对蛋白酶体抑制剂的反应的生物标记的制作方法
【专利摘要】本文揭示与对蛋白酶体抑制剂治疗的敏感性相关的标记。在肿瘤细胞中的RAS基因是野生型时观察到敏感性。本文进一步提供组合物和方法评价标记基因的标记以预测使用蛋白酶体抑制剂治疗患有实体肿瘤(例如肺肿瘤或结肠肿瘤)的患者的结果。
【专利说明】对蛋白酶体抑制剂的反应的生物标记
[0001]相关申请案
[0002]本申请案主张对2011年11月11日申请的美国临时专利申请案第61/558，474号和2012年11月2日申请的美国临时专利申请案第61/721，818号的优先权。前述申请案的全部内容是以引用方式并入本文中。
[0003]序列表
[0004]本申请案含有与本文一起以电子可读格式提交的序列表。电子序列表文件是在2012 年 11 月 8 日创建，名为“sequencelisting.txt”且大小为 26.4kb (27，099 字节)。电子sequence listing, txt文件中的序列表的全部内容是通过这种引用方式并入本文中。
【背景技术】
[0005]在细胞的基因型或表型以出现不受正常组织环境限制的不受控生长的方式改变时，所述细胞变为癌细胞。一或多种基因突变、扩增、缺失、过表达或过低表达。染色体部分可丢失或从一个位置移动到另一个位置。一些癌症具有借之改变基因型或表型的特征模式。
[0006]多种基因具有与癌症相关的突变。一些基因具有多个可发生突变的位点。多种癌症在一个以上基因中具有突变和/或具有一或多个基因的错义表达。基因突变可促进肿瘤进展、肿瘤生长速率或肿瘤是否将转移。一些突变可影响肿瘤细胞是否将对疗法有反应。
[0007]多种药剂可治疗 癌症。血液和骨髓癌症通常是用类固醇/糖皮质激素、酰亚胺、蛋白酶体抑制剂和烷化剂来治疗。其它组织的癌症通常是用烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂、微管抑制剂、血管发生抑制剂或其它药剂来治疗。一些患者对一种疗法的反应优于另一疗法，表明患者可能遵循多种治疗途径来实现有效治疗。遵循最终证实对患者无效的疗法可能会使所述患者丧失在治疗计划早期的宝贵时间。许多患者无法承受治疗方案中的试错选择的时间。合宜且准确的治疗决策可有效管理疾病。
【发明内容】
[0008]本发明涉及通过测量本文所提供标记的至少一个特征对实体肿瘤的治疗进行预后和计划。标记是在来自人类癌细胞异种移植物的实体肿瘤样品中通过将其特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)与宿主动物使用蛋白酶体抑制疗法的后续治疗的结果相关联来鉴别。标记预测在用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗患者后是否将得到有利结果(例如，良好反应和/或长进展时间和/或长期存活)。包含肿瘤细胞以确定遗传标记的存在、数量或变化的测试样品鉴别预期对用(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)治疗会具有有利结果且其疾病可通过标准治疗或较不积极的治疗来管理的具体患者，以及那些预期对所述治疗具有不利结果且可能需要蛋白酶体抑制剂的替代性治疗、使用所述蛋白酶体抑制剂的治疗组合和/或更积极治疗以确保有利结果和/或顺利管理疾病的患者。
[0009]在一个方面中，本发明提供可用于确定标记特征(例如数量、存在或变化)的试剂盒。在另一个方面中，本发明提供用于确定预后和治疗或疾病管理策略的方法。在这些方面中，测量包含肿瘤细胞的样品中标记的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)。在一个实施例中，肿瘤是实体肿瘤，例如非血液肿瘤，例如非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌。
[0010]在各个实施例中，测量本文中阐述的特征，例如对应于具有一或多个突变(例如体细胞突变)的标记基因的标记DNA的大小、序列、组成、活性或数量；标记RNA的大小、序列、组成或数量和/或标记蛋白质的大小、序列、组成、活性或数量。形成预后或治疗或疾病管理策略的有用信息是在分析揭露关于标记基因的信息(例如基因是否突变，突变的身份和/或突变基因的RNA或蛋白质数量是否指示过表达或过低表达)时获得。在一个实施例中，确定用于蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸，例如硼替佐米(bortezomib，VELCADEOi )或柠檬酸伊克昔佐米(ixazomib citrate, MLN9708))疗法的策略。
[0011]可用于测试以供确定非血液肿瘤(即实体肿瘤)预后或治疗或疾病管理策略(例如使用蛋白酶体抑制剂)的标记基因是v-K1-ras2克斯坦(Kirsten)大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)。标记基因包括突变或改变，所述突变或改变在标记DNA中的存在或其对(例如)标记RNA和/或蛋白质特征(例如，数量、大小、序列、活性或组成)的效应可提供用于确定预后或治疗或疾病管理的信息。在一些实施例中，可用作标记基因的基因或其突变体或修饰形式与(例如)包含肿瘤细胞的样品中不同于正常DNA、RNA和/或蛋白质的一或多个标记(例如DNA、RNA和/或蛋白质)的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)相关。本文中阐述此基因(称作“标记基因”)的修饰的实例，其突变可提供所述信息。
[0012]在一些实施例中，可用于测试以供确定非血液肿瘤(即实体肿瘤)的预后或治疗或疾病管理策略(例如使用蛋白 酶体抑制剂)的标记基因是葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)。
