疟疾疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供高度变异的PfEMP1形成玫瑰花结的抗原(rosetting?antigen)的抗原限制的亚类，其具有可以用于产生有效针对疟原虫、恶性疟原虫(Plasmodium?falciparum)的很多不同株和分离株的免疫应答的表位。在这方面,本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(PfEMP1)抗原或其一个或多个片段,其用于在人中产生免疫应答。
【专利说明】疟疾疫苗 发明领域
[0001] 本发明提供可以用于产生（raise)人中免疫应答的抗原。具体地，本发明提供产 生对多种恶性痕原虫（Plasmodium falciparum)株显示交叉反应性的免疫应答并且可以用 于治疗和/或预防疟疾并且尤其是重症疟疾的抗原。
[0002] 发明背景
[0003] 病原体抗原的序列多样性是开发针对很多传染性疾病的干预技术的障碍。由恶 性痕原虫（Plasmodium falciparum)引起的痕疾中，由var基因编码的不同表面抗原的 PfEMPl家族是在疟疾发病机制和临床疾病中发挥关键作用的粘附分子。PfEMPl是保护性 免疫的主要靶点，然而，由于PfEMPl家族内广泛的序列多样性，开发基于PfEMPl的药物 或疫苗是有困难的。
[0004] 每种恶性疟原虫分离株具有50-60种不同的PfEMPl变体，并且不同分离株的 PfEMPl组库大部分不重叠[3, 4, 5, 6]。PfEMPl变体以相互排斥的方式表达，并且从一种 var基因到另一种的转录转换导致恶性疟原虫感染的红细胞的抗原变异[7]。取自广泛的 全球寄生虫群体的样品的PfEMPl变体显示基本上无限制的序列多样性[5, 8]，使PfEMPl 成为非常具有挑战性的治疗靶点[9](还参见：Pierce SK，Miller LH.J Immunol2009; 182:5171-7)。
[0005] 如对高度多态的寄生虫抗原预期的，对天然感染后[10, 11]或用重组PfEMPl结构 域免疫后[11，12]出现的活的感染的红细胞上的针对PfEMPl的表面反应性抗体是主要变 体特异的。然而，居住在地方病区域的儿童在生命的前几年发展出防护威胁生命的疟疾的 抗体[13]，提示跨越株的抗体应答可能存在，或提示引起重症疟疾的寄生虫是限制的抗原 类型的[14, 15]。尚未鉴定出寄生虫表面抗原的诱导跨越株的抗体的抗原限制的亚类。
[0006] 除了在免疫和免疫逃避方面的作用之外，PfEMPl变体是介导与多种人细胞类型 和表面受体的相互作用的粘附蛋白[16, 17]。三个主要PfEMPl家族（A，B和C，基于保守的 上游序列和基因组位置）在其粘附功能方面不同[16]。类型B和C变体（每种单倍体寄生 虫基因组大约40-50种变体）结合于内皮蛋白并且清除受体⑶36[18, 19]。相比之下，类 型A变体（每种单倍体寄生虫基因组大约10种变体）不结合CD36[18, 19]但的确介导形 成玫瑰花结（rosetting) [11，12, 20, 21],其中感染的红细胞结合于未感染的红细胞的粘 附表型[22]。类型A var基因的转录与多种地理环境[23, 24, 25, 26]和实验室实验[27] 中的重症疟疾相关联，然而B和C var基因的转录在引起无并发症疾病的弱毒感染下发生 [23, 24, 25, 26]。
[0007] 形成玫瑰花结是重要的寄生虫毒力因子，与非洲儿童中威胁生命的疟疾 [28, 29, 30, 31，32]和灵长类动物疟疾模型中的高寄生虫负荷[33]相关。形成玫瑰花结 引起对微血管血流的病理性梗阻[34]和降低恶性疟原虫形成玫瑰花结赋予针对重症疟 疾的相当程度保护的能力的人红细胞多态性[35, 36]。恶性疟原虫形成玫瑰花结的寄生 虫可以被分为两种不同表型：来自正常人血清的结合IgM天然抗体（"非免疫"IgM)的 那些[37, 38]和不结合的那些。非免疫IgM结合被认为加强玫瑰花结中感染的和未感染 的红细胞间的粘附相互作用[37, 39, 40]并还可以通过掩盖关键表位在免疫逃避中发挥 作用[41]。之前对PfEMPl和形成玫瑰花结的研究集中于具有非IgM结合表型的寄生虫 [11，12, 20, 21，42]。尽管此表型临床上重要，但是因为来自临床患病儿童的形成玫瑰花结 的寄生虫主要为IgM结合型，所以至今忽略了结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的详细研 究[38]。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明基于高度变异的PfEMPl形成玫瑰花结的抗原的抗原限制亚类的发现。此 夕卜，发明人已发现尽管有相当程度的序列多样性，但是PfEMPl变体具有可以用于产生有 效针对疟原虫（恶性疟原虫）的很多不同株和分离株的免疫应答的表位。
[0010] 在第一个方面，本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1 (PfEMPl)抗 原或其一个或多个片段，其用于产生人中免疫应答。
[0011] 在第二个方面，本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1 (PfEMPl)抗 原或其一个或多个片段用于制备用于产生人中的免疫应答的药物的用途。
[0012] 在进一步的方面，本发明提供产生人中的免疫应答的方法，所述方法包括向人受 试者施用免疫原性量的一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1 (PfEMPl)抗原或其一个或 多个片段的步骤。
[0013] 在一个实施方案中，在人受试者中产生的免疫应答包括系统性抗体应答，包括一 种或多种抗体同种型。通过举例的方式，人中产生的免疫应答可以包括IgM, IgG，IgA, IgD 和/或IgE抗体同种型。
[0014] 有利地，本文描述的免疫应答是交叉反应性的；也就是说，所述免疫应答包含不 仅对被本发明使用的特定PfEMPl抗原，而且对其它PfEMPl变体显示一定程度的亲和力， 选择性和/或特异性的抗体。考虑到PfEMPl抗原间的序列同一性/同源性的类似的缺乏， 从PfEMPl抗原的仅有限选择中产生交叉反应性抗体应答的能力是既有利，也另人惊讶的。
[0015] 本文描述的免疫应答可以进一步助于缓解，减少和/或消除疟疾/重症疟疾的症 状。此外或备选地，人受试者中产生的免疫应答可以减少寄生虫（疟原虫属）负荷和/或 从宿主中清除或消除寄生虫。技术人员将理解此种类型的免疫应答可以被称为"保护性免 疫应答"。
[0016] 因此，本文描述的抗原，用途和/或方法可以用于产生人宿主中交叉反应性和/ 或保护性抗体，所述抗体对恶性疟原虫的PfEMPl抗原显示一定程度的亲和力，选择性和 /或特异性。
[0017] 在一个实施方案中，被本发明使用的PfEMPl抗原是IgM形成玫瑰花结的变体。本 领域技术人员将理解IgM形成玫瑰花结的PfEMPl变体特征在于其结合来自人血清的IgM 抗体的能力。因此，在更进一步的实施方案中，本发明提供PfEMPlIgM形成玫瑰花结的变 体（或其一个或多个片段），其用于提高人免疫应答；PfEMPlIgM形成玫瑰花结的变体（或 其一个或多个片段）用于制备用于产生人中的免疫应答的药物的用途；和产生人中的免疫 应答的方法，所述方法包括向人受试者施用免疫原性量的一种或多种PfEMPlIgM形成玫瑰 花结的变体或其一个或多个片段的步骤。
[0018] 在一个实施方案中，本发明的PfEMPl抗原表示特定的PfEMPl变体。在这方面， 发明人发现命名为HB3var6, TM284varl和ITvar60的（IgM形成玫瑰花结的）PfEMPl变体 包含能够诱导保护性和/或交叉反应性免疫应答的表位。
[0019] 因此，本发明的一个实施方案提供一种或多种PfEMPl抗原或其一个或多个片段， 其用于产生人受试者中的免疫应答，其中所述PfEMPl抗原选自由以下组成的组：
[0020] (i) HB3var6
[0021] (ii)TM284varl ;和
[0022] (iii) ITvar60。
[0023] 此外，应该理解本发明中描述的各种药物和方法还可以使用如以上（i)-(iii)列 出的特定PfEMPl变体（或其一个或多个片段）。
[0024] 技术人员将理解HB3var6PfEMP1抗原可以获自恶性疟原虫株HB3。类似地， TM284varlPfEMPl抗原和ITvar60PfEMPl抗原可以分别获自恶性疟原虫株TM284和IT/ PAR+。
[0025] 命名为HB3var6的PfEMPl变体具有以下氨基酸序列：
[0026] SEQ ID NO ： 1
[0027] MGNTIPKPPDPIYINESYQSTRNVLERYAESIKQQAAADAEKCEKSLKGDLTKAEFRGAHIETVGVQKY SYSNPCGLNHT
[0028] WNTNLLHDRVKDRDPCHGRNQKRFDEGQVYECGSGIIKGNGNNRNGGSYAPPRRRHICDKNLEALTVQN TKNSNDLLGNI
[0029] LVTAKYEGESIVNSYANSGMFNVCTALARSFADI⑶IVRGKDLYSGNKQEKEKRKQLEKNLQKIFRNIY DKLLEYNKTNG
[0030] EIEARYGSDKENFFQLREDWWKANRDQVWRAITCKAPQDANYFRKIS⑶TKVFTSQGQCGHSETNVPTN LDYVPQFLRWF
[0031] DEWAEEFCRVREHKLKKIKEACRGKNDEKDCSREGYDCNKTNLRLNEIFMDLECPNCEKACTSYKEWIE NKQKEFNKQKK
[0032] KYEKEIENDESNSHSTYDNELYNNLKRNYPSFENFVETLKEGAYCTNGIIEGKIDFNKQYDTFSHSQYC KSCPILGAKCK
[0033] NGQCNSFNDINCTKIPTMTNIRIHSTESPKDIYILVNDKKNREHSLELKDAFNDCDIFKRIRKQKWYCK YKCNLDVCELK
[0034] NFNRDMDDERLISIEVLIKRWLKYFLNDYNQIKENLNQCINNGTNTLCINDCHKNCECIEKWIKEKEKE WKVIKDRYVEQ
[0035] YNNNDKDVSSKLKTFLKQDLFTNYVKNALDPDETLDKMKESSVCNVPNKLNGTSCKKKDVINILLNRLN EKIDPCKNQHK
[0036] ATKGKECCDKLPKIAD⑶TSDDEDDDEEDVSVTSGEKQNVKQDCAGKKSDEVCEMVKKLI⑶NNGMSGR IESCNPKTGTY
[0037] PPWKNHASLVEDNRTWMPPRRQKLCVSALTQEGKIKNKEDIRKHFITCAAIETHFAWHRYKNHNANAES KLKTGKIPDDF
[0038] LRSMKYTFGDYRDIFFGTDISSCDKIKNASNTIKSILENKTKKKKGDKLIEDNEKHKEWWNEHGKEIWE GMLCALEKVGG
[0039] SVNIKSTYNYDTIKNDLEDFASPPQFLRWFTEWSDEFCQERKKLEAKVKEYCKKDYVGCNKQNTKANNS CVSACEAFQHY
[0040] MKSKMSEYDTQKKKFEAEKSGKEPEYEGFSTKDASEYLKEKCLHGTCDCMEKVKNIDDYWKNPHKTYDD NKLETKCECPQ
[0041] TPPKPCEIVKTLLEDNNGRHVDACNLKYEGKKEKHYSWNCNPNKFKNGEEGACIPPRRQKLYIYNLEKF TGGTSEIELRK
[0042] AFIECAAIETFFSWHKFKKDKEREDKEKQDLVGYTSTVDEKHQKDLQSGKIPEEFKRQMFYTFGDYRDI CLGNDMGNDNY
[0043] NKNISTKVRSILNSGETPEEWWQKHGPQIWEGMLCALSYDTEKQKKVQDVHNNLIAPPNNNKYNDVKLV SKSGKLHTSLS
[0044] DFATVPQFLRWFEEWVEEFCRKKKIKIDKIEDECRGEYDNGGKKYCS⑶GYDCDKRYLSHNKMFADLNC LGCEKECRNYK
[0045] KWIEEKVEEFYKQKKKYEKGFENTRTNLDBKYVKEFYETSAGKYKSVDLFLDTLKERSHCSMGMVNRKI DFKNPLETFSP
[0046] SIYCKTCPLYGVNCNSRECVDITENEFKKKNVLDEIIINDKSHTSIDIEMIDRRGQYMQENLDNPLFKE SYLLKSVRDQK
[0047] WDCNFIHNKIDLCEINKFNENIDTDESITFKVLIERWLQDFLEGYYISKKQIDLFTKKEENKCECVKKW AEKKEGEWEKI
[0048] NEHFNKQKHDDAFDMDFKVKNYFEKNASDLKDWIDNFKRLNNIDDYQVCNVHNNCKSADKKNKIDMVSI LLSELKKEIET
[0049] CKNQGNEKTKIKCDASPTNDELDEEYELGTTDTSPSAAPDICKDVIQSKSEETICRDDKRVDCNKVGKD DPIKVPMDPKS
[0050] GEDHLKNMGDKHNCSGIIIKTNGEWKNTKQLNYPNPCESIYASPRRQKFCVHELDKAKNQKELRTKLLT VAANQGYNLAI
[0051] KHHEYKDKYTVNPCNALKYSFYDYQHIILGDDPMEPEKWDTESALKRIFGNRNTEDAKPLSRKRKDFWK ENKECVWSAMK
[0052] CGYNEGIKKGNKSNNIPECKDSIPTQFDGVPQFLMWFTEWSEDFCNHKKTHLKKLEQGCRGCTLRIDGT CEKDGSGCQKC
[0053] SQACEEYKAWLQNWKDQYKKQSKKYS⑶KKKELYKTVPKVKNSTHAYEYLQTQLEKLCEKGKCDYTCMK NPSTENSTENM
[0054] PESLDVKPDIVKDKCPCPPQKIEKPDSTLNCIDRSAFELYAKAKSDLHGVKDKLKGNNTKNIYEETTNG KNDDNIICKIN
[0055] ESISKQNNVCKKNENLFDDIDKWDCKKRTNTVPIENICIPPRRKLMCAYPLKNLGVKKNTSEVLFNKVL RTAAYEGKHIK
[0056] ESWEKAEKSKKKKTQICDAMKYSFADLGDIIRGRDILIFNNGNNEIERDLKAVFQSIYDKWKSDSNNNK DKYPDLTSFRS
[0057] AffffDANRKDIWKAMTCGAPEDATLFKKLEKWGIPNLILSQHKCGHNDDPPIDDYIPQRLRWMKEffGEYV CKILNENVNDM
[0058] KNDCDKCTLNDKKCSDEDDGNKCRSCKEKCKEYTKLIYNLKSQFYILEKHYNELYTKAQNNTTYFTNDN DKKVIEFFKKV
[0059] KKDCDVGTPDKYLDKAIHCIHYDFTKNGTKSKPYVFNNQPEKYKNLCSCTITNHPLDKCPLPDKTDDYC KIIRHINPCIT
[0060] INLDNNLDTWTGFWWHNISHKNKGVLVPPRRRHLCTRELTGIRYRKNDKDNLKQNLIDSAFNQGILLGK TFKDYSDQGLE
[0061] YMKYSFADY⑶IIKAKDMIGGSNIDDFNNDLKKMFPEHHSENMGKTTISREQffffEANKTHVWHAMLCGY HQGIINPNLSR
[0062] RRPKPLEEGTQSSIATKTIPSNWCQLPNDYSTDQFLRWFQEWIENFCTRKKVLEKEAQEQCKNITCNND TGKTNTKCTEA
[0063] CKNYSNFILIKKKEYESLNSQYDMNYKKIVEHKNALEYFKDKCKNNCECLSKHIDNGKNWKEPYETIDD SELIGKCKCKK
[0064] VKPKTPDVIPAGATETKEKDTPHAPEKPQQPPQPLPPSDEPFDPTILQTYIPFGIALALGSIAFLFMKK KPKSPVDLLRV
[0065] LNIPKRDYEMPTLKSKNRYIPYASDRYKGKTYIYME⑶SS⑶EKYAFMSDTTDVTSSESEYEELDINDI YVPGSPKYKTL
[0066] IEVVLEPSKSNGNTLGDDMVPTTNTFTDEEWNELKHDFISQYVQREPLDVPQYDESTQLPMNIVGNVLD DGMDEKPFITS
[0067] IHDRDLYTGEEISYNINMSTNSMDDPKYVSNNVYSGIDLINDTJS⑶RIDIYDELLKRKENELFGTNHV KQTSIHSVAKL
[0068] TNSDPIHNQLDLFHTWLDRHRDMCNTWNTKEELLDKLNEQWNKDNDG⑶IPNDNKKLNTDVSFEIDMDL· TKGKKEFSNMD
[0069] TILDDMEDDIYYDVNDENPSVDNIPMDHNKVDVPKKVHVEMKILNNTSNGSLEQEFPISDVWNI
[0070] 此外，HB3var6PfEMPl变体由以下核酸序列编码：
[0071] SEQ ID NO ：2
[0072] ATGGGGAATACAATACCAAAGCCTCCGGATCCAATTTATATAAATGAAAGTTATCAAAGTACCAGAAAT GTTTTGGAACG
[0073] TTATGCCGAAAGTATAAAGCAACAGGCAGCTGCTGATGCAGAAAAATGTGAGAAATCGTTGAAAGGAGA TTTGACAAAAG
[0074] CAGAATTTCGTGGTGCTCATATAGAGACAGTTGGTGTCCAGAAATATAGTTATTCTAATCCATGTGGTT TGAATCATACA
[0075] TGGAATACTAATTTATTGCATGATAGAGTGAAGGATAGAGATCCGTGCCATGGTAGAAATCAAAAACGT TTTGATGAAGG
[0076] TCAAGTATATGAATGTGGTAGTGGTATAATCAAAGGTAATGGAAATAACAGAAATGGGGGATCCTATGC GCCACCCAGAA
[0077] GAAGACATATATGTGATAAAAACTTGGAAGCTCTAACTGTGCAAAATACAAAAAATTCTAACGACTTGT TAGGAAATATC
[0078] TTGGTCACAGCAAAATATGAAGGCGAATCTATTGTGAATAGTTATGCAAATAGCGGAATGTTCAATGTA TGTACTGCACT
[0079] TGCACGAAGTTTTGCAGATATAGGTGATATCGTACGCGGCAAAGATCTATATAGTGGTAATAAACAAGA AAAAGAAAAAA
[0080] GAAAACAATTAGAGAAGAATTTACAAAAAATTTTTAGGAATATATATGACAAATTATTAGAGTATAACA AGACGAATGGG
[0081] GAGATAGAAGCTCGCTACGGAAGTGATAAAGAAAATTTTTTTCAATTAAGAGAAGATTGGTGGAAAGCG AACAGAGATCA
[0082] AGTATGGAGAGCTATAACATGTAAAGCTCCACAAGACGCTAATTATTTTAGAAAAATTTCAGGAGATAC TAAGGTGTTTA
[0083] CAAGTCAAGGACAATGTGGGCATAGTGAAACAAACGTTCCTACGAATCTAGATTATGTCCCTCAATTTT TACGATGGTTT
