和之后，在清醒的小羊羔中 测定的（A)肺动脉平均压，和（B)肺血管阻力指标的图表。一些小羊羔在用储存的PRBC 输血过程中和之后接受了吸入的氧化氮。*P〈〇. 05,储存的PRBC值与新鲜PRBC和储存的 PRBC+iN0，AN0VA的差异。iNO =吸入的氧化氮；PAP =肺动脉平均压；PRBC =浓缩的红细 胞；PVRI =肺血管阻力指标。全部数据平均值土SD。
[0032] 图9A-9C是显示用新鲜的和储存的PRBC输血过程中和之后测定的⑷肺动脉平 均压，（B)肺毛细血管楔压，和（C)肺血管阻力指标的图表。一些小羊羔在用储存的PRBC 输血过程中和之后接受了吸入的氧化氮。*P〈〇. 05,储存的PRBC值与新鲜PRBC和储存的 PRBC+iNO, AN0VA的差异。L-NAME在输血前施用以诱导内皮功能不良（?·Ρ<0.05,各组中， 在第-60分钟（L-NAME之前）的测定值，与第-50分钟和第-10分钟之间的测定值的差 异）.iNO =吸入的氧化氮；L-NAME = NG-硝基-L-精氨酸甲基-酯；ΡΑΡ =肺动脉平均压； PCWP =肺毛细血管楔压；PRBC =浓缩的红细胞；PVRI =肺血管阻力指标。全部数据平均值 土SD。
[0033] 图10是显示用新鲜的和储存的PRBC输血之前和之后，在健康的清醒的小羊羔中 测定的血浆血红蛋白水平的图表。一些小羊羔在用储存的PRBC输血过程中和之后接受了 吸入的氧化氮。*P〈〇. 05,新鲜PRBC值与储存的PRBC和储存的PRBC+iNO, AN0VA的差异。 iNO =吸入的氧化氮；PRBC =浓缩的红细胞。全部数据平均值土 SD。
[0034] 图11A-11B是显示用新鲜的和储存的PRBC输血之前和之后，在清醒的小羊羔中 测定的血浆（A)硝酸盐和（B)亚硝酸盐水平的图表。*P〈0.05,储存的PRBC+iNO值与新鲜 PRBC和储存的PRBC，AN0VA的差异。iNO =吸入的氧化氮；PRBC =浓缩的红细胞。全部数 据平均值土 SD。
[0035] 图12是显示红细胞上清液中血红蛋白种类的相对浓度的图表，所述的红细胞上 清液，经由微孔气体交换器，用氮气中的气态氧化氮处理过。
[0036] 图13是显示红细胞中高铁血红蛋白相对浓度的图表，所述的红细胞，经由微孔气 体交换器，用氮气中的气态氧化氮处理过。
[0037] 图14A-14B是显示ΜΑΗΜΑ/Ν0处理对人和鼠储存的红细胞的作用的图表。A)无细 胞上清液血红蛋白与胞内高铁血红蛋白红细胞水平的氧化比较，B)上清液（[Hb]，μ M)和 红细胞（Hct，％ )中的血红蛋白浓度。
[0038] 图15是显示在将储存的红细胞（储存2周）和经ImM ΜΑΗΜΑ/Ν0, 5% v/v，预处理 的储存的红细胞输注到清醒的db/db小鼠之前和之后，通过非侵入性的尾部套囊测定的收 缩压（mmHg)，*P〈0. 05,与用ΜΑΗΜΑ/Ν0预处理的SRBC相比的差异。
[0039] 图16显示用于气体-气体转移实验的含膜设备。
[0040] 图17是显示不同的气流比例（数据以平均值土 SD表示，η = 6 ;G1/G27:1，气流 比例7:1 ;G1/G214:1，气流比例14:1)通过微孔的（MP)和聚甲基戊烯（PMP)膜的氧化氮浓 度的图表。
[0041] 发明详沭
[0042] 将储存的红细胞施用于哺乳动物引起血管收缩以及其他的副作用。本发明提供用 于减少和消除施用储存的红细胞后所出现的副作用的组合物和方法。如所附的实施例中详 细描述的，通过将其暴露于氧化氮，氧化储存的红细胞上清液，将胞外活性的亚铁血红蛋白 转化成无活性的高铁血红蛋白，消除由于施用储存的红细胞所出现的血管收缩。
[0043] 红细朐
[0044] 红细胞可来源于自体或同种异型的供体，接下来，将其施用于受体。红细胞的储存 导致在将储存所血液施用于受体后诱导血管收缩（Reynolds等人（2007) Proc. Natl. Acad. Sci. 104:17058-62 ;Bennett-Guerrero 等人（2007)Proc. Natl. Acad. Sci. 104:17063-68)。 根据本申请所描述的方法，在向供体输注前，可在多种时间段（例如，至少1，2, 3, 4, 5, 6,或 12小时，或至少1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21，28, 42天，或更长时间）内储存人红细胞。红细胞可 以，例如全血或浓缩红细胞的形式施用。