[0013]本发明标记基因的突变可提供关于在用(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗后的结果的信息。通过检查肿瘤中一或多个经鉴别标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，可能确定预期哪一种治疗剂、药剂组合、投药和/或投与方案可在治疗后提供有利结果。通过检查癌症中一或多种经鉴别标记或标记组的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，也可能确定预期哪一种治疗剂、药剂组合、投药和/或投与方案不太可能在治疗后提供有利结果。通过检查一或多种经鉴别标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，由此可能消除无效或不适当的治疗剂或方案。重要的是，可基于不同患者作出这些确定。因此，可确定具体治疗方案是否可能有益于具体患者或具体患者类型和/或是否应开始或避免、继续、中断或改变具体方案。
[0014]本发明涉及鉴别和/或选择预期在投与治疗方案(例如包含蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗的治疗方案)后显示有利结果的癌症患者的方法。另外提供鉴别预期在投与所述治疗方案后具有不利结果的患者的方法。这些方法通常包括测量、确定、接收、储存或传送关于患者肿瘤中(例如，患者癌细胞、例如非血液癌细胞(例如实体肿瘤细胞)中)一或多个标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)或标记基因的突变的信息，任选地将其与参考标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)作比较；且在另一实施例中，包括鉴别或建议来自样品的结果是否对应于治疗方案(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案)的有利结果。
[0015]另外提供的方法包括治疗方法，其进一步包括相应地开始(beginning)、继续或开始(co_encing)疗法的步骤,其中标记基因中突变的存在或患者标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示预期患者对疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案)显示有利结果。另外，所述方法包括治疗方法，其进一步包括相应地停止、中断、改变或中止疗法的步骤，其中标记基因中突变的存在或患者标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示预期患者与(例如)接受相同治疗方案的鉴别为具有有利结果的患者相比，对治疗(例如使用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮))方案显示不利结果。在另一个方面中，提供用于分析尚未经疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮))治疗的患者和基于本文所述标记基因中突变的存在或一或多种患者标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)鉴别并预测治疗结果的方法。所述方法可包括未经疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法)治疗，经疗法(例如蛋白酶体抑制剂)治疗，经肽基硼酸或肽基环氧酮疗法与一或多种其它疗法的组合治疗，经蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法的替代性疗法治疗，或经疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮抑制剂))的更积极的投药和/或投与方案(例如与鉴 别为对标准蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法具有有利结果的患者的投药和/或投与方案相比)治疗。因此，本发明提供的方法可消除疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案)的无效或不适当的使用。
[0016]其它方法包括用于确定药剂的活性、药剂的效能或鉴别新治疗剂或组合的方法。所述方法包括用于基于药剂影响本发明标记基因中的突变的存在或标记的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)的能力来鉴别可用作(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)用于治疗癌症(例如非血液癌症，即实体肿瘤癌症(例如，非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌))的药剂的方法。在一些实施例中，以指示癌症患者的有利结果的方式减少或增加所提供标记基因中突变的存在或标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量，即，在细胞群中，所述抑制剂分别选择抵抗包含突变特征的细胞或选择支持包含突变或特征的细胞)的抑制剂会是癌症的候选药剂。在另一实施例中，能降低包含指示不利结果的标记的肿瘤细胞的活力的药剂会是癌症的候选药剂。
[0017]本发明还涉及用治疗方案(例如单独的或与另一药剂组合的蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案，所述另一药剂是例如化学治疗剂，例如糖皮质激素剂、微管抑制剂、烷化剂、激酶抑制剂或拓扑异构酶抑制剂)治疗癌症患者的方法，所述方法包括以下步骤:选择其标记特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示预期患者对所述治疗方案具有有利结果的所述患者用于治疗，和用所述疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)疗法)治疗所述患者。在一些实施例中，所述方法可包括以下步骤:选择其标记特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示预期患者具有有利结果的患者，和投与除了蛋白酶体抑制剂疗法以外的显示与所述蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)疗法类似的预期无进展存活时间的疗法。