[0084] GATGAATGGGCAGAAGAGTTTTGCAGAGTAAGAGAACATAAGTTGAAAAAGATTAAAGAAGCGTGTCGT GGGAAAAATGA
[0085] TGAAAAAGATTGTAGTCGTGAGGGTTACGATTGTAATAAAACAAATCTAAGACTTAATGAAATTTTTAT GGATTTAGAAT
[0086] GTCCAAATTGTGAAAAAGCGTGTACAAGTTATAAGGAATGGATAGAAAATAAACAAAAGGAATTTAATA AACAAAAGAAA
[0087] AAATACGAAAAGGAAATAGAAAATGATGAAAGTAATTCTCATAGTACATATGATAACGAATTATATAAT AATCTGAAAAG
[0088] AAATTATCCTTCCTTTGAAAATTTTGTAGAAACATTAAAAGAAGGAGCGTATTGTACTAATGGCATTAT AGAAGGTAAAA
[0089] TAGATTTTAATAAACAATATGACACTTTTTCCCATTCACAGTACTGTAAATCATGTCCTATATTAGGTG CCMATGCAAG
[0090] AATGGACAATGCAATTCATTTAATGATATAAATTGTACAAAAATACCGACTATGACTAATATAAGAATT CACAGCACTGA
[0091] AAGTCCTAAGGATATTTATATTCTGGTGAATGATAAAAAAAATAGAGAACATTCTCTTGAATTAAAGGA TGCTTTTAATG
[0092] ATTGTGATATTTTTAAAAGAATAAGAAAACAAAAATGGTATTGTAAATATAAATGTAACTTAGATGTAT GTGAACTAAAA
[0093] AATTTTAATAGGGATATGGATGATGAAAGATTAATTTCAATCGAAGTATTGATTAAACGTTGGTTAAAG TATTTTTTAAA
[0094] TGATTATAATCAAATAAAAGAAAATTTAAATCAATGTATAAATAATGGAACAAATACATTATGTATAAA CGATTGTCATA
[0095] AAAATTGTGAATGCATAGAGAAATGGATAAAAGAAAAAGAGAAAGAGTGGAAAGTTATAAAAGATCGTT ATGTAGAACAA
[0096] TATAATAATAACGATAAAGACGTTTCTTCTAAACTTAAAACTTTTTTGAAACAGGATTTGTTTACTAAC TATGTTAAAAA
[0097] TGCCTTGGACCCCGATGAAACGTTAGATAAGATGAAAGAATCTAGTGTATGCAATGTACCTAATAAACT CAATGGAACAT
[0098] CATGTAAAAAAAAGGACGTGATAAATATTTTACTTAATAGACTTAATGAAAAAATAGATCCTTGCAAAA ATCAACATAAA
[0099] GCAACCAAAGGTAAAGAATGTTGTGATAAATTACCTAAAATTGCAGATGGTGATACATCAGACGATGAA GATGACGATGA
[0100] AGAGGATGTTTCTGTGACTTCTGGAGAAAAACAAAATGTAAAACAAGATTGTGCTGGTAAGAAATCGGA TGAGGTGTGCG
[0101] AAATGGTGAAGAAACTTATTGGAGATAACAATGGAATGAGTGGTCGAATAGAGAGTTGTAATCCAAAAA CTGGAACTTAT
[0102] CCTCCATGGAAAAACCACGCAAGTTTAGTGGAAGACAACAGAACGTGGATGCCTCCAAGAAGACAGAAA TTATGCGTAAG
[0103] TGCTTTAACACAAGAAGGTAAAATAAAAAATAAAGAAGATATAAGAAAACATTTTATTACATGTGCGGC TATAGAAACAC
[0104] ATTTTGCGTGGCATAGATATAAAAACCATMTGCGAATGCTGAAAGCAAATTAAAAACTGGAAAAATTC CTGATGATTTT
[0105] TTAAGATCCATGAAATATACTTTTGGTGATTATAGAGATATATTTTTTGGAACAGATATTTCATCATGT GATAAAATTAA
[0106] AAATGCCTCAAATACTATAAAATCTATATTAGAAAATAAAACAAAGAAGAAAAAAGGAGATAAACTCAT TGAAGATAATG
[0107] AAAAACACAAAGAGTGGTGGAATGAACATGGGAAGGAGATATGGGAAGGAATGTTATGTGCACTAGAAA AAGTTGGAGGA
[0108] AGCGTCAATATCAAATCCACGTACAACTACGATACTATAAAAAATGATCTAGAAGACTTTGCATCTAGG CCACAATTTTT
[0109] ACGGTGGTTCACCGAATGGAGTGATGAATTTTGTCAGGAACGGAAGAAATTGGAGGCAAAGGTTAAAGA ATATTGTAAGA
[0110] AGGATTATGTCGGATGTAATAAACAAAACACGAAGGCTAATAATAGTTGTGTTAGCGCTTGTGAAGCAT TTCAACATTAC
[0111] ATGAAGTCCAAAATGTCAGAATACGATACACAAAAAAAAAAATTTGAGGCTGAAAAAAGCGGGAAGGAA CCAGAATATGA
[0112] AGGTTTTTCAACTAAAGACGCTTCTGAATACTTAAAAGAAAAATGTTTGCATGGTACATGTGATTGTAT GGAGAAAGTAA
[0113] AAAACATTGATGATTATTGGAAAAATCCTCATAAAACGTATGACGATAACAAACTTGAAACTAAATGTG AGTGTCCTCAA
[0114] ACACCACCAAAACCATGTGAAATAGTAAAAACACTTTTGGAAGATAACAATGGAAGACATGTAGATGCT TGCAATCTCAA
[0115] ATATGAGGGTAAAAAAGAAAAACATACTTCATGGAATTGTAATCCAAATAAGTTTAAAAATGGAGAAGA AGGTGCCTGTA
[0116] TACCTCCGAGAAGACAAAAATTATACATATATAATTTAGAGAAATTCACTGGTGGAACATCAGAAATTG AATTGAGAAAA
[0117] GCTTTTATTGAATGTGCTGCAATAGAAACGTTTTTTTCTTGGCATAAATTTAAAAAGGATAAAGAAAGA GAGGATAAAGA
[0118] AAAACAAGATCTAGTAGGATATACATCAACCGTCGATGAAAAACATCAAAAGGATTTACAAAGTGGAAA AATTCCTGAAG
[0119] AATTTAAACGTCAAATGTTCTATACATTTGGTGATTATAGAGATATATGTTTAGGAAACGATATGGGTA ATGATAACTAT
[0120] AATAAAAATATATCTACAAAAGTTAGGAGTATTTTAAATAGTGGGGAAACACCTGAAGAATGGTGGCAA AAACATGGACC
[0121] TCAGATATGGGAAGGTATGTTATGTGCTTTAAGTTACGATACCGAAAAACAAAAAAAGGTTCAAGATGT GCACAATAATC
[0122] TTATAGCCCCCCCAAACAACAACAAGTACAACGACGTAAAATTGGTTTCGAAAAGTGGGAAACTTCATA CCTCTTTATCC
[0123] GATTTTGCAACTGTTCCGCAGTTTTTAAGATGGTTCGAAGAATGGGTCGAAGAGTTTTGTAGAAAAAAA AAAATTAAAAT
[0124] TGATAAAATTGAAGACGAATGTCGTGGAGAATATGATAATGGTGGTAAAAAATATTGTAGTGGTGATGG TTATGATTGTG
[0125] ACAAAAGATATTTATCCCATAATAAAATGTTTGCAGATTTAAATTGTCTAGGTTGTGAGAAAGAATGTA GAAATTATAAA
[0126] AAATGGATAGAAGAAAAAGTAGAAGAATTTTATAAAGAAAAAAAGAAATACGAAAAGGGGTTTGAGAAC ACACGAACTAA
[0127] CCTTGATAATAAATATGTTAAAGAATTTTATGAAACATCTGCTGGAAAATATAAGTCTGTTGACTTATT TTTAGATACAT
[0128] TGAAAGAAAGATCTCATTGTAGTATGGGTATGGTAAATAGAAAAATAGATTTTAAGAATCCGCTCGAAA CATTTTCCCCT
[0129] TCAATATATTGTAAAACGTGCCCTTTATATGGAGTTAACTGTAATTCGAGAGAATGTGTAGACATTACT GAAAATGAGTT
[0130] TAAGAAAAAAAATGTTTTAGATGAGATTATTATAAACGATAAGTCACATACAAGTATTGATATCGAAAT GATTGATCGTA
[0131] GGGGACAGTATATGCAAGAGAATTTAGACAATCCTTTGTTTAAAGAATCATATCTTTTAAAAAGTGTCA GAGATCAAAAA
[0132] TGGGATTGTAACTTTATTCATAATAAGATCGATTTATGTGAAATAAATAAGTTTAATGAAAACATAGAC ACTGATGAAAG
[0133] CATTACATTTAAGGTTTTGATAGAACGGTGGTTACMGATTTCTTAGAAGGATATTATATATCAAAAAA ACAAATCGATC
[0134] TATTTACAAAA AAAGAAGAAAATAAATGTGAATGCGTGAAGAAATGGGCAGAAAAAAAAGAAGGAGAA TGGGAAAAAATA
[0135] AACGAACATTTTAATAAACAAAAACATGATGATGCATTTGATATGGATTTTAAAGTCAAAAATTATTTT GAGAAAAATGC
[0136] AAGTGATTTAAAGGATTGGATAGATAATTTTAAACGTCTAAACAATATAGATGATTATCAGGTTTGCAA TGTTCATAACA
[0137] ATTGTAAAAGTGCGGATAAAAAAAATAAAATAGATATGGTATCTATTTTACTTTCTGAGCTTAAAAAAG AAATAGAAACT
[0138] TGTAAAAATCAAGGTAACGAAAAAACAAAAATAAAATGTGATGCATCACCTACAAACGACGAACTAGAT GAAGAATACGA
[0139] ACTAGGCACAACGGACACATCTCCATCCGCAGCTCCGGATATTTGTAAGGATGTGATCCAAAGTAAATC TGAAGAAACAA
[0140] TATGTAGAGATGATAAAAGGGTAGATTGTAACAAGGTGGGTAAAGATGATCCAATAAAGGTCCCTATGG ATCCAAAATCT
[0141] GGTGAAGATCATCTCAACGAGATGGGAGATAAACATAATTGTAGTGGAATTATCATTAAAACAAATGGT GAATGGAAAAA
[0142] TACAAAACAATTAAATTACCCGAACCCATGTGAAAGCATATATGCTTCACCTCGAAGACAAAAATTCTG TGTACATGAAC
[0143] TTGACAAAGCAAAAAACCAAAAGGAATTAAGAACTAAATTATTGACTGTTGCTGCAAATCAAGGATATA ATCTAGCTATT
[0144] AAACATCATGAATATAAAGACAAATATACTGTTAATCCTTGTAATGCATTGAAATATAGTTTTTACGAT TATCAGCATAT
[0145] AATTCTAGGAGATGACCCGATGGAACCTGAAAAATGGGATACGGAAAGTGCATTGAAAAGAATATTTGG AAATAGAAATA
[0146] CAGAAGATGCCAAACCTCTTAGTAGAAAACGTAAAGATTTTTGGAAAGAAAACAAAGAATGCGTTTGGT CAGCAATGAAA
[0147] TGTGGTTACAACGAAGGAATAAAAAAGGGTAATAAGAGTAATAATATTCCAGAATGTAAGGACAGTATA CCTACCCAATT
[0148] TGATGGTGTTCCTCAATTTTTGATGTGGTTTACTGAATGGAGTGAAGATTTTTGTAATCATAAGAAGAC ACATTTGAAAA
[0149] AATTGGAGCAGGGGTGTAGGGGATGTACTCTTCGTATTGATGGCACATGTGAGAAAGATGGCTCAGGAT GCCAAAAATGT
[0150] TCACAAGCGTGTGAAGAATATAAAGCATGGCTTCAAAATTGGAAAGACCAATATAAGAAACAAAGCAAA AAATATAGTGG
[0151] TGATAAAAAAAAAGAGCTATATAAAACTGTTCCTAAAGTAAAAAATTCAACACATGCCTATGAATATTT ACAAACACAAT
[0152] TAGAAAAACTTTGTGAAAAAGGTAAATGTGATTATACTTGTATGAAMACCCATCGACAGAAAATAGTA CTGAAAATATG
[0153] CCCGAATCATTGGACGTAAAACCCGATATAGTTAAGGATAAATGCCCTTGTCCACCACAGAAAATAGAA AAACCCGATTC
[0154] CACATTAAATTGCATAGATAGAAGTGCATTTGAATTATATGCAAAAGCAAAAAGTGATTTACATGGTGT AAAAGATAAAT
[0155] TAAAGGGTAATAATACAAAAAATATATACGAAGAAACAACTAATGGTAAAAATGATGATAATATTATCT GTAAAATTAAT
[0156] GAGAGTATTTCTAAACAAAACAATGTATGTAAAAAAAATGAAAATCTTTTTGATGATATAGACAAATGG GACTGTAAAAA
[0157] ACGAACAAATACAGTGCCCATTGAAAATATATGTATTCCTCCAAGAAGGAAACTTATGTGTGCATATCC ATTAAAAAATT
[0158] TAGGAGTAAAAAAAAATACTTCAGAAGTATTGTTCAACAAAGTATTGCGTACAGCAGCATATGAAGGAA AACATATAAAG
[0159] GAATCATGGGAAAAAGCAGAAAAATCCAAGAAAAAAAAAACCCAAATATGTGATGCTATGAAATACAGT TTTGCAGATTT
[0160] AGGAGATATAATTAGAGGAAGAGATATATTGATATTTAATAATGGTAATAATGAAATTGAGAGAGACTT AAAAGCTGTTT
[0161] TTCAGTCAATATACGATAAATGGAAATCTGACAGTAATAATAATAAAGATAAATACCCCGACTTAACCT CTTTTCGTTCT
[0162] GCCTGGTGGGATGCTAATAGAAAAGATATTTGGAAAGCTATGACATGTGGTGCACCGGAAGATGCTACG CTTTTTAAAAA
[0163] ACTAGAAAAATGGGGAATTCCTAATTTAATTTTGTCACAACATAAATGTGGGCATAATGACGATCCTCC TATTGATGATT
[0164] ACATACCTCAACGGTTAAGATGGATGAAGGAATGGGGAGAATATGTTTGCAAAATATTAAATGAAAACG TGAATCATATG
[0165] AAGAACGATTGTGATAAATGTACACTAAATGATAAAAAATGTTCAGATGAAGATGATGGTAATAAATGT AGAAGTTGTAA
[0166] AGAAAAATGTAAAGAATATACTAAACTTATATACAATCTGAAATCACAATTTTATATACTAGAAAAACA TTATAACGAAT
[0167] TATATACAAAAGCACAAAATAATACAACATATTTTACAAATGATAACGATAAAAAGGTTATTGAATTTT TTAAAAAAGTT
[0168] AAAAAGGATTGTGATGTGGGAACTCCTGATAAATATCTCGATAAAGCTATTCATTGTATCCATTATGAT TTTACTAAAAA
[0169] TGGAACCAAATCTAAGCCATATGTCTTCAACAATCAACCAGAAAAGTATAAAAATCTTTGTAGTTGTAC TATTACTAATC
[0170] ATCCGTTAGACAAATGTCCTTTACCTGATAAAACAGATGATTATTGCAAAATCATTAGACATATTAATC CGTGTATAACA
[0171] ATAAATTTGGATAATAATTTGGATACGTGGACTGGATTTGTTGTGCATAATATAAGTCACAAAAATAAA GGTGTGCTTGT
[0172] ACCTCCAAGAAGAAGACATTTATGTACAAGAGAATTAACTGGAATTAGATATCGTAAAAATGATAAAGA TAATTTGAAAC
[0173] AAAATCTTATTGATTCTGCTTTTAATCAAGGAATACTTTTAGGAAAAACATTTAAAGATTACAGCGATC AAGGTTTGGAA
[0174] TATATGAAATATAGTTTTGCTGATTATGGAGATATAATTAAAGCTAAAGATATGATAGGAGGTTCAAAT ATTGATGATTT
[0175] CAATAATGATTTAAAAAAATGTTTCCAGAACATCATAGTGAGAATATGGGAAAAACTACTATTAGTCGT GAACAGTGGT
[0176] GGGAAGCAAATAAAACACACGTATGGCACGCTATGTTATGCGGGTATCATCAAGGAATAATTAATCCAA ACTTATCAAGA
[0177] AGAAGACCAAAACCATTAGAAGAAGGAACACAATCGTCGATAGCAACTAAAACTATTCCTTCAAATTGG TGTCAATTACC
[0178] TAATGATTATAGCACTGATCAGTTTCTTCGTTGGTTTCAGGAATGGATTGAAAATTTTTGTACAAGGAA AAAAGTATTAG
[0179] AGAAAGAAGCACAAGAACAATGTAAGAATATTACATGTAATAACGATACTGGAAAAACGAACACTAAAT GTACTGAAGCA
[0180] TGTAAAAATTATAGTAATTTTATTTTAATAAAAAAAAAGGAGTATGAGTCACTAAATAGTCAATACGAT ATGAATTATAA
[0181] AAAAATAGTAGAACATAAAAATGCCCTAGAATATTTCAAAGATAAATGTAAAAATAATTGTGAATGTCT CTCTAAACATA
[0182] TTGATAATGGAAAAAATTGGAAAGAACCATATGAAACTATCGATGACTCAGAACTCATAGGTAAATGTA AATGCAAAAAA