[0045] 氣化氮
[0046] 根据诸如所述红细胞样品的大小，流速，暴露于氧化氮的时间长度，相对于微 孔气体渗析膜中的混合的层流程度之类的因素，和/或治疗医师认为相关的其他因素， 合适用于处理红细胞样品的氧化氮浓度不尽相同，例如，从20ppm到80ppm, 200ppm到 500ppm, 500ppm到800ppm, 2, 800ppm, 3, OOOppm,或更高。药品级的氧化氮是可商购的（ΙΝ0 max?, Ikaria, Inc. , Clinton, NJ) 〇
[0047] 用于处理红细胞样品的气态氧化氮可由储存的、压缩氧化氮气体源施用。所述的 氧化氮源可以是100%氧化氮，或是用n 2或任何其他惰性气体（例如氦）稀释的。所述的 氧化氮可以，以不含〇2或氮气的高价氧化物的混合物形式获得并储存。需要时，可通过化学 发光分析证明氧化氮的纯度。化学发光Ν0-Ν0 χ分析仪是可商购的（例如Modell4A, Thermo Environmental Instruments, Franklin, ΜΑ)。混合物中氧化氮的最终浓度可通过化学的或 化学发光技术（参见例如，Fontijin等人，Anal. Chem. 42:575(1970))证明。另外，Ν0和 N02浓度可通过电化学分析仪方式监控。任何杂质，如N02，可通过暴露于NaOH溶液，二氧化 碳吸收剂（baralyme)或者碱石灰（sodalime)洗去。作为额外的对照，还可以评估最终气 体混合物中的Fi0 2。
[0048] 将氧化氮气体施用于红细胞样品可通过，例如，N2(或惰性气体）中的压缩的氧 化氮气体的罐和第二氮气（或另一种惰性气体）罐附加在设计用于将两种来源的气体混 合的设备来实现。通过控制每一来源的气体的流速，可将最终施用于所述红细胞样品的氧 化氮浓度保持在最佳水平。也可以利用标准的低流量混合器（例如，Bird Blender, Palm Springs, CA)使氧化氮气体与室内空气（room air)混合。
[0049] 氧化氮可由队和02(即空气）通过电动氧化氮发生器生成。此种发生器如 Zapol，U. S. Patent No. 5, 396, 882中所描述。由此类设备形成的N02可在将血液样品暴露 于N02之前，通过净化所述的气体混合物来减少。
[0050] 用于将氧化氮递送到红细胞样品的气体递送设备可包含氧化氮计量器，以监控暴 露于样品的氧化氮的总剂量。通过使用计量器，即可确定样品已经接受了所需量的氧化氮， 由此可以逐渐停止或终止氧化氮的施用。计量器可将治疗性气体中的氧化氮浓度（由氧化 氮浓度计测定）与气体流速（由气体流量计测定）整合，以确定暴露于所述红细胞样品的 氧化氮的总量。
[0051] 可使用透气材料使得气态氧化氮扩散通过，与所述红细胞样品接触。此类材 料的示例包括透气膜，如在血液氧合器中所使用的那些（例如，二甲聚硅氧烷或聚烷基 砜），和微孔性材料，如Gore-tex?或Celgard?，其允许氧化氮之类的气体分子通过其微 孔，溶解在液体中。一种示例性的氧合器（Living Systems Instrumentation Inc.，St. Albans, Vermont)的使用在后附的实施例中有描述。所述透气材料的部件可被设置成，一面 与所述红细胞样品接触，另一面与氧化氮源接触，使红细胞和氧化氮源相分离，但允许氧化 氮气体的单个分子通过并扩散到所述的样品中。在输注过程中，氧化氮可任选地与红细胞 样品接触，由此，使从包含所述红细胞样品的容器流出的红细胞样品暴露于通过所述透气 材料（其允许氧化氮扩散到红细胞样品中）的氧化氮，并最终施用于所述的受体。也可以使 用具有第二流量（secondary flows)的气体交换器（参见，例如，Zapol和Qvist, Artificial Lungs for Acute Respiratory Failure, New York, Academic Press, 1976)〇