[0018]治疗癌症患者的其它方法包括选择在用癌症疗法(例如，蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法)治疗后不可能经历有利结果的患者。所述方法可进一步包括以下步骤中的一或多者:与鉴别为对标准疗法具有有利结果的患者的剂量或投药时间表相比，投与较高剂量或增加投药时间表的疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮))；投与除了蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法以外的癌症疗法；投与蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮药剂)与另一药剂(例如化学治疗剂，例如糖皮质激素剂、微管抑制剂、烷化剂、激酶抑制剂或拓扑异构酶抑制剂)的组合。另外提供用于选择患有侵袭性疾病的患者，预期其显示更快进展时间或短期存活。
[0019]其它方法包括用于通过考察指示癌症疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案)的结果的患者标记的数量和对是否应进行支付作出决定或建议来评估是否治疗癌症(例如非血液癌症，即实体肿瘤癌症(例如，非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌))或支付其治疗的方法。
[0020]本文所提到的所有出版物、专利申请案、专利和其它参考文献的全部内容都是以引用方式并入。
[0021]将从下文详细说明、图式和权利要求书中了解本发明的其它特征和优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1.KRAS的突变状态与肿瘤异种移植物对MLN2238的敏感性的关联。
[0023]图2.MLN2238在代表性异种移植物中与媒剂对照相比的抗肿瘤活性。A.PHTX132LU原代NSCLC异种移植物(野生型KRAS)，B.HCT-116异种移植物(突变体KRAS)。
[0024]图3.MLN2238在同 基因SW48细胞系的异种移植物中的抗肿瘤活性。A.SW48异种移植物(野生型KRAS)，B.SW48-KrasG13D异种移植物(重组突变KRAS-G13D)，C.SW48-KrasG12V异种移植物(重组突变KRAS-G12V)。
[0025]图4.来自KRAS野生型和突变体细胞的GLUT4蛋白质的西方墨点法(Westernblot)。图4A，在活体外生长的细胞中的GLUT4水平；图4B，在肿瘤异种移植物中的GLUT4水平。
【具体实施方式】
[0026]疗法在癌症患者中的一个持续不断的问题是对疗法的反应的个体差异。尽管成功癌症疗法的研发不断向前进展，但只有一亚组的患者对任何具体疗法都有反应。由于多种可用癌症疗法的治疗指数和毒性潜能狭窄，所述差异性反应可能会使患者经历不必要的、无效的且甚至可能有害的治疗方案。如果所设计疗法可经优化以治疗个别患者，那么可减少或甚至消除所述状况。此外，定向设计的疗法可提供更集中的总体上成功的患者疗法。因此，业内需要鉴别预期在投与具体癌症疗法时会具有有利结果的具体癌症患者，以及使用更积极的和/或替代性癌症疗法(例如先前投与患者的癌症疗法的替代性疗法)可具有有利结果的具体癌症患者。因此，提供对将受益于具体癌症抑制疗法的癌症患者(例如包括非血液癌症患者，例如患有实体肿瘤(例如，非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌)的患者)以及将受益于更积极的和/或替代性癌症抑制疗法(例如患者已接受的癌症疗法的替代性疗法)的癌症患者的诊断、分期、预后和监测会是有益的，由此获得适当预防性措施。
[0027]本发明部分基于以下认识:标记基因的突变可能与包含突变基因的细胞对蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)的敏感性相关。在一些实施例中，大鼠肉瘤(RAS)信号传导路径中涉及标记基因，例如其突变使得能活化所述路径的基因。RAS是致癌GTP酶，其结合GTP的活性状态活化肿瘤发生中涉及的路径(例如，促细胞分裂原活化蛋白(MAP)激酶级联)。蛋白质(包括肿瘤抑制因子)促进RAS结合的GTP水解为GDP以使RAS失活，并由此限制从RAS癌基因信号传导。此检查点中涉及的基因中(在RAS上游的癌基因(例如，p210BCR-ABL或erbB)中，在RAS癌基因(例如，HRAS、KRAS或NRAS)中，在RAS相关肿瘤抑制因子(神经纤维瘤I (NFl))中，和/或在GTP酶活化蛋白(例如，RASGAP)中)的突变可使得能活化RAS信号传导路径。对蛋白酶体抑制剂的敏感性的标记基因编码的蛋白质可为RAS蛋白质。KRAS是标记基因的实例。在RAS蛋白质(例如NRAS、HRAS和KRAS)的结合GTP的状态中，发生RAS信号传导，且在结合GDP的状态中，取消信号传导。突变RAS蛋白质可延长其处于结合GTP的状态的时间，且所得信号传导路径活化可导致具有突变基因的细胞增殖。标记基因可展现一或多个突变(例如体细胞突变)，其存在可影响所编码基因产物的表达或活性。在一些实施例中，可在肿瘤细胞或肿瘤的标记基因中存在一个以上突变。在其它实施例中，可在一或多个其它基因中具有突变(包括可导致肿瘤发生的突变)的细胞中存在标记基因突变，但其它突变基因可并非本文所认为的标记基因。在一些实施例中，突变是活化性突变。在其它实施例中，突变影响标记基因的表达。在其它实施例中，突变可改变所编码基因产物与细胞结合配偶体的相互作用。