[0183] GTTAAACCCAAAACTCCTGACGTAATTCCTGCAGGGGCAACTGAAACAAAAGAAAAAGATACACCTCAT GCACCTGAAAA
[0184] ACCTCAACAACCCCCACAACCCTTACCACCATCCGACGAACCCTTTGACCCGACCATCCTACAAACGAC CATTCCTTTTG
[0185] GAATCGCTTTGGCATTAGGATCGATAGCGTTTCTTTTCATGAAAaaaaaacCgaaatctccagttgacc tcttacgtgta
[0186] ctgaatatcccgaaacgagattatgaaatgcctacgttgaaatcaaaaaatcgatatataccctatgct agtgatcgata
[0187] taaaggtaaaacatacatttatatggaaggagatagcagtggagatgaaaaatatgcatttatgtctga tactactgatg
[0188] taacttcctcagaaagtgaatatgaagaattggatattaatgatatatatgtaccaggtagtcctaaat ataaaacattg
[0189] atagaagtagtattggaaccatcaaaaagtaatggtaacacactaggtgatgatatggtacctaccact aatacatttac
[0190] agatgaggaatggaatgaattgaaacatgattttatatcacaatatgtacaacgtgaaccactggatgt accacaatatg
[0191] atgaatcaacacagttaccaatgaatatagtaggtaacgttttagatgatggtatggatgaaaaacctt ttattacttct
[0192] attcatgatagagatttatatactggagaagaaattagttataatattaatatgagtactaatagtatg gatgatccaaa
[0193] atatgtatcaaataatgtatattctggtatagatttaattaatgatacattaagtggtgatcgtattga tatatatgatg
[0194] aattattgaaacgaaaagaaaatgaattatttggtacaaatcatgtgaaacaaacaagtatacatagtg ttgccaaacta
[0195] acaaatagtgaccccatccacaaccaattagatttgttccatacatggttagatagacatagagatatg tgcaatacgtg
[0196] gaataccaaggaagaattattagataaattgaatgaacaatggaataaagataatgatggtggtgatat accaaatgata
[0197] acaaaaagttgaatacggatgtttcgtttgaaatagatatggatgaaactaaaggaaagaaggaattta gtaatatggat
[0198] actatcttggatgatatggaagatgatatatattatgatgtaaatgatgaaaacccatctgtggataat atacctatgg
[0199] atcataataaagtagatgtaccaaacaaagtacatgttgaaatgaaaatccttaataatacatccaatg gatcgttgga
[0200] acaagaatttcccatatcggatgtatggaatatataa
[0201] 命名为TM284varl的PfEMPl变体具有以下氨基酸序列：
[0202] SEQ ID NO :3
[0203] MTSKRGNRTVINLSVTDVLEKIALQIYKEENEKKIPHESELTGTLWKAQFSDGLSGSFGDVRSGPSNSC NLHHKYYTNIK
[0204] NGYPPARNPCDGRNEKRFSNEGEAECGSDKIRVIGKGDGTACVPFRRQNMCDKNLEYLINKNTKTTHDL LGNVLVTAKYE
[0205] GASIVAKHPHKDTSEVCTALARSFADI⑶IVRGRDMFLPNKDDKVQKGLREVFKKIHDNLSSSVKPHYK DDGSGNYVKLR
[0206] EDffffAINRKEVWNALTCEAPQSVHYFIKTSHGTRGFTSQGKCGRNETNVPTNLDYVPQYLRWFDEffAEE FCRLRNHKLQN
[0207] VKKECRGENI⑶KYCS⑶GEDCEKIVRQDYNIRSDFLCPSCKKECTNYKKWIDTKQGEFNKQKKKYEKE IKKVESNSDTT
[0208] YDKKVYKILKEMYPLNSEFVATLKEAPYCNNNNVDGTIDFNKPDDTFSRSDYCKSCPVFGVICTRGECT EVKEDTCSKMN
[0209] VKVPKKITNKEDPINIGILVSDDRVSVIPNELENVCKDTGLFKGIRKDQRSCNYLCNLDVCDLSHNKNN THIDKRISIRV
[0210] LFKRWLEYFFKDYSKLKKKLNSCTNNGEKSICINKCKKKCECVGKWVEEKRTEWEKVRKRYFSQYNVDD SQKSYTVKSIV
[0211] NGNVDRSDINNSLDESEDIETLKESDTCYNSDSAKKQKCEKNDVITILIDRLKKKIDDCEKQHDNRTNQ ICCDELPESKE
[0212] DDEDEEEEGKKKKNAKQLEVTNEKKEQEDKNLFQVCQKMKKVITDNNGERIRNQRCNEKTDRKWDCSTN EIPTNHTGACM
[0213] PPRRISLCIRPLRYLVDNGGKKSIDDYKNAFTECASIETYLLWQKYKRTNGAEDKLKDGEIPNDFLRIM YYTYGDYRDIF
[0214] LGTDISKNPNIKNISNKVKNILKFKKSMDESGKNQDENAKVQSSWDEHKRDIWKGMLCGLTYDIQNEKK DILKILNNKYN
[0215] YPCDLEVFASKPQFFRWFIEWAEDYCRKYNDEYEKLQTACSTVDCSKDPTDSEKWKCKNACDNFKTFVE GWKKQYDSQKN
[0216] KFNKIKIEANIKNTYKGIENKEAYVFLSEECKGKCDCIKYKTDYDTNANDPKGFDTPPKEQKDMCECVL· RKKSACENNEV
[0217] PKGRTQSQMTCADLKNESPSKGNNNTGNNHKETITFSCNKSNLIGLGAQWKKITDDGLYASPRTRQLCL KHVIDIGRNNT
[0218] KKNNITEEEFINVLQKDAYAEGKLLYMYYNSNGKISIFQNGEKLKLDDIEKHTHEAMKRSYADY⑶LIK GTTKYTQYNDY
[0219] NKISDIINWWTKKKNSASINDIYEREEFWEKYRADVWNAMLCGYKDVSNKTFDGNDDMCNLPNTDKEEE FLRWFKEWNEN
[0220] FCITQIKRAEKLKNECNNFNCSSIKSKKDDIKSKCVKAVINYKKFVKESKTQYEDQKRTYNERHNKTNK DIPTFLKDNCI
[0221] HKNCDCISIKFNHKDNWEKSFFESLDSSDIKNKCECLKLEEESNTTERYISKEDPQYHPEYK⑶GKVNY KYEKGKPKALP
[0222] SIYPLNCAEKVADELRMYAENSLDTNTKLKAKISKSIDTNEQNATNDEIDCNIYNNISNGQKNTCEHNG NTFHDKDEWDC
[0223] NKGTNKLYENDICLPPRRKHMCTKQLENISTASITTTDDLLKEVLITAVNEGKRLKQQWEKTENEAQKK KHFLCDAMKYS
[0224] FADLADIIRGTDIWKGNREQQKIQERLVKIFRNIYDNLEKDEYEKYKYGTKYQNLRSAffffDAHRKKIWN AMTCSAP⑶FL
[0225] FVKRGKGDGSDIEFLTFSEHKKCGHDKEPPVYDYVPQILRWITEWSEHFCELQEKNYYLLKEKCADYIQ KDSKPIDDSHN
[0226] IKCNTCKTKCEEYSKFIKKWNSQYINLEKKFKELYDEANNTKSYEELYRIGKPSHRNHYEDENLIQFLQ NVKSECNEPNT
[0227] VDKYLMYTSDCRRVKFSNTIDTNVNKPTADVTHNTINGPSSNLPVVTETNIKNELREYAFLETPEGYGN ACKCKGPEPLD
[0228] RCPENDNISNYCNDFVSVPECTAKIYKDEIDHWNNANVKFKTSINNGVLVPPRRSHICLKNMITKNYDK KKNGMEKFKTD
[0229] LLQVAYNEGYFLCQKYDKQPRDVLEAMKYTFADIADIVKGRDMINKDISAKLRKLLDIKVEPKAPRKffff KYNKAHVWHAM
[0230] LCGYRKGGGTITNDECNVPFEEYTYQFLRWFQEWIKKGCTGQQKLYDDVWTKCSSANCNRDDGTISLPE CESSCVQYKNY
[0231] ITRKRQEYRSLNHQYNMNFKEQKAQGMKATQYIDDKCNSKCDCLIKYIDREKEWTNIYDSLENNDLKNK CDCKQIKPKRH
[0232] PKEVNPEEEPANSEPDYIVPLVPQKPSTPEVPPPPPPPLPTPSDEPFNRDILEKTIPFGIALALCSIAF LFIKKKPKSSV
[0233] DLLRVIDIHKGDYDIPTLKSKNRYIPYKSAQYKGKTYIYME⑶SDSGHYYEDTTDITSSESEYEEMDIN DIYVPGSPKYK
[0234] TLIEVVLEPSKRDTQNDIPSDNTPSYKLTDEEWNQLKHDFISQYLPNTEPNNNYRSGNSPTNTNNTTTS HDNMGEKPFIT
[0235] SIHDRDLYTGEEISYNINMSTNTNNDIPKYVSNNVYSGIDLINDTLSGNKHIDIYDEVLKRKENELFGT NHPKNTSNNSV
[0236] AKLTNSDPIMNQLDLLHKWLDRHRDMCDKWNTKEELLDKLNEQWNKDNDVGGDISTSNGNKTLNTNVSI EIDMDETKGKK
[0237] EFSNMDTILDNIEDDIYYDVNDENPSMDDIPMDHNKVDVPKKVHVEMKILNNTFNGSLEPEFPISDVWN I
[0238] 此外，TM284varlPfEMPl变体由以下核酸序列编码：
[0239] SEQ ID NO ：4
[0240] ATGACGTCAAAACGTGGAAATCGAACTGTAATTAATCTTAGTGTAACGGATGTTCTAGAAAAAATTGCA TTACAAATATA
[0241] TAAAGAGGAAATGAAAAAAAGATTCCACATGAAAGTGAATTGATAGGCACATTATGGAAAGCACAATTT TCTGATGGCT
[0242] TGAGTGGTTCATTTGGTGATGTAAGGTCTGGTCCTTCAAATTCCTGCAATCTTCATCACAAATACTATA CTAATATAAAG
[0243] AATGGATATCCACCCGCAAGGAATCCTTGCGATGGTAGAAATGAAAAACGTTTTTCAAACGMGGTGAA GCAGAATGTGG
[0244] TAGTGATAAAATAAGGGTTATTGGAAAAGGTGATGGTACAGCATGTGTACCATTTAGAAGGCAAAATAT GTGTGATAAAA
[0245] ATTTAGAATATTTGATTAATAAAAACACGAAAACTACTCATGATTTATTGGGAAATGTATTAGTTACAG CAAAATATGAA
[0246] GGTGCCTCTATTGTTGCAAAGCATCCACATAAAGATACTTCAGAAGTATGTACTGCACTTGCACGAAGT TTTGCAGATAT
[0247] AGGTGATATTGTAAGAGGAAGAGATATGTTTTTACCTAATAAGGATGATAAAGTACAAAAAGGTCTAAG AGAAGTTTTCA
[0248] AGAAAATACATGATAATTTGTCATCTTCCGTAAAACCACATTACAAAGATGATGGATCTGGAAATTACG TCAAATTAAGA
[0249] GAAGATTGGTGGGCAATTAATAGAAAGGAGGTATGGAATGCATTAACATGTGAAGCTCCACAAAGTGTT CATTATTTTAT
[0250] AAAAACGTCACATGGAACAAGAGGTTTTACAAGTCAAGGAAAATGTGGCCGTAATGAAACAAACGTTCC TACAAATCTTG
[0251] ACTATGTTCCTCAATATTTACGCTGGTTCGATGAATGGGCAGAAGAGTTTTGTCGATTAAGGAATCATA AGTTACAAAAC
[0252] GTTAAGAAAGAGTGTCGTGGAGAAAATATAGGTGACAAATATTGTAGTGGTGATGGTGAGGATTGTGAA AAGATTGTTCG
[0253] TCAGGATTATAATATTCGTTCGGATTTTTTATGTCCGAGCTGTAAAAAGGAATGTACAAATTATAAAAA ATGGATAGACA
[0254] CAAAACAGGGAGAATTTAATAAACAGAAAAAAAAATACGAAAAAGAAATTAAAAAAGTTGAAAGTAATT CTGATACCACA
[0255] TATGATAAAAAAGTTTATAAAATTCTAAAAGAAATGTACCCTTTAAATTCAGAATTTGTAGCAACATTA AAAGAAGCTCC
[0256] CTATTGTAATAACAATAATGTAGACGGTACAATAGATTTTAATAAACCAGATGATACATTTTCTCGTTC AGACTATTGTA
[0257] AATCATGTCCTGTATTTGGTGTTATTTGTACAAGAGGTGAGTGTACTGAAGTTAAGGAAGATACATGTA GTAAAATGAAT
[0258] GTTAAGGTTCCGAAAAAAATTACAAATAAGGAAGATCCTATTAATATAGGTATTCTTGTTAGTGATGAC AGAGTAAGTGT
[0259] AATTCCAAATGAATTAGAGAATGTTTGCAAAGATACAGGTCTCTTTAAAGGTATTAGAAAAGATCAACG GTCATGTAATT
[0260] ACTTATGTAATTTAGATGTATGTGACCTGAGTCATAATAAAAACAATACACATATAGATAAACGTATTT CTATTAGAGTA
[0261] TTGTTTAAACGTTGGTTAGAATATTTTTTTAAAGATTATAGTAAATTAAAAAAAAAACTGAATTCATGT ACAAATAATGG
[0262] AGAAAAATCCATATGTATAAATAAATGTAAAAAAAAATGTGAATGTGTGGGAAAATGGGTAGAAGAAAA AAGGACAGAAT
[0263] GGGAAAAAGTAAGAAAGCGTTACTTCAGTCAATATAATGTTGATGATTCACAAAAATCGTATACAGTGA AAAGTATTGTA
[0264] AATGGAAATGTAGATCGTAGTGATATTAATAATTCATTGGATGAGAGCGAAGATATAGAAACGTTGAAA GAATCAGATAC
[0265] ATGTTATAATTCTGATAGCGCAAAAAAACAAAAATGTGAAAAAAACGACGTCATAACTATTTTAATTGA TAGACTTAAAA
[0266] AAAAAATTGATGATTGTGAAAAGCAACATGATAATAGAACTAATCAAATTTGTTGTGATGAGTTACCTG AAAGTAAAGAA
[0267] GATGATGAAGATGAAGAGGAAGAAGGGAAAAAGAAAAAAAATGCAAAGCAATTGGAAGTAACTAATGAG MAAAAGAACA
[0268] AGAAGACAAAAACTTGTTTCAAGTGTGCCAAAAAATGAAGAAGGTAATTACGGATAATAATGGAGAAAG AATCAGAAACC
[0269] AGCGTTGCAATGAAAAAACTGATAGAAAATGGGATTGTAGTACTAATGAAATTCCTACAAATCATACTG GAGCTTGTATG
[0270] CCACCAAGAAGAATATCATTATGTATTCGGCCTTTACGATATTTGGTAGATAACGGAGGAAAAAAAAGC ATAGATGATTA
[0271] TAAAAATGCGTTTACTGAATGTGCATCAATAGAAACGTATTTGTTATGGCAAAAATACAAAAGAACTAA TGGAGCAGAAG
[0272] ATAAATTAAAAGATGGAGAGATTCCAAATGATTTTCTAAGAATAATGTATTATACATATGGAGATTATA GAGATATATTT
[0273] TTGGGAACAGATATTTCTAAAAATCCTAATATTAAAAAATATATCAAATAAGGTTAAAAATATATTGAA ATTCAAAAAGAG
[0274] CATGGACGAATCAGGTAAAAATCAGGATGAAAATGCGAAAGTTCAATCTTCGTGGGATGAACATAAAAG GGACATATGGA
[0275] AAGGAATGTTATGTGGATTAACCTATGATATCCAAAATGAAAAGAAAGATATTCTCAAAATTCTCAATA ACAAGTACAAT
[0276] TACCCATGCGATCTTGAAGTGTTTGCATCTAAACCACAATTTTTTCGTTGGTTTATTGAATGGGCAGAA GATTATTGTAG
[0277] AAAATACAATGATGAGTATGAAAAATTACAGACGGCGTGTAGTACGGTAGATTGTAGTAAAGACCCTAC TGATTCTGAAA
[0278] AACAAAAATGTAAAAACGCTTGTGATAATTTCAAAACATTCGTTGAAGGTTGGAAAAAACAATATGATA GTCAAAAAAAT
[0279] AAATTTAATAAGATAAAAATTGAAGCTAATATAAAGAATACATATAAAGGTATAGAAAAATAAAGAAGC TTATGTATTTTT
[0280] AAGTGAAGAATGTAAAGGAAAATGTGACTGTATAAAATATAAAACAGACTATGATACAAATGCAAATGA TCCTAAAGGTT
[0281] TCGATACACCACCGAAAGAACAAAAAGATAATTGTGAATGTGTGTTGAGAAAAAAATCGGCATGTGAAA ATAATGAAGTA
[0282] CCTAAAGGTCGAACACAATCTCAAATGACATGTGCTGATCTAAAAAATGAATCTCCTAGTAAAGGAAAT AATAATACTGG
[0283] GAACAATCATAAAGAAACCATTACATTCTCGTGCAATAAAAGCAATTTAATTGGCTTAGGAGCACAATG GAAAAAAATAA