[0052] 可制备包含氧化氮的水溶液，用于将氧化氮递送给红细胞样品。在引入到 所述红细胞样品之前，所述的氧化氮可溶解于药品可接受的载液（carrier liquid) 中。可用于此种目的的载液包括标准的盐溶液和小份（aliquots)的所述红细胞样 品，以及液体，如氧化氮在其中展现高水平溶解度的碳氟化合物或有机的溶剂（Shaw和 Vosper J.Chem. Soc. Faraday Trans. 1.73:1239-1244, 1977 ；Young, Solubility Data Series8:336-351，1981)，由此大量聚集的氧化氮可以在小容量的载体中递送。
[0053] 释放氣化氮的化合物
[0054] 作为所使用的氧化氮的替代（或另外的选择），根据本申请所描述的方法可将释 放氧化氮的化合物暴露于红细胞样品。适用于本申请的方法的释放氧化氮的化合物包括： 亚硝基或亚硝酰化合物（S-亚硝基-N-乙酰青霉胺，S-亚硝基-L-半胱氨酸，和亚硝基胍）， 其以氧化氮组分自发释放、或在生理条件下由所述化合物转移出来为特征；化合物，其中的 氧化氮是过渡金属复合物上的配体，因此可以容易地释放或在生理条件下由所述化合物转 移出来（例如，硝普盐，氧化氮-铁氧还原蛋白或氧化氮-血红素复合物）；和酶代谢产生 氧化氮自由基的含氮化合物（例如，精氨酸，三硝酸甘油，亚硝酸异戊酯，亚硝酸钠，无机亚 硝酸盐叠氮化物，和羟胺）。另外的释放氧化氮的化合物包括硝酸甘油和SIN-1。
[0055] 释放氧化氮的化合物可以是超短作用释放氧化氮的化合物，例如1-[2_(羧基）吡 咯烷-1-基]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物（"PR0LI/N0"），1-羟基-2-氧代-3-(N-甲 基-3-氨基丙基）-3-甲基-1-三氮烯（"N0C-7";Zhang 等人（1996)Circulation94:2235)， Ν，Ν' -二甲基乙二胺的氧化氮加合物（"DMHD/N0" ；Kaul等人（1997)1乂&^丨〇￥&8。· Pharmacol. Ther. 19972(3) : 181)，或（Z)-1-[N-甲基-N-[6-(N-甲基铵基己基）氨基]二 氮烯-1-鎗-1,2-二氧化物（"MHMA/N0"）。在一些具体实施方案中，所述的超短作用释 放氧化氮的化合物具有低于90分钟（或低于60分钟，低于30分钟，低于20分钟，低于10 分钟，低于5分钟，低于2分钟，或低于1分钟）的半寿期。
[0056] 已知的化合物或据信可以释放氧化氮的化合物（例如，超短作用释放氧化氮的化 合物）可使用本申请所述的动物模型直接试验其效力。此外，此种化合物可首先根据其激 发鸟苷酸环化酶的能力进行筛选，在如Ishii等人（1991)Am. J.Physiol. 261:H598-H603所 描述的体外试验中，氧化氮结合鸟苷酸环化酶并由此发挥其生物学活性。
[0057] 以下是实施本发明的实施例。所述实施例不以任何形式构成对本发明范围的限 制。 实施例
[0058] 实施例1:小鼠中糖尿病力口剧（Augments)以及氧化氮，防lh同基因的（Syngeneic) 储存血液输血后的不自血流动力影响
[0059] 动物
[0060] 所有的动物研究均得到位于 Massachusetts General Hospital, Boston, MA 的动物研究委员会的许可。对8-10周龄的雄性C57BL/6J野生型（WT)小鼠和 B6. Cg-m+/+L印rdb/J (C57BL/6J背景）糖尿病（db/db)小鼠进行了研究。另外的WT小 鼠饲喂高脂饮食（60kcal%脂肪；Research Diets, Inc.，New Brunswick，NJ)4_6 周（给 予HFD的WT)。8-10周龄的，在其红细胞上表达GFP的、雄性、绿荧光蛋白（GFP)转基因 C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J(C57BL/6J背景）小鼠用于测定RBC存活率。全部的小鼠均 由 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)获得。
[0061] 鼠血液收集与储存