[0028]在一个方面中，本发明提供用于确定是否用蛋白酶体抑制剂治疗患有选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成 的群组的实体肿瘤的患者的方法，所述方法包含以下步骤:a)测量包含肿瘤细胞的患者样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征，其中一个标记基因是V-K1-ras2克斯坦大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS) ；b)鉴别步骤a)中测量的所述至少一个特征是否提供关于用所述蛋白酶体抑制剂治疗的结果的信息；和c)如果信息性特征指示所述肿瘤细胞包含野生型KRAS，那么确定要用所述蛋白酶体抑制剂治疗所述患者。在一些实施例中，所述方法包含，如果信息性特征指示肿瘤细胞包含野生型KRAS或在密码子146处具有突变的KRAS，那么确定要用蛋白酶体抑制剂治疗患者。在一些实施例中，用于确定是否要用蛋白酶体抑制剂治疗的方法是在活体外执行。
[0029]在另一方面中，本发明提供用于确定是否要继续患者的实体肿瘤的蛋白酶体抑制剂治疗的方法，其包含:a)用蛋白酶体抑制剂治疗实体肿瘤患者；b)从所述患者获得包含肿瘤细胞的样品；c)测量所述样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征，其中至少一个标记基因是KRAS ；d)将c)中测量的结果与参考作比较；和e)如果所述比较指示所述样品中的所述实体肿瘤细胞包含野生型KRAS，那么确定要继续用所述蛋白酶体抑制剂治疗；其中所述患者患有选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组的实体肿瘤。在一些实施例中，所述方法包含，如果比较指示实体肿瘤细胞包含野生型KRAS或在密码子146处具有突变的KRAS，那么确定要继续用蛋白酶体抑制剂治疗患者。在一些实施例中，用于确定是否要继续用蛋白酶体抑制剂治疗的方法是在活体外执行。
[0030]在另一方面中，本发明提供试剂盒，其包含用于添加到包含肿瘤细胞的样品中的稳定剂和用于测量样品中至少一个标记的至少一个特征的试剂，其中所述测量的结果指示在至少一个标记基因中是否存在突变，其中至少一个标记基因是KRAS。
[0031]在另一方面中，本发明提供试剂盒，其包含至少两种用于测量样品中至少两个标记的至少一个特征的试剂，其中测量结果指示在至少一个标记基因中是否存在突变，其中至少一个标记基因是KRAS且其中所述样品包含实体肿瘤细胞，其中所述实体肿瘤细胞选自由肺肿瘤细胞和结肠肿瘤细胞组成的群组。
[0032]在另一方面中，本发明提供用于预测实体肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性的方法，其包含:a)评价所述细胞是否表达突变KRAS jPb)预测所述细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性，其中突变KRAS的表达预测对蛋白酶体抑制剂的敏感性不良，其中所述实体肿瘤细胞选自由肺肿瘤细胞和结肠肿瘤细胞组成的群组。在一个实施例中，突变KRAS不具有突变密码子146。
[0033]在另一方面中，本发明提供用于治疗患有包含野生型KRAS状态的实体肿瘤的患者的方法，其包含向所述患者投与治疗有效量的蛋白酶体抑制剂的步骤，其中所述实体肿瘤选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组。在一个实施例中，实体肿瘤包含野生型KRAS或具有突变密码子146的KRAS。
[0034]在另一方面中，本发明提供蛋白酶体抑制剂的用途，其用于制造用于治疗选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组的实体肿瘤的医药，其中所述实体肿瘤具有野生型KRAS。在一个实施例中，实体肿瘤具有野生型KRAS或具有突变密码子146的KRAS。
[0035]在另一方面中，本发明提供蛋白酶体抑制剂的用途，其用于治疗患者的肺肿瘤或结肠肿瘤，其肺肿瘤或结肠肿瘤具有野生型KRAS。在一个实施例中，肿瘤具有野生型KRAS或具有突变密码子146的KRAS。
[0036]在另一方面中，本发明提供用于鉴别适用于治疗非血液癌症患者的蛋白酶体抑制剂的方法，其包含:a)使 在至少一个标记基因中包含至少一个突变的异种移植物中的肿瘤细胞与测试蛋白酶体抑制剂接触，其中至少一个标记基因是KRAS ；b)评价所述测试蛋白酶体抑制剂对所述细胞的活力的效应；和c)如果所述测试蛋白酶体抑制剂降低所述细胞的活力，那么确定其适用于治疗非血液癌症患者。在一个实施例中，突变不在KRAS的密码子146 处。
[0037]在另一方面中，本发明提供用于支付使用蛋白酶体抑制剂的癌症治疗的方法，其包含:a)记录在来自患者的包含实体肿瘤细胞的样品中KRAS是否突变，其中所述患者患有肺癌或结肠癌，和b)如果KRAS是野生型，那么授权支付所述蛋白酶体抑制剂治疗。在一个实施例中，所述方法包含，如果KRAS是野生型或在密码子146处突变，那么授权支付。
[0038]鉴别将对蛋白酶体抑制剂治疗无反应的非血液癌症患者的方法，其包含确定在来自患者的包含肿瘤细胞的样品中至少一种KRAS突变的存在或不存在，其中所述患者患有选自由肺癌和结肠癌组成的群组的非血液癌症，其中至少一种KRAS突变的存在指示所述患者将对所述蛋白酶体抑制剂无反应。在一个实施例中，突变不在密码子146处。
[0039]在另一方面中，本发明提供鉴别将对蛋白酶体抑制剂治疗具有有利结果的非血液癌症患者的方法，其包含确定在来自患者的包含肿瘤细胞的样品中至少一种KRAS突变的存在或不存在，其中所述患者患有选自由肺癌和结肠癌组成的群组的非血液癌症，其中野生型KRAS或在密码子146中的突变的存在指示所述患者将对所述蛋白酶体抑制剂有反应。