[0284] CTGATGATGGTTTATATGCTTCTCCAAGAACTCGACAATTATGTTTGAAACACGTAATAGACATAGGAA GGAATAATACT
[0285] AAAAAAAACAATATAACAGAAGAAGAGTTCATTAATGTATTACAAAAAGATGCATATGCTGAAGGTAAA TTACTTTATAT
[0286] GTACTACAACAGTAATGGTAAAATATCTATATTTCAAAATGGCGAAAAGTTAAAATTGGATGACATAGA AAAACATACAC
[0287] ATGAAGCCATGAAAGATCATATGCTGATTATGGTGATTTAATTAAAGGAACAACAAAATATACACAATA CAATGATTAT
[0288] AACAAAATTAGCGATATTATAAACGTTGTGACTAAAAAGAAAAATTCCGCTTCAATTAATGATATTTAT GAGCGTGAAGA
[0289] ATTTTGGGAAAAATATAGAGCTGATGTATGGAATGCTATGTTATGTGGTTACAAAGATGTATCAAATAA AACATTTGATG
[0290] GAAACGATGATATGTGTAACTTACCAAATACTGATAAGGAGGAAGAATTTCTCAGATGGTTTAAGGAAT GGAATGAAAAT
[0291] TTTTGTATTACACAAATAAAACGCGCAGAGAAATTAAAAAATGAATCCAATAATTTTAACTGTTCTTCC ATTAAGAGTAA
[0292] AAAGGACGATATTAAATCTAAATGTGTAAAAGCATGTATAAATTATAAAAAGTTTGTAAAGGAATCAAA AACGCAATATG
[0293] AAGATCAAAAGAGAACATACAATGAAAGACATAATAAGACAAATAAGGATATTCCTACTTTTTTGAAAG ATAATTGTATT
[0294] CATAAAAACTGTGATTGTATTTCTATAAAATTTAATCATAAAGATAATTGGGAAAAAATCTTTTTTTGA GAGTTTAGATAG
[0295] TTCCGATATTAAAAATAAGTGTGAATGTTTAAAACTTGAAGAAGAGTCAAATACTACAGAACGATATAT TTCTAAAGAAG
[0296] ACCCACAATATCATCCAGAATATAAAGGTGATGGAAAGGTTAATTATAAATATGAGAAAGGAAAACCAA AAGCTCTTCCT
[0297] TCTATATACCCTTTGAACTGTGCTGAAAAGGTTGCTGACGAGTTACGAATGTATGCTGAAAATTCTTTG GATACTAATAC
[0298] TAAATTGAAGGCAAAAATATCAAAAAGTATAGATACAAATGAACAAAATGCTACGAATGATGAGATTGA TTGCAATATTT
[0299] ACAATAATATATCTAATGGACAGAAAAATACTTGTGAACATAATGGAAACACTTTTCATGATAAGGATG AATGGGATTGT
[0300] AACAAAGGAACAAATAAATTATATGAAAATGATATTTGTTTACCTCCAAGAAGAAAACATATGTGTACA AAACAACTAGA
[0301] AAATATCAGCACGGCATCAATTACAACTACGGATGATTTACTGAAAGAAGTGTTAATTACAGCTGTAAA TGAAGGAAAGC
[0302] GTTTAAAACAGCAATGGGAGAAAACAGAAAATGAAGCACAAAAAAAGAAACACTTTTTATGTGATGCTA TGAAATATAGT
[0303] TTTGCTGATTTAGCTGATATTATAAGAGGAACAGACATATGGAAAGGAAATAGAGAGCAACAAAAAATA CAAGAAAGATT
[0304] AGTAAAAATCTTCAGAAATATATATGATAACTTAGAGAAGGATGAATATGAGAAATATAAATATGGTAC AAAATATCAAA
[0305] ATTTAAGATCGGCTTGGTGGGATGCACATAGAAAGAAAATATGGAATGCTATGACATGTTCAGCACCAG GTGATTTCCTT
[0306] TTTGTAAAAAGAGGAAAAGGAGATGGAAGTGACATCGAATTTTTAACTTTTTCAGAACATAAAAAATGT GGACATGATAA
[0307] AGAACCACCTGTTTATGATTATGTGCCTCAAATACTTAGATGGATTACAGAATGGTCTGAACATTTTTG TGAATTGCAAG
[0308] AAAAAAATTATTATCTTCTAAAAGAAAAATGTGCTGATTATATACAAAAGGATTCCAAACCTATTGATG ATTCACATAAT
[0309] ATAAAATGTAATACTTGTAAGACGAAATGTGAAGAATATAGTAAATTTATTAAGAAATGGAACTCTCAG TATATAAATCT
[0310] GGAAAAAAAATTTAAAGAATTATATGACGAGGCAAATAATACTAAAAGTTATGAAGAACTTTACAGAAT TGGGAAGCCTT
[0311] CACACAGAAACCACTATGAAGATGAAAACCTGATTCAGTTCTTACAAAATGTAAAATCTGAGTGTAACG AACCTAACACT
[0312] GTTGATAAATATCTTATGTATACAAGTGATTGTAGAAGAGTTAAATTTTCTAATACTATCGATACAAAT GTTAACAAACC
[0313] TACTGCGGATGTTACTCATAATACTATTAATGGTCCTAGTAGTAACCTCCCAGTTGTTACTGAAACAAA TATTAAAAATG
[0314] AACTAAGAGAATATGCTTTCTTAGAAACACCAGAAGGATATGGTAATGCTTGTAAATGTAAGGGTCCTG AACCATTAGAT
[0315] CGTTGCCCTGAAAATGATAATATTAGTAATTACTGTAACGATTTTGTTAGTGTTCCTGAATGCACAGCA AAAATATATAA
[0316] AGATGAAATTGATCATTGGAATAATGCAAATGTAAAATTTAAGACATCAATAAATAACGGTGTGTTAGT TCCTCCAAGAA
[0317] GAAGTCATATATGTCTTAAGAATATGATAACAAAAAACTATGATAAAAAGAAAAATGGGATGGAAAAAT TTAAAACTGAT
[0318] CTTCTACAGGTTGCATACAATGAAGGTTATTTCCTATGTCAAAAATATGATAAGCAACCTAGAGACGTA TTGGAAGCGAT
[0319] GAAATACACATTTGCAGATATTGCTGATATAGTAAAAGGTAGAGATATGATTAACAAAGATATATCCGC AAAACTACGAA
[0320] AATTATTGGATATTAAGGTTGAACCCAAAGCTCCTAGAAAATGGTGGAAATACAATAAAGCACATGTAT GGCACGCTATG
[0321] TTATGTGGATATAGAAAAGGTGGAGGAACAATTACGAATGATGAGTGTAATGTTCCAGATGAAGAGTAC ACTTATCAATT
[0322] TCTTCGATGGTTTCAAGAATGGATTAAAAAATTTTGTACTGGACAACAAAAATTATATGACGACGTACA AACGAAATGTT
[0323] CATCTGCCAATTGTAATAGAGATGATGGGACGATTAGCCTACCTGAATGTGAAAGTTCTTGTGTTCAAT ATAAGAATTAC
[0324] ATTACAAGGAAGAGACAAGAGTATCGGTCACTAAACCATCAATATAACATGAATTTTAAAGAACAAAAG GGACAAGGTAT
[0325] GAAAGCCACACAGTACATAGATGATAAATGTAATAGTAAATGTGATTGTCTCATTAAATATATTGATAG AGAAAAAGAAT
[0326] GGACAAACATATATGACTCATTGGAAAATAATGATCTGAAAAATAAATGTGATTGTAAGCAAATTAAAC CCAAACGTCAT
[0327] CCAAAAGAAGTAAATCCTGAGGAAGAACCTGCTAATTCTGAACCCGATTACATTGTTCCCCTTGTACCA CAAAAACCTTC
[0328] AACACCAGAGGTACCCCCACCTCCTCCTCCACCTTTACCAACCCCTTCGGACGAACCATTCAATCGTGA CATTCTGGAAA
[0329] AAACCATTCCTTTTGGAATTGCATTGGCATTATGTTCGATAGCTTTTCTCTTCATAAAGaaaaaaccta aatcatctgtt
[0330] gacctcttgcgagtaattgacatccacaaaggagattatgatatacctacattgaaatccaaaaatagg tacataccata
[0331] taaaagtgctcaatataaaggtaaaacatacatttatatggaaggagatagtgatagtggacactacta cgaagatacaa
[0332] ctgatattacttcctccgaaagtgaatatgaagagatggatattaatgatatatatgttcctggtagtc CcLcLcLcL^cLCcLcLcL
[0333] acgttgatagaagttgttctggagccatcaaaaagagatacacaaaatgatatacctagtgataataca cctagttataa
[0334] acttacagatgaggaatggaatcaattgaaacatgattttatatcacaatatttaccaaatacagaacc βββ?ββ?ββ--
[0335] atagaagtggaaatagtccaacaaataccaataatactaccacgtcacatgataatatgggagaaaaac cttttattact
[0336] tctattcatgatagggatttatatactggagaagaaattagttataatattaatatgagtactaacact aataatgatat
[0337] tccaaaatatgtatcaaataatgtatattctggtatagatttaattaatgacacattaagtggtaacaa acatattgata
[0338] tatatgatgaagtgctaaaaagaaaagaaaatgaattatttggaacaaatcatccgaaaaatacatcaa acaatagtgta
[0339] gctaaattaacaaatagtgatccaattatgaaccaattagatttgttacataaatggttagatagacat agagatatgtg
[0340] cgataaatggaataccaaggaagaattgttagataaattaaatgaacaatggaataaagataatgatgt tggtggtgata
[0341] tttccactagtaatggtaataaaacgttgaatactaatgtttcgattgaaatagatatggatgaaacta aaggaaagaag
[0342] gaatttagtaatatggatactatcttggataatatagaagatgatatatattatgatgtaaatgatgaa aacccatctat
[0343] ggatgatatacctatggatcataataaagtagatgtacctaagaaagtacatgttgaaatgaaaatcct
[0344] tcaatggatccttggaaccagaatttcccatatcggatgtatggaatatataa
[0345] 命名为ITvar60的PfEMPl变体具有以下氨基酸序列：
[0346] SEQ ID NO :5
[0347] MAPKGRSTNEIELSARDVLENIGIGIYNQEKIKKNPYEQQLKGTLSNARFHDGLHKAADLGVIPGPSHF SQLYYKKHTNN
[0348] TKYYKDDRHPCHGRQGKRFDEGQKFECGNDKIIGNSDKYGSCAPPRRRHICDQNLEFLDNNHTDTIHDV LGNVLVTAKYE
[0349] GESIVNDHPDKKNNGNKSGICTSLARSFADI ⑶ IVRGRDMFKPNDKDAVRHGLKWFKKIYDKLSPKVQ EHYKDVDGSGN
[0350] YYKLREDffffTANRDQVWKAITYKAPQDANYFRNVSGTTNAFTSAGKCRHNDNSVPTNLDYVPQFLRWYD EWADDFCRIRN
[0351] HKLQKVKDTCQGYNNSGYRIYCS⑶GEDCTNILKQNFNIVSDFFCPSCKTECTNYKKWINKKQGEFNKQ KKKYEKEINNI
[0352] ASNSDNTYDKKVYKTLKSMYPLDTKFVATLKEAPFCNNNNVDGIIDFNKPDDTFSSSTYCDSCPAFGVI CENGTCTKVNE
[0353] DTCSKMNVQVPKIITNKEDPTNIGILVSDDRVNVIPNELENVCKNTGIFKGIRKDEWSCKYLCNLDVCD LSHNKNNTHID
[0354] KRISIRVLFKRWLEYFLKDYSKLKKKLNSCTNNGKESICINECKKKCECVGKWAEEKRKEWEKVRKRFF NQYNVDDSLKS
[0355] YEVKTFVNGNVDRSDIKNALNEGENLEALQDSDECIKPHNSKKDTCVKNDVVNILINRLKKKIDDCKIQ HDNRTNQICCD
[0356] ELPESKEDNEDEEEEGEKKKNSKHLEETKEKKELDDNNFLDLCNNVKKYIEDNNKQISIQHKCNTKGDG NWNDSTKKIDI
[0357] QHTGAHMPPRRKSLCIRELRYLVEIGGDKNIDDYKNAFTKCASIETYLLWQKYKKSNRSEEDKLKGGEI PEDFRGIMYYT
[0358] F⑶YRDIFLGTDISSDGNIKNISNKIKDLMKEKYSKATGHKGENHNSNLQSSWDEHKRTIWKGMLCGLT YGISNEQQKKN
[0359] IRKMLNNKYKYPCDLETFSKKPQFLRWFNEWSEDFCKNYKNAIDILKKDCTEADCMNKLVNNREKNKKC KEACEHFKEWI
[0360] KGWKNQYEQQRKKFNIDKNVEQKETAYINVNGLEPYEFFQNQYFVGTCECMKNKSESSANNDENIPEAF DEKPKEFKDKC
[0361] PCTYDIPEPSETMSCIEKAAFKLRYASEDKIHSKISSKLKGNGSAFSCTNSASDNIFDETSCYKNEFNK TENINSVKASN
[0362] MNRFDTNIIWDCDGKTKYEQINLCVPPRRENMCIKGLEHLNRTKHSDNKTLLKELQEIASTEGKGISKN FKQMDRENDDG
[0363] ICDAMKYSFADLADIVRGTDNYKNSNGNNNKVEENLKKIFEKIHNINSLKKEYSKDKPDYQRLRSDWWD TNRKEIWKALT
[0364] CSARDNNKIYKKGQKNTNNGKNKCGNEEDPPDDDYIPQPFRWLQEWSEHFCRVQYDNLNKLKEECGECN ENKNGLACMMN
[0365] SNIKDTKCMNCKDACKDYRNMINTWNSQWKKQQEIYKELYNTKNKININKCKVIEFLDKTNDTCHYKHG SAEKFLKESSH
[0366] CTDLTFDKTKNSNNIPYAFENPPDGYKVLCGTTYRKSCKKLKKLGMNYTSENKIDLSGENAKWEKLNDL IYVPPRTQQLC
[0367] LQPLQTLISRTNKTTKVTEYDFSRALQICAYNEANSLHNYYSKYGKDFVFSAGKSQDTKDEIKTHILEN MKRSFADYGNL
[0368] IKGKTQYEYNGLNKKLQDYIKTNLKYNGTDRKTGEDLWNKHKSDIWNSMLVGYNEENPSEPLHDKDIRC KLPDNDSEDEF
[0369] LRWFQEWFEDFCVIKGILIQNVKDACNFNNCRDANNKSIRSCQKPCVKYKTffVEQRKIEYENQIQKYKN LNNNSNEGKES
[0370] LLFLNDKCKGKCECIVQKKSTDNIDKIFEEYPEEYKTQCECQPDPCSDLSITDSGFPDASPFGGGQPRS ACPTRRGNHNN
[0371] CPTEEICKKYDSYINGCRPKTYHDNTNNWDSRGMLNSSSENEGVLIPPRRRHLCTRNIIKNLSRIKNKD HFKDYLMKSAY
[0372] EEGKLLREKYRNNSRDGLNAMMFTFADYADIVKGTDIFGSILSQKLGEITGISNDINERKKWWSEIKNN IWEVMLCSYNR
[0373] TKNNNNFFGNIVRENCNVPNTDEKDQFLRffLLEWGIQACKEKKIRKQALQTKCYCSNPNEISGSDIIKH YPCKSELTKYI
[0374] QWNLMIKELLDQLNIKYQNIKASNNPKNPSEINAEEYIETELKEGECNLVDIERIYNKIKQEHNPLKEI LMYLCPNLEFP
[0375] DDTFEYIGKTETEDTTIEPETPTSDNPEDSIPSISPRDVHPTTGEDTNIFNSNILSSTIPFGIALALSS IAFLFLKKKTL
[0376] SPVDLLRVLDIHKGDYGIPTLKSKNRYIPYRSGTYKGKTYLYVE⑶SDSGHYYEDTTDITSSESEYEEN DINDIYVPGSP
[0377] KYKTLIEVVLEPSKSDGHIPHSAGEPLDDMVGTTIFTDEEWNELKHDFISQYVQRESMGVPQYDVSTEL PMNIGGNVLDD
[0378] GMEEKPFITSIHDRDLYTGEEFSYNINMGTNSMDDPKYVSNNVYSGIDLINDTLSGNQHIDIYDEVLKR KENELFGTNYK
[0379] KNISNNRVAKLTNNDPIMNQLDLLHKWLDRHRDMCNTWNTKEELLDKLNEQWNKDNDAGDIPSDSNKKL NTDVSIQIDMD
[0380] DPKGKKEFSNMDTILDDIEDDIYYDVNDENPFVDDIPMDHNKVDVPKKVHVEMKILNNTSNGSLEPEFP ISDVWNI
[0381] 此外，ITvar60PfEMPl变体由以下核酸序列编码：
[0382] SEQ ID NO :6
[0383] ATGGCACCAAAGGGTAGAAGTACAAATGAAATTGAACTTAGCGCAAGACATGTTTTGGAAAAAATTGGA ATAGGAATATA
[0384] TAATCAGGAAAAAATAAAAAAGAATCCATATGAACAACAATTGAAAGGCACATTATCAAACGCCCGATT TCATGATGGCT
[0385] TGCACAAGGCAGCTGATTTGGGGGTAATACCTGGTCCTTCACATTTTTCTCAGCTTTATTACAAAAAGC ATACTAATAAC