[0062] 在无菌条件下，通过开胸心脏穿刺将C57BL/6J WT小鼠的血液（?1ml/小鼠） 收集到含 CPDA-1 的注射器（Sigma-Aldrich，St. Louis，M0)中。CPDA-1 的终浓度是 14%。 收集后，使血液通过新生儿白细胞减少滤器（neonatal leukoreduction filter) (Pall Biomedical Products Co·, East Hills, NY)，减少白细胞。减少了白细胞的血液600g离心 15min，去除血楽调节血细胞比容（Hct)7〇-75%，于4°C下储存于Eppendorf管。利用當变 形细胞溶解物试验（LAL)(参见Novitsky等人J Clin Microbioll985 ;21:211-6)测定新 鲜的白细胞减少的鼠 RBC(FRBC)或储藏的白细胞减少的鼠 RBC(SRBC)样品中脂多糖（LPS) 水平。
[0063] 储存的RBC组分的制备
[0064] 将FRBC或SRBC在4°C，以400g离心10min后获得上清液。为使得因洗涤导致的 溶血降至最低，用10倍体积的1. 5%氯化钠轻柔洗涤FRBC和SRBC，并于4°C下400g离心 10min。输血前，洗过的FRBC或SRBC重悬于新鲜的鼠血浆以获得最终70-75%的Hct。
[0065] 为氧化SRBC上清液中的亚铁Hb，将所述的上清液暴露于经由氧合器（Living Systems Instrumentation Inc.，St. Albans, Vermont)的、于氮气中的 800ppm 氧化氮气体 2 小时，以产生 metHb(Yu 等人，Circulation2008;117:1982-90)。将上清液（2ml)以 3L、 0· 9%盐水透析 3 次（Spectra/Por 分子多孔膜 MWC0:12-14, 000, Spectrum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez, CA)以减少低分子量的氧化氮代谢物。
[0066] 储存的鼠RBC中的生化，血液学和形态改变
[0067] 测定（ABL800FLEX, Radiometer, Westlake, OH) FRBC 和 SRBC 中的血气张力（PC02 和 P〇2)，pH,以及标准碱过剩（SBE)。FRBC和SRBC中的电介质浓度（钠，钾，|丐，氯化物，HC0 3-) 和乳酸盐也进行了测定（Critical Care Xpress, Nova Biomedical, Waltham, ΜΑ)。
[0068] 为确定上清液中的Hb水平，在4°C下，将FRBC或SRBC，以1700g离心8min，用 QuantiChromHb分析试剂盒（BioAssaySystems, Hayward, CA)测定上清液Hb水平。利用下述 标准公式计算溶血:溶血（％)=[上清液HbX (l-%Hct)]/总HbXlOO (参见Kamel 等人，Blood Transfus2010;8:260-6)。
[0069] 为研究储存对于RBC形态的影响，将FRBC或SRBC涂片并用Hema3手工染色系 统（Fisher Diagnostics, Middletown, VA)染色，利用配 Plan Fluor60x 干物镜的 Nikon EDIPSE80i 立式显微镜（Nikon Instruments Inc.，Melville, NY)获得图像。
[0070] 用 Hemox-分析仪（TCS Scientific Corp.，New Hope, PA)确定 FRBC 和 SRBC 的氧 解离曲线（〇DC)(向5ml含有20 μ 1添加剂-A(additive-A)和10 μ 1消泡剂的Hemox-溶 液中添加20 μ 1的RBC)。P50,定义为Hb为50%时的氧分压，由0DC计算。FRBC和SRBC中 的 2, 3-DPG 水平利用 2, 3-DPG 试剂盒（RocheDiagnostics, Mannheim, Germany)测定。
[0071] 测定鼠 RBC存活率