[0040]在一些实施例中，突变是通过在肿瘤细胞中或在从所述肿瘤细胞制备的提取物中测量与KRAS标记基因相关的标记的特征来鉴别。在一些实施例中，所述方法包含确定肿瘤细胞KRAS序列。[0041]本发明的另一实施例是基于在其对蛋白酶体抑制剂的敏感性或抗性与RAS标记基因的突变状态相关的肿瘤细胞或肿瘤中鉴别另一标记基因(葡萄糖转运蛋白，例如GLUT4)。在一个实施例中，在肿瘤细胞或肿瘤中葡萄糖转运蛋白(例如GLUT4)的特征(例如组成、活性或数量，例如表达)可与KRAS标记基因的突变状态或特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)相关联。在一些实施例中，与对蛋白酶体抑制剂的敏感性相关的葡萄糖转运蛋白标记特征是数量。在一些实施例中，葡萄糖转运蛋白标记(例如mRNA或蛋白质)具有在其RAS标记基因具有突变状态的肿瘤细胞中低或正常表达的信息性特征数量，此指示在用蛋白酶体抑制剂治疗肿瘤后的有利结果。在一些实施例中，葡萄糖转运蛋白标记(例如mRNA或蛋白质)具有在具有野生型KRAS的表达的信息性特征的肿瘤细胞中低或正常表达的信息性特征。在一个实施例中，本发明方法包括鉴别KRAS突变状态和测量GLUT4的表达的步骤。在一些实施例中，预测其肿瘤(例如实体肿瘤)包含野生型KRAS和低或正常GLUT4表达的患者具有用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗的有利结果。在另一实施例中，预测其肿瘤(例如实体肿瘤)包含突变体KRAS和高的、高于正常的或高于参考水平的GLUT4表达的患者具有用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗的不利结果。
[0042]可使用标记基因中的突变或标记特征的鉴别和/或测量来确定是否可预期使用(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法的肿瘤 治疗的有利结果，或(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮抑制剂)的替代性疗法和/或使用所述蛋白酶体抑制剂的更积极的疗法是否可增强反应。举例来说，可使用本文提供的组合物和方法来确定是否预期患者对蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗剂投药或投与方案具有有利结果。基于所述鉴别，本发明提供(但不限于):1)用于确定蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案是否将有效实现有利结果和/或管理癌症的方法和组合物；2)用于监测蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法(单独的或呈药剂组合)以及投药和投与用于治疗肿瘤的有效性的方法和组合物；3)用于治疗肿瘤的包含(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮抑制)治疗方案的方法和组合物；4)用于鉴别有效治疗特定患者的肿瘤的特定治疗剂和治疗剂组合以及投药和投与方案的方法和组合物；和5)用于鉴别疾病管理策略的方法和组合物。
[0043]蛋白酶体抑制代表癌症治疗的重要策略。蛋白酶体是存于所有细胞中的多酶复合物，其在细胞周期调节中所涉及的蛋白质降解中发挥作用。举例来说，金(King)等人(科学(Science) 274:1652-1659(1996))证实，泛素-蛋白酶体路径在调节细胞周期、肿瘤生长和转移中具有必要作用。多种关键调节蛋白质(包括P53、细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶P21和p27KIP1)在细胞周期期间通过泛素-蛋白酶体路径暂时降解。细胞经细胞周期进展和进行有丝分裂需要这些蛋白质的有序降解。此外，转录调节需要泛素-蛋白酶体路径。保罗贝拉(Palombella)等人(国际专利申请公开案第W095/25533号)教示，转录因子NF-κΒ的活化受蛋白酶体介导的抑制剂蛋白IkB的降解的调节。继而，NF-K B在免疫和炎症反应中所涉及基因的调节中具有中心作用。举例来说，里德(Read)等人(免疫(Immunity) 2:493-506 (1995))证实，细胞粘附分子(例如E-选择蛋白、ICAM-1和VCAM-1)的表达需要泛素-蛋白酶体路径。其它发现进一步支持蛋白酶体抑制在癌症疗法中的作用，如泽特(Zetter)(癌生物学研究文辑(Seminars in Cancer B1logy) 4:219-229 (1993))发现，细胞粘附分子在活体内通过引导肿瘤细胞粘附并外渗到脉管系统和从所述脉管系统粘附并外渗到体内远端组织位点来参与肿瘤转移和血管发生。此外，贝格(Beg)和巴尔的摩(Baltimore)(科学274:782(1996))发现，NF-κ B是抗细胞凋亡因子，且抑制
NF-kB活化使细胞对环境胁迫和细胞毒性剂更敏感。硼替佐米(Vclcadc?)是业内首见的
(first-1n-class)肽基硼酸蛋白酶体抑制剂。
[0044]如本文所用术语“蛋白酶体”是指亚细胞复合物，其通过降解细胞不再需要的蛋白质或缺陷蛋白质来参与蛋白质内稳态，且其通过用泛素或泛素类蛋白质加标签来确定降解靶。蛋白酶体包含具有介导蛋白质降解的蛋白酶的核心复合物。
[0045]如本文所用术语“蛋白酶体抑制剂”是指在活体外或活体内直接抑制20S或26S蛋白酶体的酶活性的任何物质。蛋白酶体抑制剂、其药理学性质和在治疗疾病(包括肿瘤性疾病和炎症性疾病)中的用途综述于鲁格里(Ruggeri)等人(2009)药理学进展(Adv.Pharmacol.)57:91-135中。在一些实施例中，蛋白酶体抑制剂是肽基硼酸。适用于本发明方法中的肽基硼酸蛋白酶体抑制剂的实例揭示于以下文献中:阿当斯(Adams)等人，美国专利第 5,780,454(1998)号、第 6，066，730 (2000)号、第 6，083，903 (2000)号、第6，297，217 (2001)号、第 6，465，433 (2002)号、第 6，548，668 (2003)号、第 6，617，317 (2003)号和第6，747，150 (2004)号，所述每一文献是全文以引用方式并入本文中，包括其中所揭示的所有化合物和化学式。在一些实施例中，肽基硼酸蛋白酶体抑制剂选自由以下组成的群组:N(4吗啉)羰基-β -(1-萘基)_L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N(8喹啉)磺酰基-β -(1-萘基)_L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N(吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸和N(4吗啉)η羰基-[0-(2-吡啶基甲基)]-L-酪氨酸-L-亮氨酸硼酸。