[0386] ACAAAATATTATAAGGATGATAGGCATCCTTGTCATGGTAGACAAGGAAAACGTTTTGATGAAGGTCAA AAATTTGAATG
[0387] TGGTAATGATAAAATAATTGGTAATAGCGATAAATATGGATCCTGTGCTCCACGTAGAAGAAGACATAT ATGTGATCAAA
[0388] ATTTAGAATTCTTAGATAACAATCATACTGATACTATTCATGATGTATTGGGAAATGTGTTGGTCACAG CAAAATATGAA
[0389] GGTGAATCTATTGTTAATGATCATCCAGATAAAAAGAACAATGGTAATAAATCAGGTATATGTACTTCT CTTGCACGAAG
[0390] TTTTGCCGATATAGGTGATATTGTAAGAGGAAGAGATATGTTTAAACCTAATGACAAAGATGCAGTGCG GCATGGTTTAA
[0391] AGGTAGTTTTTAAGAAAATATATGATAAATTGTCACCTAAAGTACAAGAACATTACAAAGATGTTGATG GATCTGGAAAT
[0392] TACTATAAATTAAGGGAAGATTGGTGGACAGCGAACAGAGATCAAGTATGGAAAGCCATAACATATAAA GCTCCACAAGA
[0393] CGCTAATTATTTTAGAAATGTTTCAGGAACAACTATGGCGTTTACAAGTGCAGGAAAATGTAGACACAA TGACAATAGCG
[0394] TCCCAACGAATCTAGATTATGTCCCTCAATTTTTACGTTGGTACGATGAATGGGCAGATGATTTTTGTC GAATAAGAAAT
[0395] CATAAGTTGCAAAAGGTTAAAGACACATGTCAGGGATATAATAATAGTGGTTATAGAATATATTGTAGT GGTGATGGTGA
[0396] GGATTGTACAAATATTCTTAAACAGAATTTTAATATTGTTTCGGATTTTTTTTGTCCGAGCTGTAAAAC CGAATGTACAA
[0397] ATTATAAAAAATGGATAAATAAAAAACAAGGTGAATTTAATAAACAAAAAAAAAAATACGAAAAGGAAA TTAACAATATT
[0398] GCAAGTAATTCTGATAACACATATGATAAAAAAGTTTATAAAACTCTAAAAAGCATGTACCCTTTAGAT ACAAAATTTGT
[0399] AGCAACACTAAAAGAGGCTCCCTTTTGCAATAACAATAATGTAGATGGTATAATAGATTTTAATAAACC AGATGATACAT
[0400] TTTCTAGTTCAACATATTGTGATTCATGTCCTGCATTTGGTGTTATTTGTGAAAATGGTACGTGTACTA AGGTTAATGAA
[0401] GATACATGTAGTAAAATGAATGTTCAGGTTCCAAAAATAATTACAAATAAGGAAGATCCTACTAATATA GGTATTCTTGT
[0402] TAGTGATGACAGAGTAAATGTAATTCCAAATGAATTAGAGAATGTTTGCAAAAATACAGGTATCTTTAA AGGTATTAGAA
[0403] AAGATGAATGGTCATGTAAATATTTATGTAATTTAGATGTCTGTGACCTGAGTCATAATAAAAACAATA CACATATAGAT
[0404] AAACGTATTTCAATTAGAGTACTGTTTAAACGTTGGTTAGAATATTTTTTAAAAGATTATAGTAAATTA AAAAAAAAACT
[0405] GAATTCATGTACAAATAATGGAAAAGAATCCATATGTATAAATGAATGTAAAAAAAAATGTGAATGTGT GGGAAAATGGG
[0406] CAGAAGAGAAAAGAAAAGAATGGGAAAAAGTAAGAAAGCGTTTCTTTAATCAATATAATGTTGATGATT CACTAAAATCT
[0407] TACGAAGTGAAAACATTTGTAAATGGAAATGTAGATCGTAGTGATATTAAGAATGCATTAAATGAGGGT GAAAATTTAGA
[0408] AGCGTTGCAAGATTCTGATGAATGTATTAAACCTCATAATTCCAAGAAAGACACATGTGTAAAAAATGA CGTCGTAAATA
[0409] TTTTAATTAATAGACTTAAAAAAAAAATTGATGATTGTAAATCCAACATGATAATAGAACTAATCAAAT TTGTTGTGAT
[0410] GAGTTACCTGAAAGTAAAGAAGATAATGAAGATGAAGAGGAAGAAGGGGAAAAGAAAAAAAATTCAAAA CATTTGGAGGA
[0411] GACTAAAGAGAAAAAAGAACTGGATGACAACAATTTTTTGGATTTGTGCAACAATGTGAAGAAATATAT TGAGGATAATA
[0412] ATAAGCAAATAAGTATACAACATAAATGCAATACGAAAGGAGATGGAAATTGGAATGATAGTACAAAAA AGATCGATATT
[0413] CAACATACTGGAGCTCATATGCCACCAAGAAGAAAATCATTATGTATTCGTGAGTTACGATATTTGGTA GAAATTGGAGG
[0414] AGATAAAAACATAGATGATTATAAAAATGCGTTTACTAAATGTGCATCAATAGAAACATATTTGTTATG GCAAAAATACA
[0415] AAAAATCTAATAGATCAGAAGAAGATAAATTAAAAGGTGGAGGGATTCCAGAAGATTTTAGAGGAATAA TGTATTATACA
[0416] TTTGGTGATTACAGAGATATATTTTTGGGAACAGATATTTCTTCAGATGGTAATATTAAAAATATATCA AATAAAATAAA
[0417] AGATTTAATGAAAGAAAAGTATAGTAAAGCAACAGGTCATAAAGGAGAAAACCATAATTCAAATCTTCA ATCTTCGTGGG
[0418] ATGAACATAAAAGGACCATATGGAAAGGAATGTTATGTGGATTAACCTATGGTATATCAAATGAACAAC AAAAAAAAAAT
[0419] ATTCGCAAAATGCTCAACAACAAGTACAAATACCCATGCGATCTAGAAACATTTTCAAAGAAACCACAA TTTCTTCGTTG
[0420] GTTTAACGAATGGAGTGAAGATTTTTGTAAAAATTACAAAAATGCTATTGATATATTAAAAAAGGATTG TACAGAAGCAG
[0421] ATTGTATGAATAAATTAGTAAATAATCGTGAAAAAACAAGAAATGTAAAGAAGCGTGTGAACATTTTAA AGAGTGGATA
[0422] AAAGGATGGAAAAATCAATATGAACAACAAAGAAAAAAATTTAATATTGATAAAAATGTTGAACAAAAG GAGACAGCATA
[0423] TATAAACGTAAATGGTCTGGAACCCTATGAATTTTTTCAAAACCAATATTTTGTGGGAAACATGTGAAT GCATGAAAAATA
[0424] AATCAGAGTCATCTGCAAATAATGATGAAAATATACCAGAAGCATTCGATGAAAAACCAAAGAGTTCAA GGACAAATGT
[0425] CCATGTACTTATGATATACCTGAACCTAGCGAAACTATGAGTTGTATAGAGAAAGCTGCCTTCAAATTA CGTTATGCTTC
[0426] TGAAGATAAAATTCATAGTAAAATTAGTAGTAAATTGAAAGGAAACGGTTCAGCGTTTTCATGTACGAA CAGCGCAAGTG
[0427] ACAATATTTTTGATGAGACAAGTTGTTATAAGAATGAATTTAACAAAACAGAAAATATTAATTCAGTGA AAGCTTCAAAC
[0428] ATGAATCGTTTTGATACAAATATTATATGGGATTGTGATGGAAAAACAAAATATGAGCAAATTAATTTA TGTGTTCCGCC
[0429] TAGAAGAGAAAATATGTGTATAAAGGGGCTAGAACACTTGAACGAAACTAAACATTCTGATAATAAAAC GCTATTAAAAG
[0430] AGCTTCAAGAAATTGCAAGTACTGAAGGGAAAGGCATATCAAAAAATTTTAAACAAATGGATAGAGAAA ATGATGACGGA
[0431] ATATGTGAtGCCATGAAGTACAGTTTTGCCGATTTGGCAGATATAGTAAGAGGTACAGATAATTACAAA AATTCTAATGG
[0432] TAATAATAATAAAGTAGAGGAAAACCTTAAAAAAATTTTCGAAAAAATACACAATATTAATAGTCTTAA AAAAGAATATA
[0433] GTAAGGACAAACCGGATTATCAAAGATTACGATCTGACTGCTGCGATACGAATAGAAAAGAAATATGGA AAGCATTAACG
[0434] TGTTCAGCAAGGGATAATAATAAAATATACAAGAAAGGGCAAAAAAATACTAATAATGGAAAGAATAAA TGTGGAAATGA
[0435] AGAGGATCCTCCTGATGATGATTATATTCCACAACCTTTTCGTTGGTTACAAGAATGGAGTGAACATTT TTGTAGAGTTC
[0436] AATATGATAATCTGAATAAACTGAAAGAAGAATGTGGAGAATGTAATGAAAATAAAAATGGTTTAGCTT GTATGATGAAT
[0437] TCAAATATTAAAGATACAAAATGTATGAATTGCAAAGATGCATGCAAGGACTACAGAAATATGATTAAC ACATGGAATAG
[0438] TCAATGGAAAAAACAACAAGAAATATATAAAGAATTATATAATACTAAAAATAAAATAAATATtAATAA ATGTAAGGTGA
[0439] TAGAATTTTTAGATAAAACAAATGATACGTGTCACTATAAACCAGGAAGTGCAGAAAAGTTTCTTAAAG AATCTAGTCAT
[0440] TGTACTGACCTTACATTCGACAAAACAAAGAATTCAAAtAATATTCCTTATGCCTTTGAAAATCCACCT GATGGATATAA
[0441] AGTTTTATGTGGTACAACATATAGAAAATCAtGTAAAAAGCTAAAAAAATTAGGGATGAATTATACGTC AGAAAACAAAA
[0442] TTGATTTAAGTGGAGAAAACGCTAAGTGGGAAAAACTTAATGATTTGATATATGTCCCTCCACGAACAC AACAATTATGT
[0443] TTACAACCTTTGCAAACGTTGATATCACGTACCAATAAAACCACGAAAGTAACAGAATATGATTTCTCC AGAGCATTACA
[0444] AATATGTGCATATAATGAAGCAAATTCTCTTCACAATTATTATAGTAAGTATGGCAAAGATTTTGTATT TAGTGCTGGTA
[0445] AGTCTCAAGATACTAAAGATGAAATAAACACACATTCTTGAAAATATGAAAAGAAGCTTTGCTGATTAT GGTAATTTA
[0446] ATTAAAGGAAAGACCCAATACGAATATAATGGTTTAAACAAAAAGCTTCAGGATTACATAAAGACTAAT TTAAAATATAA
[0447] TGGAACTGACAGAAAAACAGGTGAAGATCTTTGGAATAAACATAAATCCGATATTTGGAATTCTATGCT ATGTGGATATA
[0448] ATGAAGAAAACCCAAGTGAACCACTTCATGATAAAGACATAAGATGTAAATTACCTGATAATGATAGTG AAGATGAATTT
[0449] TTACGTTGGTTTCAAGAATGGAGAGAAGATTTTTGTGTTATCAAAGGTATACTGATACAAAATGTGAAA GATGCATGTAA
[0450] TTTTAATAATTGTGAAGATGCAAATAATAAATCCATAAGATCTTGTCAAAAACCATGTGTCAAATACAA AACATGGGTTG
[0451] AACAAAGAAAAATTGAATACGAAAATCAAATCCAGAAATATAAAAATCTCAACAATAATTCAAATGAAG GAAAAGAATCA
[0452] CTTTTATTTTTAAACGATAAATGTAAAGGGAAATGTGAATGTATAGTTCAAAAAAAAAGTACTGATAAT ATCGATAAGAT
[0453] TTTTGAGGAATATCCTGAAGAATACAAAACGCAATGTGAATGTCAGCCTGATCCATGTAGTGACCTAAG TATTACAGATA
[0454] GTGGATTTCCTGATGCAAGTCCTTTTGGTGGAGGTCAACCACGTTCCGCGTGTCCTACAAGGCGAGGAA ATCATAATAAT
[0455] TGCCCTACTGAAGAAATATGTAAAAAATATGATAGCTATATTAATGGTTGTCGCCCTAAAACATATCAC GACAATACAAA
[0456] TAATTGGGATAGCAGAGGCATGCTAAACAGTTCATCTGAAAATGAAGGTGTATTAATTCCTCCTAGAAG GCGACATTTAT
[0457] GCACAAGAAATATAATTAAAAATTTGTCACGTATTAAAAATAAAGATCATTTTAAAGATTACCTAATGA AATCTGCTTAT
[0458] GAAGAAGGAAAACTTTTAAGGGAAAAATATAGAAATAATAGTAGAGATGGATTAAATGCAATGATGTTC ACTTTTGCTGA
[0459] TTATGCAGATATAGTTAAAGGTACTGATATATTTGGCAGTATATTATCTCAAAAATTAGGTGAAATAAC TGGAATAAGCA
[0460] ATGATATAAATGAGCGTAAAAAATGGTGGAGTGAAATTAAAAATAATATATGGGAAGTTATGTTGTGTT CTTATAATAGA
[0461] ACAAAGAATAATAATAATTTTTTCGGAAACATTGTGAGAGAAAACTGTAATGTTCCTAACACAGATGAA AAGGACCAATT
[0462] TTTGAGATGGTTACTTGAATGGGGTATACAAGCATGTAAAGAAAAAAAAATCAGAAAACAAGCCCTTCA AACGAAGTGTT
[0463] ACTGTTCAAACCCAAACGAAATATCGGGTTCCGATATTATAAAACATTACCCTTGTAAAAGTGAACTCA CCAAATATATA
[0464] CAATGGAATTTAATGATTAAAGAATTATTAGATCAATTAAATATAAAATATCAAAATATAAAAGCATCT AATAATCCGAA
[0465] AAATCCCTCGGAAATAAATGCAGAGGAATACATAGAAACAGAACTTAAGGAAGGTGAATGTAATTTGGT TGATATAGAAC
[0466] GAATATATAATAAAATTAAACAAGAACATAATCCATTAAAAGAAATATTAATGTATTTATGTCCTAATT TAGAATTTCCT
[0467] GATGATACATTCGAATACATTGGGAAAACCGAAACTGAAGATACAACTATTGAACCAGAAACCCCTACA TCCGATAACcC
[0468] TGAGGATAGTATTCCTTCCATTTCACCTGAAGACGTTCACCCAACAACAGGAGAAGACACAAACATTTT CAACAGTAACA
[0469] TATTATCATCTACTATCCCTTTTGGAATTGCTTTGGCCTTAAGTTCGATCGCTTTCCTGTTCCTGAAGa
[0470] tcccctgtggacctcttacgtgtacttgatatccataaaggcgattatggaatacctacactgaaatcc aaaaataggta
[0471] tataccatatagaagtggtacatataaaggcaaaacatatttatatgttgaaggagatagtgatagtgg acactactacg
[0472] aagatacaactgatattacttcatccgaaagtgaatatgaagaaatggatatcaatgatatatatgtac caggtagtcct
[0473] aaatataaaacattgatagaagtagtactggaaccatccaaaagtgatggtcatataccacatagtgct ggtgaaccact
[0474] agatgatatggtaggtaccactatatttacagatgaggaatggaatgaactgaaacacgattttatatc acaatatgtgc
[0475] aacgtgaatcaatgggtgtaccacaatatgatgtatcaaccgagttaccaatgaatataggaggtaatg ttttagatgat
[0476] ggcatggaagaaaaaccttttattacttctattcatgatagggatttatatactggagaagaatttagt
[0477] tatgggtactaatagtatggatgatccaaaatatgtatcaaataatgtatattctggtatcgatttaat taatgacacat
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[0480] gttagatagacatagagatatgtgcaatacgtggaataccaaggaagaattattagataaattgaatga acaatggaata
[0481] aagataatgatgctggtgatataccaagtgatagtaacaaaaagttgaatacggatgtttcgatacaaa tagatatggat
[0482] gatcctaaaggaaagaaggaatttagtaatatggatactatcttggatgatatagaagatgatatatat tatgatgtaaa
[0483] tgatgaaaacccatttgtggatgatatacctatggatcataataaagtagatgtaccaaagaaagtaca tgttgaaatga
[0484] aaatccttaataatacatccaatggatccttggaaccagaatttcctatatcggatgtatggaatatat aa