[0072] Gilson 等人（Gilson 等人，Transfusion2009 ;49:1546-53)报道的 GFP-标记的 RBC法，用于测定经输血的鼠 RBC存活率。简要地说，通过心脏穿刺由UBC-GFP和WT小鼠 收集血液到含CPDA-1的lml注射器中，制备含40%来自UBC-GFP小鼠的RBC和60%来 自WT小鼠的RBC的血液混合物，减少白细胞，离心，于4°C下储存〈24小时（FRBC)，和2周 (SRBC)。用含有GFP-标记的RBC的100 μ L FRBC或SRBC，通过尾静脉，向WT小鼠输血。 在输血10min，30min，1小时，24小时，和8天后，从后眼窝获取血样，收集到肝素化的玻 璃毛细管中。GFP-阳性RBC的百分比通过正向散射/侧向散射（FSC/SSC)在5Laser LSR Fortessa(BD Biosciences，San Jose，CA)上确定。在不同的获取天数通过Sphero彩虹突 光颗粒（Spherotech Inc.，Lake Forest, IL)将流式细胞仪校准到相同的设置。用输血24 小时后测定的GFP-阳性RBC的百分数除以0时刻GFP-阳性RBC的百分数，计算输血24小 时后的RBC存活率（％)。根据第10分钟，第30分钟和1小时的数据，由线性回归外推0 时刻的荧光。
[0073] 输血2小时后的生化分析
[0074] FRBC或SRBC输血后，在第2小时腹膜内注射戊巴比妥（200mg/kg)。通过心脏穿 刺由每只小鼠收集约lml血液到肝素化的注射器中，在4°C下，4000rpm离心8分钟。获得 肝素化的血浆，以进行血液化学、白介素-6 (IL-6)、触珠蛋白（Hp)，和血红素结合蛋白（Hx) 水平的测定。获取血清以测定铁水平。肝脏样品在液氮中速冻，用于接下来确定血红素加 氧酶-1 (H0-1)。
[0075] 为比较FRBC或SRBC输血的急性生化影响，在输血后10分钟，腹膜内注射戊巴比 妥（200mg/kg)，将12只WT和12只db/db小鼠处死。通过心脏穿刺获得全血，以进行血液 化学测定。
[0076] 血清铁水平测定
[0077] 利 用 Iron/Unsaturated Iron Binding Capacity Assay (Thermo Fisher Scientific, Middletown, VA)确定血清铁水平。
[0078] 血浆IL-6, Hp,和Hx水平的测定
[0079] 利用 Duoset 小鼠 IL_6Elisa 试剂盒（R&D Systems, Minneapolis, MN)确定血 楽 IL-6 水平。分别利用小鼠 Hp 和 Hx Elisa 试剂盒（Life Diagnostics, Inc.，West Chester, PA)测定血楽Hp和Hx水平。
[0080] 组织mRNA水平的定量
[0081] 利用 Trizol 试剂（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)从鼠肝脏提取 总 mRNA。通过反转录酶反应（MMLV-RT, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)合 成 cDNA。转录物的实时扩增，以 SYBR 法利用 Eppendorf Mastercycler Realplex(Eppendo rf, Hamburg, Germany)进行。祀转录物的相对表达归一化至18S rRNA的水平，并利用相对 CT方法进行分析。
[0082] FRBC或SBRC输血后在清醒的WT，给予HFD的WT，和db/db小鼠中进行非侵入性 血压测定
[0083] FRBC, SRBC，洗过的FRBC和SRBC，来自FRBC和SRBC的上清液，和经氧化 的来自SRBC的上清液，经尾静脉输入（transfused)到（总输入体积是预估血容量 的10 % ) WT，给予HFD的WT，或db/db小鼠。利用非侵入性血压系统（XBP1000, Kent Scientific，Torrington，CT) (Yu 等人，Circulation2008;117:1982-90 ;Yu 等 人，Anesthesiology2010 ;112:586-94)测定收缩压。全部的尾静脉注射在1分多钟（over one minute)的时间内进行。一组db/db小鼠接受了 SRBC，并且从输血前10分钟到输血后2 小时，利用Yu等人，Circulation2008 ;117:1982-90中所描述的方法，呼吸空气中的80ppm 氧化氮（Medical-Technical Gases, Inc.，Medford, ΜΑ)。
[0084] 在经麻醉的小鼠中侵入性的血流动力测定