在一个实施例中，蛋白酶体抑制剂是N(吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸(硼替佐米；VE:LX.'ADE3iD;曾称为MLN341或PS-341)。在另一实施例中，蛋白酶体抑制剂揭示于美国专利第7，442，830号中，例如[(IR)-1 ({[(2，4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}_氨基)-3-甲基丁基]硼酸(MLN2238)或其硼酸酯，例如其柠檬酸酯，例如如PCT公开案第W02009154737号中所揭示(柠檬酸伊克昔佐米，MLN9708)。可经口投与的柠檬酸伊克昔佐米(例如MLN9708)在多种血液和实体肿瘤异种移植模型中具有抗肿瘤活性(库珀曼(Kupperman)等人(2010)癌症研究(Cancer Res.) 70:1970-1980)。MLN9708 是柠檬酸酯，其在暴露于水溶液或血浆后快速水解为活性形式MLN2238。在另一实施例中，肽硼酸揭示于美国专利第7，915，236号中，例如[(IR)-1-[ [ (2S, 3R) -3-羟基-2-[ (6-苯基-吡啶-2-羰基)氨基]-1-氧代-丁基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸(德兰佐米(delanzomib))。每一上述专利公开案的全部内容是以引用方式并入本文中。
[0046]肽基硼酸蛋白酶体抑制剂的其它实例揭示于弗莱明(Fleming)和李(Li)，国际专利公开案W02010/036357和W02011/123502中，两个专利都是全文以引用方式并入本文中，包括其中所揭示的所有化合物和化学式。
[0047]在一些实施例中，蛋白酶体抑制剂的特征在于式(I)化合物:
[0048]
【权利要求】
1.一种用于确定是否用蛋白酶体抑制剂治疗患有选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组的实体肿瘤的患者的方法，所述方法包含以下步骤: a)测量包含肿瘤细胞的患者样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征，其中至少一个标记基因是v-Ki_ras2克斯坦大鼠肉瘤病毒癌基因同系物KRAS ； b)鉴别步骤a)中测量的所述至少一个特征是否提供关于用所述蛋白酶体抑制剂治疗的结果的信息；和 c)如果所述信息性特征指示所述肿瘤细胞包含野生型KRAS，那么确定用所述蛋白酶体抑制剂治疗所述患者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个标记选自由对应于所述至少一个标记基因的核酸和蛋白质组成的群组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个特征选自由以下组成的群组:大小、序列、组成、活性和数量。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述实体肿瘤选自由非小细胞肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一个特征是序列。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一个标记是核酸。
7.根据权利要求6所 述的方法，其中所述核酸选自由以下组成的群组:DNA、mRNA和cDNA或前述中任一者的一部分，其中所述部分包含所述至少一个标记基因的至少一个突变位点。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核酸包含SEQID NO:2的选自由以下组成的群组的密码子:密码子12、密码子13和密码子61或其变体或其补体。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个标记是至少两个标记。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个标记基因是至少两个标记基因。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少两个标记基因包含至少KRAS和GLUT4。
12.根据权利要求11所述的方法，其中GLUT4的所述至少一个特征是数量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中GLUT4的所述数量正常或低。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含肿瘤渗出物。
15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包含针对肿瘤细胞富集所述样品。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含选自由非小细胞肺癌细胞和结肠癌细胞组成的群组的肿瘤细胞。
17.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自由肽基硼酸和肽基环氧酮组成的群组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽基硼酸选自由以下组成的群组:硼替佐米、柠檬酸伊克昔佐米和[(IR)-1-[ [ (2S, 3R)-3-羟基_2_[ (6-苯基-吡唳-2-羰基)氨基]-1-氧代-丁基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸。