[0485] 据此，本发明涉及由以上述SEQ ID N0S1，2,3,4,5或6给出的序列编码或具有 以上述SEQ ID N0S1，2,3,4,5或6给出的序列的PfEMPl抗原。技术人员将理解由显示与 本文提供的序列一定程度的同源性或同一性的序列编码的PfEMPl抗原也在本发明的范围 内。尤其，由与 SEQ ID N0S ;1，2, 3, 4, 5 或6 中任一个显示至少 40% ,45% ,50% ,55% ,60 %，65%，70%，75%，80%，90%，91%，92%，93%，94%，095%，96%，97%，98%或99% 同源 性/同一性的序列编码的PfEMPl抗原被认为是本发明中具有潜在实用性的PfEMPl抗原。 本发明进一步涉及重组或合成产生的由与以SEQ ID N0S:1，2,3,4,5或6给出的那些具有 同源性和/或同一性的序列编码的或具有与以SEQ ID勵5:1，2,3,4,5或6给出的那些具 有同源性和/或同一性的序列的PfEMPl抗原。
[0486] 在所有情况下，本发明包括PfEMPl抗原，所述PfEMPl抗原与由以SEQ ID NOS: 1，2, 3, 4, 5或6给出的序列编码的或具有以SEQ ID NOS: 1，2, 3, 4, 5或6给出的序列的 那些相比，包含（i) 一种或多种突变-表征为氨基酸/核酸缺失，添加，取代和/或插入 的突变和（ii)关于SEQ ID N0S:2, 4和/或6的一种或多种保守氨基酸取代-术语"保守 取代"包括以具有类似性质的并基本不改变天然（或野生型）蛋白的物理化学性质和/或 结构或功能的替代氨基酸取代蛋白或肽的一种或多种氨基酸的行为。当然，技术人员将理 解遗传密码子的简并性允许密码子中的一种或多种碱基的取代而不改变一级氨基酸序列。 因此，尽管SEQ ID N0S:1，3和5编码特定PfEMPl抗原，但是密码子的兼并性可以用于获 得编码相同一级氨基酸序列的变体核酸序列。
[0487] 技术人员将理解可以使用表达载体和/或系统重组生产本文描述的PfEMPl抗原。 在这方面，本发明提供载体，例如包含编码本发明的PfEMPl抗原的核酸序列的细菌表达 载体（例如PET或pGEX系统载体）。技术人员将理解编码本发明的PfEMPl抗原的核酸序 列可以被密码子优化以保证在特定表达系统中的最大表达。本发明进一步提供转化有本发 明的载体的宿主细胞（例如细菌细胞（大肠杆菌））。
[0488] 在其它实施方案中，本发明提供用于产生人中的免疫应答的药物-所述药物包 括选自由HB3var6 ;TM284varl ;和ITvar60组成的组的一个或多个PfEMPl抗原（或其一个 或多个片段）。此外，本发明提供产生人中的免疫应答的方法，所述方法包括向人受试者施 用免疫原性量的一种或多种PfEMPl抗原（或其片段），所述PfEMPl抗原选自由HB3var6 ; TM284varl ;和 ITvar60 组成的组。
[0489] 技术人员将理解术语"片段"包括本文描述的PfEMPl抗原的免疫原性和/或抗原 性片段-包括由SEQ ID N0S1，2, 3, 4, 5或6编码的那些。在一个实施方案中，片段可以 包含PfEMPl抗原的完整结构域或区域-包括例如，一种或多种Duffy结合样（DBL)结构 域。在其它实施方案中，合适的片段可以包含介于约10和n-1个氨基酸-其中"η"是 完整 PfEMPl 抗原的氨基酸总数（HB3var6:n = 3424 ;TM284varl:n = 2790 ;ITvar60:n = 2716)。通过举例的方式，PfEMPl抗原性片段可以包含约10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500， 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2 200, 2300, 2400, 2500, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300 或 3400(相邻的）PfEMPl 氨 基酸或由约 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 14 00, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2700, 2800, 2900, 3000 ,3100, 3200, 3300或3400(相邻的）PfEMPl氨基酸组成。在其它实施方案中，适于用于本 发明的PfEMPl抗原性片段可以包含能够产生交叉反应性/保护性免疫应答的至少一种表 位。
[0490] 除了鉴定适于产生人中交叉反应性和/或保护性免疫应答的PfEMPl抗原外，本 发明人已经进一步鉴定也适于产生人中交叉反应性和/或保护性免疫应答的PfEMPl抗原 的特定片段，区域和/或结构域。
[0491] 因此，在第四个方面，本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋 白-1 (PfEMPl)的Duffy结合样（DBL)结构域，其用于产生人中的免疫应答。
[0492] 在第五个方面，本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1 (PfEMPl)的 Duffy结合样（DBL)结构域用于制备用于产生人中的免疫应答的药物的用途。
[0493] 在第六个方面，本发明提供产生人中的免疫应答的方法，所述方法包括向人受试 者施用一定量的恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1 (PfEMPl)的一种或多种Duffy结合样（DBL) 结构域的步骤。
[0494] 如本发明的第一，第二和/或第三个方面中使用的PfEMPl抗原所具有的，第四， 第五和第六个方面使用的DBL结构域适于产生交叉反应性和/或保护性免疫应答/抗体。 也就是说，由本发明提供的针对PfEMPIDBL结构域产生的免疫应答可以包含对很多不同恶 性疟原虫株的PfEMPl抗原显示一定程度的特异性，选择性和/或亲和力的抗体。
[0495] 在一个实施方案中，用于本发明的第四，第五和/或第六个方面的DBL结构域是 选自由以下组成的组中的一种或多种：
[0496] (i)NTS-DBLl α 结构域；
[0497] (ii)DBL4 ε 结构域；和
[0498] (iii)⑴和/或（ii)的（免疫原性/抗原性）片段。
[0499] 在一个实施方案中，本发明的第四，第五和/或第六个方面的NTS-DBLla结构域 源自PfEMPl变体HB3var6，TM284varl和/或ITvar60。在一个实施方案中，用于本发明的 第四，第五和/或第六个方面的NTS-DBL1 α结构域源自HB3var6,和/或TM284var 1。
[0500] 在其它实施方案中，DBL4 ε结构域获自PfEMPl变体ITvar60。
[0501] 鉴于上述情况，本发明提供包含选自由以下组成的组的一种或多种PfEMPIDBL结 构域的用于用途的抗原，用途和方法：
[0502] (i)PfEMPl 变体 HB3var6 的 NTS-DBL1 α 结构域；
[0503] (ii)PfEMPl 变体 TM284varl 的 NTS-DBL1 α 结构域；
[0504] (iii)PfEMPl 变体 ITvar60 的 DBL4 ε 结构域；和
[0505] (iv)上述（i)-(iii)中任一个的（免疫原性/抗原性）片段。
[0506] 应该理解，所有对DBL结构域的引用包括DBL结构域片段。如上文定义的，用于 本发明的DBL片段可以是免疫原性的和/或抗原性的，并且因此能够产生人中保护性/交 叉反应性免疫应答。换句话说，DBL片段可以能够产生（raising)(或产生（generating)) 与当宿主被施用完整DBL抗原时产生的免疫应答基本上类似或相同的宿主免疫应答。适于 使用的DBL结构域片段可以包括包含完整DBL序列的10, 20, 30, 40或50个（优选相邻的） 氨基酸或由完整DBL序列的10, 20, 30, 40或50个（优选相邻的）氨基酸组成的那些。在 一个实施方案中所述片段可以包含从约10个氨基酸到约n-1个氨基酸的任意数量的DBL 结构域氨基酸或由从约10个氨基酸到约n-1个氨基酸的任意数量的DBL结构域氨基酸组 成，其中η是相关DBL结构域的氨基酸总数。
[0507] 为了方便起见，本说明书中描述的不同PfEMPl抗原，其突变体/变体，片段和结 构域应该共同被称为"PfEMPl抗原"。具体来说，以下被视为根据本发明的PfEMPl抗原：
[0508] (i) PfEMPl (包括如上文定义的突变体或其序列变体）；
[0509] (ii)结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl ;
[0510] (iii)PfEMPl 变体 HB3var6 ;
[0511] (iv) PfEMPl 变体 TM284varl ;
[0512] (v) PfEMPl 变体 ITvar60 ;
[0513] (vi) PfEMPIDBL 结构域；
[0514] (vii)NTS-DBLl α 结构域；
[0515] (viii)DBL4 ε 结构域；
[0516] (ix)PfEMPl 变体 HB3var6 的 NTS-DBL1 α 结构域；
[0517] (x)PfEMPl 变体 TM284varl 的 NTS-DBL1 α 结构域；
[0518] (xi)PfEMPl 变体 ITvar60 的 DBL4 ε 结构域；和
[0519] (X) (i)-(ix)中任一个的（免疫原性/抗原性）片段。
[0520] 技术人员将理解，PfEMPl抗原，片段和/或结构域可以找到特别的应用，如用于 产生免疫应答的疫苗。虽然对疟疾的免疫性可以天然形成，但需要对疟疾寄生虫（例如， 恶性疟原虫）的重复暴露。实际上，不希望受理论限制，本发明部分基于以下发现：在从重 症（脑）疟疾中恢复的儿童中检测到针对PfEMPl抗原的抗体-此外本发明人注意到这些 抗体对本文描述的特定PfEMPl抗原（即PfEMPl变体，HB3var6 ;TM284varl和ITvar60)显 示一定程度的特异性。因此，PfEMPl变体HB3var6 ;TM284varl和ITvar60可以代表典型的 疫苗候选物。
[0521] 当然，来自世界上疟疾不是问题的区域（例如欧洲）的年轻人和人中，天然免疫 的水平低，因为存在对疟原虫的暴露不足。此外，在对疟原虫属（例如恶性疟原虫）的低免 疫性/无免疫性的人中，感染可以造成重症疟疾。本领域技术人员将理解，重症疟疾的情 况可以导致继发性并发症，包括死亡，昏迷（脑疟疾），呼吸困难，低血糖和严重贫血。因 此，不经常暴露于疟疾寄生虫的儿童和/或旅客易于发展疟疾和/或重症疟疾。
[0522] 由本发明提供的疫苗可以用于产生儿童中免疫应答，其中所述免疫应答针对疟 疾和重症疟疾的发展给予保护。在其它实施方案中，本发明提供可以用于在很少暴露于疟 疾或未曾暴露于疟疾的人（这可以包括，例如来自世界上不存在疟疾的那些区域的旅客） 中产生免疫应答的疫苗。同上，通过使用本发明提供的疫苗产生的免疫应答可以针对疟疾 和重症疟疾的发展提供保护。
[0523] 在第七个方面，本发明提供作为组合物的本发明的PfEMPl抗原，所述组合物包含 药学上可接受的稀释剂，载体和/或赋形剂。在一个实施方案中，本发明的组合物可以是 无菌的。
[0524] 可以配制或制备组合物用于肠胃外施用-包括，例如通过皮下，皮内，肌肉内和 /或静脉内注射。在一个实施方案中，本发明的组合物可以包含根据已知的工艺使用合适的 分散、润湿和/或悬浮剂配制的含水的或含油的悬液。在这方面，技术人员将理解可接受 的载体，稀释剂和/或赋形剂可以包含1，3_ 丁二醇，水，林格溶液，和等渗氯化钠溶液。 此外，常规使用无菌的，不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用任何温和 的不挥发性油，包括合成的单酸甘油脂或甘油二酯。此外，脂肪酸（如油酸）用于制备根 据本发明的可注射组合物。
[0525] 在一个实施方案中，由本发明提供的组合物和疫苗可以进一步包含一种或多种 佐剂。技术人员将理解术语"佐剂"可以包括任何增强或促进免疫的宿主对疫苗或免疫原 性组合物的抗原的免疫应答的试剂。合适的佐剂可以包括明矾和/或弗氏佐剂。
[0526] 由本发明提供的组合物和/或疫苗可以通过单个或多个剂量的有效量施用。优选 将两个或更多个剂量施用预定的时期。
[0527] 通过举例的方式，可以在施用初始疫苗剂量（初次免疫）之后，在初次免疫后的 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9和/或10周间隔给予一次或更多次加强剂量（二次免疫）。
[0528] 本发明考虑了其它施用模式并且包括鼻内，腹膜内，鞘内，直肠，输注和肺内施 用。施用还可以通过滴鼻剂，气溶胶，通过皮肤或膜表面的输注或摄取。
[0529] 在第八个方面，本发明提供包含PfEMPl抗原的疫苗，其用于治疗或预防疟疾或 重症疟疾。在一个实施方案中，本发明的疫苗可以预防，限制或抑制重症疟疾的发展。技 术人员将理解可以预防地施用疫苗以在易感群体中预防疟疾或重症疟疾的发展。易感人群 可以包含儿童或青少年和/或不常规，经常暴露于疟疾寄生虫的那些（例如欧洲游客）。
[0530] 在第九个方面，本发明提供包含PfEMPl抗原的疫苗在制备用于治疗或预防疟疾 和/或重症疟疾的药物中的用途。
[0531] 由本发明提供的PfEMPl抗原可以与其它抗原，例如其它疟原虫（恶性疟原虫） 抗原和/或其它细菌或病毒抗原组合以获得组合疫苗以使用。
[0532] 在第十个方面，本发明提供治疗或预防疟疾/重症疟疾的方法，所述方法包括向 人受试者施用疫苗，所述疫苗包含免疫原性量的PfEMPl抗原。
[0533] 在第十一个方面，本发明提供本文描述的一种或多种PfEMPl抗原，其用于诊断 或检测人受试者-尤其儿童（即年轻人或青少年人受试者）中的疟疾和/或重症疟疾。 由本发明第十一个方面提供的诊断过程可以包括检测由被怀疑患有疟疾/重症疟疾，或被 疟原虫（例如恶性疟原虫）感染的受试者提供的样品中PfEMPl抗原水平的步骤。技术人 员将理解可以通过以下方式检测PfEMPl抗原的水平：免疫学技术，如ELISA(使用对预定 的PfEMPl抗原显示亲和力，特异性和/或选择性的抗体），免疫印迹，SDSPAGE和/或基 于PCR的技术（其探测样品的恶性疟原虫核酸-尤其，编码PfEMPl抗原的那些序列的水 平）。
[0534] 在第十二个方面，本发明提供对本文描述的PfEMPl抗原中的一种或多种显示一 定程度的亲和力，特异性和/或选择性的抗体。不希望受理论限制，破坏玫瑰花结的干预 可以是对重症疟疾的有价值的辅助治疗。通过举例的方式，对本文描述的PfEMPl抗原中 的一种或多种显示亲和力，特异性和/或选择性的抗体，可以用于疏通微血管中阻塞的血 流（其是由形成玫瑰花结的寄生虫引起的主要病理事件）。此种类型的"破坏玫瑰花结"干 预可以类似于卒中和心脏病发作后使用的破坏凝块的药物，以移除由形成玫瑰花结的细 胞引起的对微血管血流的梗阻，并恢复正常组织氧合。
[0535] 术语"抗体"包括多克隆抗体以及单克隆抗体并包括结合抗原和/或表位的抗体 片段，比如，例如，Fab, Fab2, scFv, VH结构域和/或结构域片段。对蛋白/肽序列特异的 多克隆/单克隆抗体的生产和分离是本领域中常规的，并且进一步信息可以在例如"Basic methods in Antibody production and characterisation^oward&Bethell, 2000, Taylor &Francis Ltd中找到。本文描述的抗体可以缀合于可检测部分，比如，例如，化学发光和 /或荧光部分。本文描述的抗体可以用于诊断过程，例如，检测样品中恶性疟原虫，或诊 断人中疟疾或重症疟疾（如由恶性疟原虫引起的）。任何诊断过程可以包括将由人受试者 提供的样品与本发明的抗体接触-检测到结合于PfEMPl抗原的抗体表示样品由感染有恶 性疟原虫寄生虫的人提供。术语"样品"可以指由人受试者提供的任何生物材料和/或流 体并且可以包括，例如，血液，血清，血浆，汗液，唾液和/或组织活检的样品或细胞样 品。
[0536] 由本发明提供的抗体可以进一步用于被动免疫方案以治疗或预防疟疾和/或重 症疟疾。因此，本发明的一个实施方案提供根据本发明的第十二个方面的一种或多种抗 体，其用于治疗和/或预防痕疾/重症痕疾。
[0537] 因此，本发明的第十三个方面提供对本文描述的PfEMPl抗原显示特异性，选择 性和/或亲和力的抗体，其用于治疗或预防疟疾和/或重症疟疾。本发明进一步提供对 PfEMPl抗原显示特异性，选择性和/或亲和力的抗体在制备用于治疗或预防疟疾的药物中 的用途。在更进一步的方面，本发明提供治疗或预防疟疾的方法，所述方法包括向需要其 的人受试者施用治疗有效量的对PfEMPl抗原显示特异性，选择性和/或亲和力的抗体。
[0538] 在第十四个方面，本发明提供能够识别PfEMPl和未感染的红细胞间相互作用的 一种或多种化合物，其用于治疗和/或预防疟疾/重症疟疾。通过举例的方式，所述化合 物可以包含小分子（例如蛋白/肽，核酸碳水化合物，有机/无机分子）或对由本发明提 供的PfEMPl抗原，片段，表位和/或结构域中的一种或多种显示亲和力，选择性和/或 特异性的抗体。此外，本发明可以延伸至提供小分子，所述小分子可以用在用于治疗或预 防玫瑰花结形成的方法和药物中。
[0539] 详细描述
[0540] 现在将参考下图详细描述本发明，所述图显示：
[0541] 图1:恶性疟原虫形成玫瑰花结的寄生虫的关键表面抗原（类型APfEMPl变体） 的鉴定和用于免疫的重组蛋白的生产。a)来自恶性疟原虫形成玫瑰花结的实验室株的显著 表达的变体的PfEMPl结构域结构。显示先前描述的形成玫瑰花结的变体ITvar9 [12, 20] 用于比较。结构域类型基于保守基序[6,45]。NTS:N-末端部分；DBL:Duffy结合样；CIDR: 富半胱氨酸结构域间（InterDomain)区域；ATS:酸性末端部分；TM:跨膜区域。*IT分离株 最初来自巴西，然而在20世纪80年代初期的交叉污染之后，现在的IT/FCR3株被认为是 源自东南亚的[65]。b)来自同基因型的形成玫瑰花结的（R+)和不形成玫瑰花结的（R-) 寄生虫的RNA的RNA印记，其用对于各个株的来自玫瑰花结-特异性变体的PfEMPl结构域 (R+DBL探针，高严格度）和用外显子II探针（中等严格度）（其检测所有var基因）探测 [44]。箭头指示主要的玫瑰花结-特异性变体。通过用溴化乙锭（Et Br)染色确认R+和 R-RNA的相等上样量。c)在大肠杆菌中生产重组NTS-DBLa结构域以免疫兔。l:TM180var l，2:Muzl2varl，3:TM284varl，4:ITvar60,5:HB3var6。Μ:分子量标记；R:还原的；NR:非还 原的。
[0542] 图2:针对PfEMPl的抗体识别活的感染的红细胞表面，并且显示恶性疟原虫形成 玫瑰花结的实验室株之间的交叉反应性。a)用针对ITvar60的抗体（25μ g/ml)就同源寄 生虫（IT/PAR+)测试的免疫荧光测定（IFA)。左图：显示感染的红细胞位置的DAPI染色。 右图：活的感染的红细胞表面上的点状荧光。b)显示与未免疫的兔IgG对照相比，ITvar60 的抗体针对IT/PAR+寄生虫的滴定的流式细胞术。滴定终点（end titre)(这里定义为通 过IFA/流式细胞术，感染的红细胞中多于50%是阳性的最低浓度）为0. 1 μ g/ml。c)针对 如表明的具有各种不同粘附表型的恶性疟原虫实验室株测试PfEMPl抗体（从400 μ g/ml 开始总IgG的四倍稀释）。各个抗体：寄生虫组合的滴定终点（如上文定义的）在每个矩 形内显示。同源抗体：寄生虫组合以粗体标出。阴性对照是未免疫的兔IgG，和针对来自 不形成玫瑰花结的类型A PfEMPl变体（HB3var3,由选择用于结合人脑内皮细胞的不形成 玫瑰花结的寄生虫HB3-HBEC表达）的NTS-DBLa的抗体。*The HB3R+寄生虫包含不同于 表达HB3var6的细胞的表达HB3var3的感染的红细胞的亚群，表S1)。