[0085] 侵入性的血流动力测定，如Yu等人，Anesthesiology2010 ;112:586_94所描述的 进行。在基线，和用FRBC，SRBC，来自FRBC的上清液，或来自SRBC的上清液输血5分钟（预 估血容量的10%，以75 μ L/min的速度在3分多钟（over3min)的时间内通过置于右颈静 脉中的单独的导管输入）后测定左心室压力-容积环和心输出量（C0)以及平均动脉血压 (MAP)。
[0086] 统计分析
[0087] 所有的数值以平均值土SEM表示。数据通过带有Tukey修正的单向 AN0VA(SigmaStat3.0.1;Systat Software，Inc.，San Jose，CA)进行分析。在清醒的小鼠 中的收缩压测定通过重复测定带有相互作用的双向AN0VA进行分析。概率值低于0. 05被 认定为显著。
[0088] 储存的鼠血液的表征
[0089] 储存彡24小时的FRBC与储存2周的SRBC进行比较。在SRBC中，pH, P02, HCCV， 和SBE显著降低，然而，SRBC中的PC02，和乳酸盐比FRBC中的高（表1)。此外，SRBC中的 钠水平较FRBC中的低，而SRBC中的钾水平比FRBC中的高。SRBC中的溶血水平显著高于 FRBC中的溶血水平。类似地，SRBC中的上清液Hb水平比FRBC中的高。在FRBC和SRBC的 上清液中测定的MetHb水平不到上清液Hb的1 %。
[0090] 表1. FRBC (彡24h)和SRBC (2周）中的血液化学比较
[0091]

【权利要求】
1. 处理红细胞样品的方法，所述方法包括使红细胞样品活体外与足以使得红细胞样品 中存在的至少部分胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮 的化合物接触。
2. 权利要求1的方法，其中，所述的红细胞样品在与氧化氮或释放氧化氮的化合物接 触前，已活体外经历过血液透析，术中血液抢救，或心切开吸引术。
3. 权利要求1的方法，其中，所述的红细胞样品在与氧化氮或释放氧化氮的化合物接 触前，已活体外经历过一种或以上的泵、膜或气泡。
4. 权利要求1的方法，其中，从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触 前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少24小时。
5. 权利要求1的方法，其中，从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触 前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少7天。
6. 权利要求1的方法，其中，从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触 前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少14天。
7. 权利要求1的方法，其中，从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触 前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少28天。
8. 权利要求1的方法，其中，从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触 前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少42天。
9. 前述任一项权利要求的方法，其中所述红细胞样品中的至少20 %的胞外亚铁血红 蛋白转化成高铁血红蛋白。
10. 前述任一项权利要求的方法，其中所述红细胞样品中的至少50%的胞外亚铁血红 蛋白转化成高铁血红蛋白。
11. 前述任一项权利要求的方法，其中所述红细胞样品中的至少80%的胞外亚铁血红 蛋白转化成高铁血红蛋白。
12. 前述任一项权利要求的方法，其中所述的红细胞样品与含气态氧化氮的治疗性气 体接触。
13. 权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度是至少20ppm。