19.一种用于确定患者是否要继续实体肿瘤的蛋白酶体抑制剂治疗的方法，其包含: a)用蛋白酶体抑制剂治疗实体肿瘤患者； b)从所述患者获得包含实体肿瘤细胞的样品；c)测量所述样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征，其中至少一个标记基因是KRAS ； d)比较c)中所述测量的结果与参考；和 e)如果所述比较指示所述样品中的所述实体肿瘤细胞包含野生型KRAS，那么确定继续用所述蛋白酶体抑制剂治疗； 其中所述患者患有选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组的实体肿瘤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一个标记选自由对应于所述标记基因的核酸和蛋白质组成的群组。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一个特征选自由以下组成的群组--大小、序列、组成、活性和数量。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述患者样品包含选自由非小细胞肺癌细胞和结肠癌细胞组成的群组的肿瘤细胞。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一个特征是序列。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一个标记是核酸。
25.根据权利要求 24所述的方法，其中所述核酸选自由以下组成的群组:DNA、mRNA和cDNA或前述中任一者的一部分，其中所述部分包含所述至少一个标记基因的至少一个突变位点。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述核酸包含SEQID NO: 2的选自由以下组成的群组的密码子:密码子12、密码子13和密码子61或其变体或其补体。
27.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一个标记是至少两个标记。
28.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一个标记基因是至少两个标记基因。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述至少两个标记基因包含至少KRAS和GLUT4。
30.根据权利要求29所述的方法，其中GLUT4的所述至少一个特征是数量。
31.根据权利要求30所述的方法，其中GLUT4的所述数量正常或低。
32.根据权利要求19所述的方法，其中所述样品包含肿瘤渗出物。
33.根据权利要求32所述的方法，其进一步包含针对肿瘤细胞富集所述样品的步骤。
34.根据权利要求16到33中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自由肽基硼酸和肽基环氧酮组成的群组。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述肽基硼酸选自由以下组成的群组:硼替佐米、柠檬酸伊克昔佐米和[(IR)-1-[ [ (2S, 3R)-3-羟基_2_[ (6-苯基-吡唳-2-羰基)氨基]-1-氧代-丁基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸。
36.一种试剂盒，其包含用于添加到包含肿瘤细胞的样品中的稳定剂和用于测量样品中至少一个标记的至少一个特征的试剂，其中所述测量的结果指示在至少一个标记基因中是否存在突变，其中至少一个标记基因是KRAS。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述至少一个标记是核酸。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述试剂是引物。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述引物与选自由以下组成的群组的核酸序列杂交:SEQ ID NO: 1、2、4、5、染色体Ip (碱基对115247085到115259515)上的序列、染色体12p(碱基对25358180到25403854)上的序列和上述中任一者的补体。
40.根据权利要求38所述的试剂盒，其进一步包含第二引物。
41.根据权利要求38所述的试剂盒，其进一步包含探针。
42.根据权利要求36到41中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述稳定剂是RNA稳定剂。
43.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述至少一个标记是蛋白质且所述试剂是抗体。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述抗体结合到GLUT4。
45.一种试剂盒，其包含至少两种用于测量样品中至少两个标记的至少一个特征的试剂，其中所述测量的结果指示在至少一个标记基因中是否存在突变，其中至少一个标记基因是KRAS且其中所述样品包含选自由肺肿瘤细胞和结肠肿瘤细胞组成的群组的实体肿瘤细胞。
46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中至少一个标记基因是至少两个标记基因。
47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述至少两个标记基因包含KRAS和GLUT4。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中至少一种试剂是至少两种试剂。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中至少两种试剂包含抗体。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述抗体结合到GLUT4。
51.根据权利要求45到50中任一权利要求所述的试剂盒，其进一步包含用于添加到所述样品中的稳定剂。