[0543] 图3:针对PfEMPl的抗体在恶性疟原虫形成玫瑰花结的实验室株中玫瑰花结抑 制和诱导吞噬作用中显示交叉反应性。a)玫瑰花结抑制测定以确定PfEMPl抗体对同源和 异源的形成玫瑰花结的实验室株的剂量依赖型效果。将数据与无加入的抗体，在玫瑰花 结中包含感染的至少40%的红细胞的对照相比较。显示一式三份的值的平均和标准偏差。 IC50:产生50%玫瑰花结抑制的抗体浓度。b)除由0. lmg/ml的各个抗体（针对HB3var6 ，TM284varl, ITvar60, Muzl2varl, TM180varl 和 ITvar9)的混合物组成的抗-Ros 汇集体之 夕卜，用lmg/ml的抗体的如上文的玫瑰花结抑制测定。对照为如对于图2c的。c)与单核细 胞系Thp-Ι共孵育的调理的IT/PAR+感染的红细胞的吞噬作用测定[12]。数据显示为以兔 抗-人红细胞抗体调理的阳性对照的百分数。
[0544] 图4:针对PfEMPl的抗体在恶性疟原虫临床分离株的表面识别和玫瑰花结抑制中 显示交叉反应性。a)以0. 4mg/ml的来自未免疫的兔的总IgG(阴性对照，左图）和针对 TM284varl的抗体（中图）的临床分离株MAL43的流式细胞术。以Hoescht染色的感染的 红细胞在右半部分，并且以Alexa Fluor488染色的抗体-阳性的感染的红细胞在右上象 限。直方图的重叠（右图）显示染色的感染的红细胞的明确群体。b)以PfEMPl抗体测试 新鲜临床分离株表面反应性（以〇.4mg/ml的IFA和流式细胞术）和玫瑰花结抑制（lmg/ ml)。玫瑰花结抑制百分数显示于对于所有分离株：抗体组合的每个矩形中，具有>25% 的玫瑰花结抑制。对照为如对于图2c的，并且抗-Ros汇集体为如对于图3b的。仅测试 抗-Ros汇集体的玫瑰花结抑制。c)对于五种临床分离株的显示阴性对照，抗-PfEMPl阳 性和IgM-阳性的感染的红细胞的流式细胞术直方图。仅通过IFA测试其它分离株。"阴性 PfEMPlAb"为针对TM180varl的抗体并且IgM阴性对照为小鼠 IgGl同种型对照。
[0545] 图5:交叉反应性PfEMPl抗体不识别人IgM。a)用于识别人IgM的ELISA。阳性 对照为抗-人IgM抗体。显示来自一式三份的孔的光密度（0D)值的平均值和SD。b)在有 和无人IgM的情况下生长的并且以抗-TM284varl抗体染色的IT/PAR+寄生虫的流式细胞 术。
[0546] 图6:对IgM的选择获得与PfEMPl抗体交叉反应的形成玫瑰花结的感染的红细 胞。a)用抗-人IgM包被的Dynabeads选择适应培养的肯尼亚分离株9197三次。通过流 式细胞术比较未选择的和选择的系显示：IgM_选择的寄生虫被针对HB3var6的交叉反应性 PfEMPl抗体识别。b)双染（检测PfEMPl抗体的AlexaFluor488抗-兔IgG和检测抗-人 IgM的AlexaFlu〇r594抗-小鼠 IgG)的IFA显示相同的感染的红细胞亚群既结合IgM也结 合HB3var6抗体。
[0547] 图7.通过PfEMPl抗体调理和诱导吞噬作用。在与单核细胞系Thp-Ι孵育之前， 用溴化乙锭染色并用PfEMPl抗体调理感染的红细胞。通过流式细胞术检测吞噬感染的红 细胞的Thp-Ι细胞。a)寄生虫株TM284b)寄生虫株HB3R+C)寄生虫株IT/R29d)寄生虫株 TM180。数据显示为以兔抗-人红细胞抗体调理的阳性对照的百分数。"非Ros类型A"阴 性对照由针对HB3var3 (不参与形成玫瑰花结的PfEMPl变体）的抗体组成。HB3R+寄生虫 培养物包括表达HB3var3的感染的红细胞亚群（参见表S1)，其解释了为何在此种情况下诱 导了吞噬作用。"对照兔IgG"为由来自未免疫的兔的纯化的IgG组成的阴性对照。
[0548] 图8:来自ITvar60变体的DBL结构域。下划线的区域表明产生的重组蛋白。缩 略形式如对于图la的。
[0549] 图9:通过抗-DBL抗体抑制形成玫瑰花结。玫瑰花结抑制测定以确定各种 ITvar60PfEMPl抗体对IT/PAR+寄生虫的剂量依赖性效果。将数据与无加入的抗体，在玫瑰 花结中包含至少40%的感染的红细胞的对照相比较。显示一式三份值的平均值和标准偏 差。
[0550] 图10:通过ITvar60抗体的感染的红细胞的调理和吞噬作用。在与单核细胞系 Thp-Ι孵育之前，将感染的红细胞用溴化乙锭染色和用PfEMPl抗体调理。通过流式细胞术 检测吞噬感染的红细胞的Thp-Ι细胞。
[0551] 图11:针对结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫（株HB3R+第1列，株TM284第2 列，株9197IgM+第3列）测试的针对ITvar60的不同结构域的抗体。通过流式细胞术评 估表面反应性，其中每个点图的右上象限为检测的阳性的感染细胞。阳性对照是针对各个 寄生虫株的变体-特异的抗体（首行）。阴性对照是未免疫的兔IgG(底行）和针对来自 不结合IgM的变体（ITvar9)的结构域的抗体。抗-ITvar60的DBL4e识别全部三株，而 抗-ITvar60 的 DBL5 ε 和抗-ITvar60 的 DBL2 γ 仅识别株 TM284。
[0552] 图12:针对不结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫（株TM180第1列，株SA075第 2列，株IT/R29第3列，株Muzl2第4列）测试的针对ITvar60的不同结构域的抗体。通 过流式细胞术评估表面反应性，其中每个点图的右上象限为检测的阳性的感染细胞。阳性 对照是针对各个寄生虫株的变体-特异的抗体（首行）。阴性对照是未免疫的兔IgG(底 行）。针对ITvar60结构域的抗体不识别这些寄生虫株中的任一个。
[0553] 图13:通过与年龄和入院时间匹配的对照（CM-对照）相比较的来自患有重症 (脑）疟疾（CM-病例）年轻肯尼亚儿童的血浆样品识别活的IT/PAR+感染的红细胞（表达 ITvar60抗原）的病例对照研究。数据来自流式细胞术;MFI:平均荧光强度。
[0554] 图14:通过与年龄和入院时间匹配的对照（CM-对照）相比较的来自患有重症 (脑）疟疾（CM-病例）年轻肯尼亚儿童的血浆样品识别活的IT/R29感染的红细胞的病例 对照研究。数据来自流式细胞术；MFI:平均荧光强度。
[0555] 图15:通过与年龄和入院时间匹配的对照（CM-对照）相比较的来自患有重症 (脑）疟疾（CM-病例）年轻肯尼亚儿童的血浆样品识别活的SA075R+感染的红细胞的病例 对照研究。数据来自流式细胞术;MFI:平均荧光强度。
[0556] 图16:A:来自对表达HB3var6的寄生虫测试的重症疟疾病例的血浆；B:来自对表 达HB3var6的寄生虫测试的无并发症疟疾对照的血浆。
[0557] 图17:A:来自对表达SA075varl的寄生虫测试的重症疟疾病例的血浆；B:来自对 表达SA075varl的寄生虫测试的无并发症疟疾对照的血浆。
[0558] 图18:显示在用TM284varl免疫的小鼠中多克隆抗体应答的ELISA。
[0559] 实施例1
[0560] 材料和方法。
[0561] 寄生虫和寄生虫培养物
[0562] 将恶性疟原虫实验室株（HB3, Muzl2, IT/R29, IT/PAR+, TM180和TM284)在补充的 RPMI中培养[59]并如描述的关于形成玫瑰花结进行选择[60]。常规检查所有培养物以 排除支原体污染[61]。将寄生虫用针对MSPl，MSP-2和GLURP的引物基因分型[62]并且 与共享相同基因型但转录不同PfEMPl变体的IT/PAR+和IT/R29在遗传上区分开。使用 的其它寄生虫株是未选择的HB3和3D7(结合CD36)，IT/A4(结合CD36和ICAM-1)和对结 合人脑内皮细胞进行选择的三株（HB3-HBEC，3D7-HBEC和IT-HBEC，Claessens等人，在排 版中）。临床分离株来自喀麦隆（CAM1)，肯尼亚（KEN7，KEN14，KEN17,9197，SA075)，马里 (MAL27, MAL34, MAL43, MAL81, MAL103)和冈比亚（GAM627)。马里的分离株和 KEN7, KEN14 和KEN17为从之前的研究中冷藏保存的[30, 46]。在第一周期的体外生长中，检测除 KEN7, KEN14和KEN17 (第三周期）和9197和SA075 (其已在3-4个月的体外生长期间适于 培养、克隆和对形成玫瑰花结进行选择）之外的所有临床分离株。如描述的，通过用抗-人 IgM单克隆抗体（Serotec MCA1662)的免疫荧光测定（IFA)确定形成玫瑰花结的株的结合 IgM 的表型[38, 44]。
[0563] 道德声明
[0564] 依照赫尔辛基宣言进行来自疟疾患者的临床分离株（血液样品）的收集。知情 同意书获自患者的父母或监护人并且经洛锡安地区伦理审查委员会（Lothian Regional Ethical Review Committee) (LREC//2002/4/34)，KEMRI 伦理审查委员会（KEMRI Ethical Review Committee),网比亚政府/MRC实验室联合伦理委员会（Gambia Government/MRC Laboratories Joint Ethics Committee),卩客麦隆公共卫生部区域伦理委员会（Cameroon Ministry of Public Health regional Ethics committee)和巴马科大学的机构审查委员 会（University of Bamako Institutional Review Board)批准。由 BioGenes GmbH(柏 林，德国）根据对于保护用于科学目的的动物的1986年11月24日的欧盟准则（European Union guidelines)86/609/EWG和 1996年 3 月 18 日的欧洲协定（European Agreement)商 业上进行动物免疫。
[0565] Var基因表达图谱和var基因测序。
[0566] 如之前描述的[24]和表S1中描述的进行RNA提取和var基因表达分析。各个优 势的玫瑰花结-特异的var基因的全长序列源自来自以下的序列标签：a)从寄生虫基因组 数据库提取（在 http: //www. broadinstitute. org 的 HB3 和在 www. sanger. ac. uk 的 IT) b)使用针对上游和下游PfEMPl区域的简并引物，对Muzl2varl的PCR-步移，克隆和测序 [63]。c)使用小载体文库对TM284varl和TM180varl的PCR-步移，克隆和测序[20]。
[0567] RNA 印记
[0568] 如描述的[44]，以地高辛标记的RNA探针进行寄生虫的同基因型的形成玫瑰花结 和不形成玫瑰花结对的RNA提取和RNA印记。将来自各个寄生虫株的RNA与代表来自同源 玫瑰花结-特异var基因的一个DBL结构域的特异探针，以及用以检测所有var基因的外 显子II探针杂交。
[0569] 重组蛋白和多克隆抗体.
[0570] 如之前描述的生产重组蛋白[12]。对于各个玫瑰花结-特异的变体的 NTS-DBLla 重组蛋白的结构域边界如下：HB3var6Metl-Pro473 ;TM284varlMetl-Pro457 ; ITvar60Metl_Pro464 ;Muzl2varlMetl_Pro458 ;TM180varlMetl_Pro485。不形成玫瑰花结 的类型A PfEMPl变体HB3var3 (Metl-Pr〇468)用作对照。将各个蛋白用于免疫两只兔，所述 兔已经被预筛选以避免具有已有的针对人红细胞或痕原虫的天然抗体的动物。由BioGenes GmBH(柏林，德国）进行免疫，血清收集和总IgG纯化。
[0571] 免疫荧光测定（IFA).
[0572] 如描述的，用活的感染的红细胞以IFA测试免疫和免疫前血清[12, 44]。每一对免 疫的兔中，选择产生最亮的荧光信号并具有最低的背景的血清用于纯化总IgG。在所有情 况下，两种兔血清都产生阳性PfEMPl-染色，仅在染色强度上具有较小差异。
[0573] 流式细胞术。
[0574] 如用于IFA的，进行用于流式细胞术的染色[12,44]，只是使用Hoescht(l. 25μ g/ ml)替代DAPI以染色感染的红细胞并且在第二次孵育洗涤后加入50 μ g/ml岩藻多糖以破 坏玫瑰花结。用0.5 %多聚甲醒固定细胞，加入50 μ g/ml岩藻多糖以阻止玫瑰花结再形 成，并且将每个样品500,000个事件（6￥611丨8)在136〇1:〇11-0;[01^1180111^1?11流式细胞仪上 分析。
[0575] 玫瑰花结抑制实验。
[0576] 将在环形期的恶性疟原虫培养物与不同稀释度的抗体和对照孵育过夜，并且如 描述的在次日通过显微镜评价玫瑰花结形成[12]。
[0577] 吞噬作用测定。
[0578] 使用Thp-Ι细胞的吞噬作用实验是如之前描述的[12]，只是使用岩藻多糖 OOOyg/ml)用于纯化寄生虫和破坏玫瑰花结。阳性对照是用兔抗-人红细胞抗体 (ab34858, ABCAM, Cambridge, UK)调理的寄生虫培养物。Muzl2varl抗体不包括在吞噬作用 测定中，因为它们显示一些结合于未感染的红细胞的背景。
[0579] IgM ELISA。
[0580] 使用4°C过夜包被于ELISA平板的纯化的人IgM(5 μ g/ml，Rockland)测试PfEMPl 抗体与人IgM交叉反应的能力。在包含0.05%吐温20 (PBST)和5%牛奶的PBS中封闭 1小时后，将孔与在包含1%牛奶的PBST(PBSTM)中的10，1和0. lyg/ml的兔抗-NTS DBL1抗体孵育。室温孵育1小时后，用PBST洗涤孔并与在PBSTM中的1:10, 000抗-兔 IgG-HRP (Sigma)再孵育一小时。如上述的洗涤之后，通过根据制造商的使用说明将孔与底 物3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺二盐酸（Sigma)孵育显色并且在450nm波长测量吸光度。作 为阳性对照，以 1:100(10 μ g/ml)，1:1000(1 μ g/ml)和 1:10000(0. 1 μ g/ml)使用兔抗-人 IgM F(ab'）2-HRP(DAK0)。
[0581] 在缺乏IgM时PfEMPl抗体的表面交叉反应性。
[0582] 将汇集的人血清通过三个连续轮次的在具有等量的抗-人IgM(y_链特异 的）_琼脂糖（Sigma A9935)的旋转轮（15rpm)上室温孵育45分钟耗尽IgM。通过使用 抗-人IgM单克隆抗体的蛋白质印迹确认吸收的血清中IgM的缺乏。IT/PAR+寄生虫在 具有10%耗尽IgM的血清的补充RPMI中从环形期生长过夜，并且将等分部分（阳性 对照培养物）与lmg/ml的人IgM(Calbiochem)在37°C孵育1小时。随后洗漆IgM-阴 性和IgM-阳性培养物并通过如上文描述的流式细胞术测试交叉反应性PfEMPl抗体对 TM284varlNTS-DBLla 的表面反应性。
[0583] 对IgM-阳性的感染的红细胞的选择。
[0584] 如描述的使用包被有小鼠抗-人IgM抗体（Serotec MCA1662)的M_450Epoxy Dynabeads(Dynal)对IgM-阳性的感染的红细胞选择寄生虫[64]。
[0585] 软件。
[0586] 使用Flowjo软件（Tree Star Inc.)分析流式细胞术数据，使用DNAstar Lasergene(DNAstar Inc.)进行DNA序列分析并且使用Prism(GraphPad软件）进行图像和 统计分析。
[0587] 治疗性 mAbs。
[0588] 已经生产了对PfEMPl变体，TM284varl的表位具有特异性的单克隆抗体。这些抗 体将被用于研究开发治疗性单克隆抗体混合物以反转玫瑰花结形成的可能性。
[0589] 结果
[0590] 鉴定由形成玫瑰花结的寄生虫转录的PfEMPl变体
[0591] 为了鉴定形成玫瑰花结的寄生虫的关键表面抗原，体外培养源自不同国家的五 种恶性疟原虫实验室株（三种结合IgM,两种不结合IgM)，选择形成玫瑰花结的表型。对于 各个株，平行选择同基因型的玫瑰花结阳性（R+)和玫瑰花结阴性（R-)的群体[20]，并且 通过分析短PfEMPl序列标签检查它们的var基因转录图谱[24]。各个株中的玫瑰花结-特 异的变体被鉴定为由形成玫瑰花结的群体（包括所有检测的var基因序列中的三分之一到 二分之一）转录的优势var基因，其在不形成玫瑰花结的群体中缺乏/罕见（表S1中显示 实例）。各个优势玫瑰花结-特异的var基因的全长序列获自如在方法中描述的序列标签。 形成玫瑰花结的变体大多数是类型A(图la)，其由保守的上游序列（UpsA)和与重症疟疾 相关的特有的N-末端结构域类型（称为DBL α 1或"Cys2"）的存在限定[18, 24, 26]。来自 结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的变体形成明显的共享罕见的PfEMPl结构的亚类，其 包含在PfEMPl (DBL ε和DBL ζ )中很少发生的结构域的三联体（triplet) [6]。对于非免疫 IgM的结合位点位于这些DBL ε / ζ结构域之间[43, 44] (AG和JAR，未发表的数据）。结合 IgM的结构域三联体通过至少一个其它结构域（DBLY)连接于典型的类型A PfEMPl头部结 构[16, 18, 45](图la)。来自类型A PfEMPl变体的DBL α结构域落在基于序列同源性的 八个亚类（DBLa 1. 1至DBLa 1.8)中[6]。之前描述的形成玫瑰花结的变体（ITvar9，Palo Alto varO和PF13_0003)[11，20,21]都是DBLal.6亚类的。在此鉴定的玫瑰花结-特异 的变体是 DBL a 1. 5 (HB3var6 和 Muzl2varl)，DBL a 1. 8 (TM284 和 ITvar60)或 DBL a 2 (非类 型 A 的类型，TM180varl)之一 [6]。
[0592] 尽管有观察到的PfEMPl结构的相似性，但是在来自不同寄生虫株的，具有显示 介于 38.9% (ITvar60:TM180varl)和 62.6% (ITvar60:TM284varl)之间的成对的氨基酸 同一性的介导玫瑰花结的结构域（NTS-DBLa ) [11，20, 21]的玫瑰花结-特异的变体间存在 相当多的序列多样性（表S2)。除了 TM284varl和ITvar60的第一 CIDR结构域（82. 2% ) 和HB3var6和Muzl2varl的第一 CIDR结构域（81. 1% ;参见对于所有结构域类型的成对的 氨基酸同一性的表S2-S7)外，来自形成玫瑰花结的变体的其它细胞外结构域不显示高水 平的氨基酸同一性。
[0593] 通过RNA印记证实玫瑰花结-特异变体的正确鉴定（图lb ;之前对TM284显示的 [44])。对于各个寄生虫株，玫瑰花结-特异的PfEMPl探针在形成玫瑰花结的寄生虫（箭 头标出的）中检测到转录物，所述转录物在同基因型的不形成玫瑰花结的寄生虫中是缺乏 /弱的。使用鉴定所有var基因的外显子II探针显示不形成玫瑰花结的寄生虫中其它转录 的var基因的存在（图lb)。
[0594] 为了引起针对形成玫瑰花结的PfEMPl变体的抗体，将各个玫瑰花结-特异变体 的N-末端NTS-DBLa区域在大肠杆菌中表达为重组蛋白[12]，重组蛋白在还原条件下迁 移率的改变显示在这些富半胱氨酸的蛋白中存在二硫键（图lc)。选择NTS-DBLa是因为 在之前的研究中，它是结合红细胞以造成形成玫瑰花结的结构域[20, 21]，并且针对此区 域的变体-特异的抗体在抑制形成玫瑰花结方面最有效[12, 21]。
[0595] PfEMPl抗体针对实验室-适应的恶性疟原虫株的功能活性和交叉反应性
[0596] 使用重组蛋白免疫兔[12]，以诱导抗体以确定来自不同恶性疟原虫株的玫瑰花 结-特异的PfEMPl变体是否共享共有表位。免疫荧光测定（IFA)显示，针对五种变体中 的每个的抗血清产生点状的荧光，其表征具有同源寄生虫株的活的感染的红细胞表面上的 PfEMPl抗体（图2a中显示带有ITvar60抗体的IT/PAR+寄生虫）。通过IFA，兔免疫前血 清和未免疫的兔对照血清是阴性。来自各个抗血清的纯化的总IgG的滴定度显示一直到低 浓度针对同源寄生虫的特异表面反应性（滴定终点为0. 02-1. 56 μ g/ml的总IgG，图2b和 图2c，加粗的矩形）。