14. 权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度是至少40ppm。
15. 权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度是至少80ppm。
16. 权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度在lOOppm到 800ppm的范围。
17. 权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度在40ppm到 200ppm的范围。
18. 权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度在40ppm到 3, OOOppm的范围。
19. 权利要求12到18任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与所述的治疗性气体 接触不到5秒。
20. 权利要求12到18任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与所述的治疗性气体 接触至少15分钟。
21. 权利要求12到18任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与所述的治疗性气体 接触至少1小时。
22. 权利要求12到18任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与所述的治疗性气体 接触至少2小时。
23. 权利要求1到11任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与释放氧化氮的化合 物接触。
24. 权利要求23的方法，其中所述的释放氧化氮的化合物包括亚硝酸盐。
25. 权利要求23的方法，其中所述的释放氧化氮的化合物是超短作用的释放氧化氮的 化合物。
26. 权利要求25的方法，其中所述的超短作用的释放氧化氮的化合物是1-[2-(羧基） 吡咯烷-1-基]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物（diolate)或（Z)-1-[N-甲基-N-[6-(N-甲 基铵基己基）氨基]]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物。
27. 前述任一项权利要求的方法，其中所述方法在无菌条件下进行。
28. 防止或降低施用红细胞后哺乳动物中的血管收缩的方法，所述方法包括给哺乳动 物施用，已活体外与足以使得红细胞样品中存在的至少部分胞外亚铁血红蛋白转化成高铁 血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮的化合物接触的红细胞样品。
29. 权利要求28的方法，其中所述的红细胞样品包含自体红细胞。
30. 权利要求28的方法，其中所述的红细胞样品包含同种异型的红细胞。
31. 权利要求28到30任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品在用氧化氮或释放氧 化氮的化合物处理之前经冻融。
32. 权利要求28到31任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与作为顺序输注系统 的一部分的氧化氮接触，其中所述的红细胞样品从含有所述红细胞样品的容器流出，和连 接着氧化氮源的透气材料接触，使红细胞样品暴露于氧化氮，并在暴露于氧化氮之后递送 至所述哺乳动物。
33. 权利要求32的方法，其中所述的氧化氮源是含压缩氧化氮气体的罐。
34. 权利要求32的方法，其中所述的氧化氮是电动氧化氮发生器。
35. 前述任一项权利要求的方法，其中所述的哺乳动物是人。
【文档编号】A61K35/18GK104159591SQ201280066237
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年11月6日 优先权日:2011年11月7日
【发明者】W.M.扎波尔, B.于 申请人:通用医疗公司