52.一种用于预测实体肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性的方法，其包含: a)评价所述细胞是否表达突变KRAS;和 b)预测所述细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性， 其中突变KRAS的表达预测对所述蛋白酶体抑制剂的敏感性不良，其中所述实体肿瘤细胞选自由肺肿瘤细胞和结肠肿瘤细胞组成的群组。
53.根据权利要求52所述的方法，其进一步包含评价GLUT4是否过表达，其中GLUT4的过表达预测对所述蛋白酶体抑制剂的敏感性不良。
54.一种用于治疗患有包含野生型KRAS状态的实体肿瘤的患者的方法，其包含向所述患者投与治疗有效量的蛋白酶体抑制剂的步骤，其中所述实体肿瘤选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自由肽基硼酸和肽基环氧酮组成的群组。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述肽基硼酸选自由以下组成的群组:硼替佐米、柠檬酸伊克昔佐米和[(IR)-1-[ [ (2S, 3R)-3-羟基_2_[ (6-苯基-吡唳-2-羰基)氨基]-1-氧代-丁基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸。
57.一种用于鉴别适用于治疗非血液癌症患者的蛋白酶体抑制剂的方法，其包含: a)使在至少一个标记基因中包含至少一个突变的异种移植物中的肿瘤细胞与测试蛋白酶体抑制剂接触，其中至少一个标记基因是KRAS ； b)评价所述测试蛋白酶体抑制剂对所述细胞的活力的效应；和 c)如果所述测试蛋白酶体抑制剂降低所述细胞的活力，那么确定所述测试蛋白酶体抑制剂适用于治疗非血液癌症患者。
58.根据权利要求57所述的方法，其中KRAS中的所述突变在SEQID NO: 2的选自由以下组成的群组的密码子中:密码子12、密码子13和密码子61。
59.根据权利要求57所述的方法，其进一步包含如果所述测试蛋白酶体抑制剂降低GLUT4的表达，那么确定所述测试蛋白酶体抑制剂适用于治疗非血液癌症患者的步骤。
60.一种用于支付使用蛋白酶体抑制剂的癌症治疗的方法，其包含: a)记录在来自患者的包含实体肿瘤细胞的样品中KRAS是否突变，其中所述患者患有肺癌或结肠癌，和 b)如果KRAS是野生型，那么授权支付所述蛋白酶体抑制剂治疗。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自由肽基硼酸和肽基环氧酮组成的群组。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述肽基硼酸选自由以下组成的群组:硼替佐米、柠檬酸伊克昔佐米和[(IR) _1_[ [ (2S, 3R) -3-羟基-2-[ (6-苯基-吡唳~2~羰基)氨基]-1-氧代-丁基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸。
63.一种鉴别将对蛋白酶体抑制剂治疗无反应的非血液癌症患者的方法，其包含确定在来自所述患者的包含肿瘤细胞的样品中存在或不存在至少一种KRAS突变，其中所述患者患有选自由肺癌和结肠癌组成的群组的非血液癌症，其中存在至少一种KRAS突变指示所述患者将对所述蛋白酶 体抑制剂无反应。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述至少一种KRAS突变是活化性突变。
65.根据权利要求63所述的方法，其中至少一种KRAS突变的存在或不存在是通过对怀疑包含所述突变的标记或标记的一部分测序来确定。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述标记或部分包含SEQID NO:2或其包含密码子12、密码子13或密码子61的部分。
67.根据权利要求63到66中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自由肽基硼酸和肽基环氧酮组成的群组。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述肽基硼酸选自由以下组成的群组:硼替佐米、柠檬酸伊克昔佐米和[(IR)-1-[ [ (2S, 3R)-3-羟基_2_[ (6-苯基-吡唳-2-羰基)氨基]-1-氧代-丁基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸。
69.一种鉴别将对蛋白酶体抑制剂治疗具有有利结果的非血液癌症患者的方法，其包含确定在来自所述患者的包含肿瘤细胞的样品中存在或不存在至少一种KRAS突变，其中所述患者患有选自由肺癌和结肠癌组成的群组的非血液癌症，其中存在野生型KRAS或密码子146中的突变指示所述患者将对所述蛋白酶体抑制剂有反应。
70.根据权利要求69所述的方法，其中至少一种KRAS突变的存在或不存在是通过对怀疑包含所述突变的标记或标记的一部分测序来确定。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述标记或部分包含SEQID NO:2或其包含密码子12、密码子13、密码子61或密码子146的部分。
72.根据权利要求69到71中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自由肽基硼酸和肽基环氧酮组成的群组。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述肽基硼酸选自由以下组成的群组:硼替佐米、梓檬酸伊克昔佐米和[(IR)_1_[[ (2S，3R)-3-羟基_2_[ (6-苯基-P比卩定-2-羰基)氨基]-1-氧代-丁基]氨基]- 3-甲基丁基]硼酸。
【文档编号】A61K31/69GK104039328SQ201280066221
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月11日
【发明者】阿里森·伯格, 尼比迪塔·查托帕蒂亚雅, 艾瑞克·M·凯尼格 申请人:米伦纽姆医药公司