[0597] 重要的是，PfEMPl抗体也显示与异源的形成玫瑰花结的株的表面反应性。这在 结合IgM的形成玫瑰花结的株（HB3R+，TM284和IT/PAR+)和它们的抗体（分别针对变 体HB3var6，TM284varl和ITvar60)之间是尤其显著的，对于异源的抗体：寄生虫组合 具有〈10 μ g/ml的表面反应性（图2c)。不结合IgM的形成玫瑰花结的株（Muzl2, TM180 和IT/R29)也被针对结合IgM的形成玫瑰花结的变体的抗体识别，尽管需要更高的浓度 (100-400 μ g/ml的总IgG，图2c)。尽管这些浓度高，但它们仍然表现相当大的全血清的稀 释度（相当于1/100至1/25的稀释度），因此，它们在体内是可能达到的。
[0598] 针对形成玫瑰花结的PfEMPl变体的抗体不识别对其它粘附表型进行选择的寄生 虫（图2c)，所述表型包括结合⑶36或ICAM-1 (表达类型B和C var基因的寄生虫）或结 合脑内皮细胞（表达类型A和B/A var基因的替代亚群的寄生虫）。因此，仅具有共享的 粘附表型的寄生虫共享由针对PfEMPl的交叉反应性抗体识别的表位。
[0599] 通过抗体体内表面识别活的感染的红细胞很有可能导致通过效应子机理比如吞 噬作用或补体介导的细胞溶解的寄生虫清除[13]。玫瑰花结-抑制也可以是防止病理的 微血管阻塞而在体内所需的。我们因此检查图2中显示的由PfEMPl抗体导致的交叉反应 性表面识别，是否转化为效应子功能中的交叉反应性。除了尽管有良好的表面反应性（图 2c)，但不被抑制的TM180(图3a，褐色曲线）之外，PfEMPl抗体显示针对同源寄生虫株的 有效的玫瑰花结-抑制（图3a，红色曲线），对形成玫瑰花结的50%抑制浓度（IC50)为介 于0. 8-8 μ g/ml之间。寄生虫株TM284, IT/PAR+和TM180都显示通过异源抗体的玫瑰花结 抑制（图3a，蓝色曲线）。在更高的浓度（lmg/ml的总IgG)，玫瑰花结抑制中的交叉反应 性甚至更显著，其中由针对结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl变体中的至少一个的抗体 抑制所有株（图3b)。
[0600] 还显示针对来自结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的PfEMPl变体的抗体通过诱 导同源和异源的感染的红细胞的吞噬作用而具有交叉反应性调理效果（图3c和图7a和 b)。相比之下，针对来自不结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的PfEMPl变体的抗体，仅有 效调理同源寄生虫（图7c和d)。
[0601] 针对恶性疟原虫临床分离株的抗-PfEMPl抗体的功能活性和交叉反应性
[0602] 已经显示在恶性疟原虫实验室株中交叉反应性PfEMPl抗体的表面识别和生物效 应子功能，我们使用来自喀麦隆，肯尼亚，马里和网比亚的新鲜临床分离株探究交叉反应 性的地理范围。临床分离株中形成玫瑰花结的感染的红细胞的比例在分离株之间有变化 (15-40%)，没有如经历对形成玫瑰花结进行重复选择的实验室株那么高。选择临床分离 株是因为它们在玫瑰花结中包含至少15%的感染的红细胞，并且显示所有的测试分离株。 解冻十株新鲜的临床分离株，并且发现除一个之外的全部都为结合IgM的形成玫瑰花结的 表型（通过用IFA检测感染的红细胞表面的IgM测试）。这与之前的显示来自肯尼亚儿童 的临床分离株中玫瑰花结频率和IgM结合的强的正相关的数据一致[38]。
[0603] 通过用IFA的活的感染的红细胞的点状荧光（类似于图2a)和通过流式细胞术 (图4a)检测所述组的PfEMPl抗体的表面反应性。弓丨人注意的是，针对两种PfEMPl变体 (HB3var6和TM284varl)的抗体足以提供针对所有地理位置上多样的结合IgM的形成玫瑰 花结的分离株的表面反应性（图4b和c)。在各个分离株中抗-PfEMPl阳性和IgM阳性细 胞的比例紧密相配（皮尔森相关性（Pearson Correlation) r = 0· 934, P = 0· 006 ;图4c, 将IgM阳性细胞与阳性PfEMPl抗体染色的细胞相比较）。在四株分离株中也观察到玫瑰 花结抑制，当使用抗 -PfEMPl抗体的组合（pool)时，增加到六株分离株（图4b)。不结合 IgM的临床分离株（MAL103)和两株最近适应培养的选择玫瑰花结的不结合IgM的肯尼亚 株（9197和SA075)不被PfEMPl抗体识别（图4b)。因此，在临床分离株中，仅在显示结合 IgM的形成玫瑰花结的表型的寄生虫中看到PfEMPl抗体的交叉反应性。
[0604] 我们考虑了上述结果可以由PfEMPl抗体与人IgM (其结合来自培养基的感染的红 细胞表面）交叉反应而不是由于PfEMPl自身内共享的表位解释的可能性。然而，在ELISA 中，所述PfEMPl抗体不识别人IgM(图5a)，并且当寄生虫在IgM缺乏的情况下生长时，异 源寄生虫株的表面反应性得以维持（例如，如在图5b中显示的，在IgM缺乏的情况下，IT/ PAR+寄生虫显示与TM284varl抗体的表面反应性）。
[0605] 进一步通过采用最近适应培养的显示不结合IgM的形成玫瑰花结的肯尼亚株 9197和SA075 (图4b)，使用包被有抗-人IgM抗体的磁珠选择它们对IgM的结合，显示在 不同寄生虫分离株中，存在结合IgM的形成玫瑰花结的变体。三轮选择后，获得结合IgM 的形成玫瑰花结的寄生虫群体，其被针对HB3var6的抗体（9197IgM-选择的，图6)或针 对TM284varl的抗体（SA075IgM-选择的，数据未显示）识别。双染显示感染的红细胞的 相同的亚群既结合IgM也结合HB3var6抗体（图6b)。
[0606] 讨论
[0607] 在此工作中，研究了由代表两种主要的形成玫瑰花结表型的恶性疟原虫株表达的 PfEMPl变体。发现结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫表达独特亚类的类型A PfEMPl变体， 所述变体的特征为DBL α 1. 5或DBL α 1. 8N-末端结构域和紧邻跨膜区的DBL ε /DBL ζ结构 域的三联体。当针对同源寄生虫测试时，针对结合IgM的形成玫瑰花结的变体的Ν-末端 区域产生的抗体是玫瑰花结形成的有效抑制剂（对于玫瑰花结的抑制IC50 < 1 μ g/ml的 总IgG，图3a)，证实这些变体在玫瑰花结形成中的作用。此外，针对结合IgM的形成玫瑰 花结的变体的抗体是交叉反应性的，显示全世界范围内共享相同粘附表型的不同寄生虫 分离株的活的感染的红细胞的表面识别和玫瑰花结抑制。相比之下，如之前描述的，针对 来自不结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的类型A PfEMPl变体产生的抗体是变体特异的 [11，20, 21]。这些数据表明不是所有类型A PfEMPl变体诱导交叉反应性抗体，并且类型 A变体的某些亚类可以是特别有交叉反应性的。据我们所知，这是第一次报道描述成功诱 导针对严重儿童期疟疾中涉及的PfEMPl变体的广泛交叉反应性表面识别抗体。已经描述 针对孕期疟疾中涉及的var2CSA的广泛交叉反应性抗体[47, 48]，然而，var2CSA是比在非 跨越菌株的类型A PfEMPl变体中看到的具有更多限制的序列多样性的跨越株的var基因 的独特例子[49]。
[0608] 这里详细表征了三种来自结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的PfEMPl变体：来 自株HB3的HB3var6,来自株TM284的TM284varl和来自株IT/PAR+的ITvar60。之前，已 经在两种其它源自IT/FCR3的寄生虫系中将ITvar60与形成玫瑰花结联系起来[50, 51]， 并且这里被证实为结合IgM的形成玫瑰花结的变体。如对PfEMPl预期的，尽管在PfEMPl 结构方面有它们的相似性（图1)，但是三种不同的结合IgM的形成玫瑰花结的变体显示 氨基酸序列方面相当大的多样性（表S2-S7)。在近期测序的恶性疟原虫株IGH的基因组 (IGHvarl2, IGHvar22和IGHvar24[6])中可以看到具有相同的"形成玫瑰花结的IgM"类型 的结构域结构的其它变体。此外，ITvar60样变体存在于测序的来自巴布亚新几内亚的恶 件拒原虫株D10(http://www. broadinstitute. org)中。总合在一起，这些数据提示具有 形成玫瑰花结的IgM类型的PfEMPl结构的变体普遍存在于地理位置上不同的恶性疟原虫 分离株中。目前的研究的一个局限是没有充足的来自临床分离株的材料用以鉴定和测序由 形成玫瑰花结的寄生虫转录的PfEMPl变体，以允许与实验室株比较。来自两个适应培养的 临床分离株的结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的选择（图6)将允许我们进一步详细研 究它们的var基因。玫瑰花结-特异的变体的正确鉴定（表S1)和全长var基因的测序对 于不具有可用的全基因组序列的分离株仍然是费力和耗时的过程。然而，来自形成玫瑰花 结的临床分离株的PfEMPl结构和序列更广泛的研究对于这里记载的抗体交叉反应性怎样 涉及序列多样性和PfEMPl类型的全面理解将是关键的。
[0609] 不结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的之前的研究鉴定寄生虫形成玫瑰花结的 配体为PfEMPl变体（ITvar9, Palo Alto varO和PF13_0003)，其显示DBLa结构域的八种 可能的亚类中的一个，DBL a 1.6 [11，20, 21]。相比之下，这里描述的类型A形成玫瑰花结 的变体具有 DBL a 1. 5 (HB3var6 和 Muzl2varl)或 DBL a 1. 8 (ITvar60 和 TM284varl)之一。 临床分离株显示与HB3var6抗体（DBL α 1. 5类型）或TM284varl抗体（DBL α 1. 8)之一的表 面反应性，但很少与两种抗体都有交叉反应性（图4b)。这些数据提示这两种主要DBL α 1 类型可以构成不同地域分离株中结合IgM的形成玫瑰花结的表型的基础，尽管显然需要 进一步序列信息以证实该想法。TMISOvarl不同于其它玫瑰花结-相关变体，因为其具有 UpsB序列和DBLa 2亚型，并且这可以代表形成玫瑰花结的表型的不同类型，其需要进一 步研究。综合本研究的研究结果和之前发表的工作，我们猜测，具有DBL a 1. 5, DBL a 1. 6或 DBL a 1. 8结构域的所有类型A PfEMPl变体可以是玫瑰花结-介导的变体。如果是正确的， 这将表明来自每个恶性疟原虫分离株的类型A var基因组库的很大比例（大约三分之一到 二分之一）可以编码形成玫瑰花结的变体[6]。这将表示由寄生虫在粘附表型中的大量投 入，其对寄生虫适合度的益处尚且未知。
[0610] Rask等人[6]近来提供通过审视"结构域盒"（通常一起存在的PfEMPl结构域组 合）评估PfEMPl类型的替代的方式。他们鉴定了在类型A var基因中常见的七个结构域 盒[6]。我们的数据提示，这些结构域盒中的两个与形成玫瑰花结的表型相关联：结构域盒 16，特征为如在耶3 ￥&冰中看到的连接于(：101^6的〇81^1.5/6，和结构域盒11，特征为 如在ITvar60和TM284varl看到的连接于CIDRP2和DBLY7的DBLa 1.8。尽管需要更多 的工作以概括这些结果并确定特定DBLa亚类和结构域盒是否总是与形成玫瑰花结相关 联，但是我们的数据代表在将PfEMPl序列与寄生虫粘附表型相关联方面的重要步骤。
[0611] 目前的数据的一个无法解释的特征是，尽管两组变体中有明显相当的氨基酸多样 性，但是为何结合IgM的形成玫瑰花结的变体在由指示共享的表位的PfEMPl抗体识别方面 显示交叉反应性，然而不结合IgM的变体不显示。我们考虑了 IgM本身可以是交叉反应性 的原因的可能性，然而我们展示在ELISA中PfEMPl抗体不识别人IgM,并且当寄生虫在缺 乏人IgM的情况下生长时，PfEMPl抗体仍然识别异源株（图5)。其可能是，小的序列基序 (比如由Rask等人[6]描述的仅存在于结合IgM的变体中的同源性区块中的一种）解释了 交叉反应性。将需要结合IgM的形成玫瑰花结的变体的另外的实例以研究此种可能性。备 选地，可能IgM对PfEMPl的结合影响其三级或四级结构，使其更易接近针对分子的N-末 端的抗体。然而，最近的数据提示，IgM结合使得PfEMPl较不易接近特异抗体[41]。
[0612] 之前关于PfEMPl的工作提示，抗体应答主要是变体特异的[10, 11，12]，结构域之 间有一点交叉反应性[52]。然而，其它报道提示，交叉反应性抗体可以存在[53, 54, 55]并 且可以在抗原变异过程中的组织PfEMPl表达中发挥作用[56]。对临床疟疾的免疫性的逐 步获得是否与针对很多不同变体类型的抗体的广泛的组库的获得相关，或是否由于交叉 反应性应答的产生仍未解决。尤其在威胁生命的疟疾的情况下，针对PfEMPl的抗体的作 用不清楚。已知儿童在少量感染后变得对重症疟疾免疫[13, 57]，并且重症疟疾与获得针 对普遍识别的变体的抗体相关[14, 15, 58]。目前的想法提示重症疟疾由表达变体表面抗原 的抗原限制的亚类[2](可能由类型A var基因编码[26, 27])的寄生虫引起。将预期此种 寄生虫的"抗原限制的"亚类具有显示保守的序列和/或保守的表位的变体表面抗原（可 能是PfEMPl)，所述保守的序列和/或保守的表位将被显示与不同寄生虫株的表面反应性 的抗体识别。这里报道的具有共享的构成毒力相关表型基础的表位的变体的亚类的研究结 果可以代表寄生虫的此种"抗原限制的"亚类的第一种实例。
[0613] 总的来说，这些数据显示，针对来自结合IgM的形成玫瑰花结的实验室株的类型 A PfEMPl变体亚类产生的抗体对共享相同的粘附表型的全球的寄生虫分离株有广泛的交 叉反应性。具有共享的毒力相关表型的恶性疟原虫分离株中共享的表位的这种发现可以构 成儿童在少量感染后获得对威胁生命的疟疾的免疫性的流行病学观察的基础[13, 57]。最 重要的是，通过用构成毒力表型基础的关键PfEMPl变体免疫诱导广泛的交叉反应性抗体 的能力，提示设计干预措施以预防重症疟疾是现实的目标。
[0614] 实施例2
[0615] 实施例1中提供的数据集中于针对来自结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl变体 的N-末端区域（NTS-DBLla)的抗体。实施例2中提供的实验，研究针对其它来自这些 PfEMPl变体的DBL结构域的抗体是否也将显示交叉反应性。这将不能从结构域之间的氨基 酸相似性（其是低的，大部分介于20-40%的氨基酸同一性之间）的研究中预测。
[0616] 材料和方法
[0617] 如在主要的手稿中描述的，在大肠杆菌中制备重组蛋白并且在兔中产生抗体。通 过如在实施例1中描述的流式细胞术，玫瑰花结抑制和吞噬作用诱导评估表面反应性。
[0618] 结果：
[0619] 针对来自ITvar60变体的所有DBL结构域（图1A和图8以红色显示的下部区域） 并且也对来自HB3var6变体的DBL4e和DBL5e (FiglA)产生抗体。
[0620] 测试针对同源寄生虫株（IT/PAR+)的ITvar60抗体
[0621] 测试ITvar60抗体针对同源寄生虫株（IT/PAR+)的活的感染的红细胞的表面反应 性。除了针对DBL3(的抗体（其仅在100 μ g/ml产生表面反应性）以外，所有抗体显示 点状荧光（PfEMPl的特征），低至低浓度（参见表1)。针对ITvar60的其它结构域的抗体 抑制形成玫瑰花结，尽管没有一个如NTS-DBL1 α抗体那样有效（参见图10和表1)。还测 试了 ITvar60抗体诱导感染的红细胞的吞噬作用的能力（在体内可能重要的功能）。针对 ITvar60的DBL2 γ的抗体能够调理感染的红细胞并类似于NTS-DBLla抗体诱导吞噬作用 (参见图11下图）。有趣的是，尽管有良好的表面反应性和玫瑰花结抑制能力，但是针对 ITvar60的DBL4 ε和DBL5 ε的抗体不能够调理和诱导吞噬作用。
[0622] 表1在针对IT/PAR+寄生虫的不同测定中ITvar60Abs的有效性。
[0623]
【权利要求】
1. 恶性痕原虫（Plasmodium falciparum)红细胞膜蛋白-1 (PfEMPl)抗原或其一个或 多个片段，其用于产生免疫应答的用途。
2. 如权利要求1所述的用于权利要求1所述用途的PfEMPl抗原，其中所述PfEMPl抗 原是源自IgM形成玫瑰花结的恶性疟原虫变体。
3. 如权利要求1或2所述的用于权利要求1或2所述用途的PfEMPl抗原，其中所述 PfEMPl抗原选自由以下组成的组： (i) HB3var6 ； (ii) TM284varl ;和 (iii) ITvar60〇
4. 如权利要求3所述的用于权利要求3所述用途的PfEMPl抗原，其中所述PfEMPl抗 原HB3var6获自恶性疟原虫株HB3 ;所述PfEMPl抗原TM284varl获自恶性疟原虫株TM284 并且所述PfEMPl抗原ITvar60获自恶性疟原虫株IT/PAR+。
5. 如任一项在前权利要求所述的用于任一项在前权利要求所述用途的PfEMPl抗原， 其中所述PfEMPl抗原由以下编码： (i) 以SEQ ID N0S1，2, 3, 4, 5或6或其片段给出的序列中的一种或多种； (ii) 相对由SEQ ID N0S: 1，2, 3, 4, 5或6或其片段提供的序列中的一种或多种显示至 少80 %同源性或同一性的序列。
6. 如任一项在前权利要求所述的用于任一项在前权利要求所述用途的PfEMPl抗原， 其中所述PfEMPl抗原包含PfEMPIDuffy结合样（Duffy Binding Like) (DBL)结构域。
7. 如权利要求6所述的用于权利要求6所述用途的PfEMPl抗原，其中所述DBL结构 域是选自由以下组成的组的一种或多种： (i) HB3var6, TM284varl 和 / 或 ITvar60NTS-DBLl α 结构域； (ii) ITvar60DBL4 ε 结构域；和 (iii) ⑴和/或（ii)的（免疫原性/抗原性）片段。
8. 如任一项在前权利要求所述的用于任一项在前权利要求所述用途的PfEMPl抗原， 其中所述免疫应答 (i) 有效针对疟原虫、恶性疟原虫的不同株和分离株； (ii) 包含下述抗体，所述抗体对所述HB3var6、TM284varl和/或ITvar60PfEMPl抗 原显示一定程度的亲和力、选择性和/或特异性和对除了所述HB3var6、TM284varl和/或 ITvar60PfEMPl抗原之外的PfEMPl抗原显示一定程度的亲和力、选择性和/或特异性。
9. 一种疫苗或疫苗组合物，其包含一种或多种选自由以下组成的组的PfEMPl抗原： (i) PfEMPl抗原或其一个或多个片段； (ii) 结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl ; (iii) PfEMPl 变体 HB3var6 ; (iv) PfEMPl 变体 TM284varl ; (v) PfEMPl 变体 ITvar60 ; (vi) PfEMPlDBL 结构域； (vii) NTS-DBLla 结构域； (viii) DBL4 ε 结构域； (ix) PfEMPl 变体 HB3var6 的 NTS-DBL1 α 结构域； (x) PfEMPl 变体 TM284varl 的 NTS-DBL1 α 结构域； (xi) PfEMPl 变体 ITvar60 的 DBL4 ε 结构域；和 (x)(i)-(ix)中任一个的（免疫原性/抗原性）片段。
10. 如权利要求9所述的疫苗或疫苗组合物，其用于产生免疫应答的用途。
11. 如权利要求10所述的用于权利要求10所述用途的疫苗或疫苗组合物，其中在人 或青少年人中产生所述免疫应答。
12. 如权利要求9所述的疫苗或疫苗组合物，其用于治疗或预防疟疾或重症疟疾。
13. 对选自由以下组成的组的PfEMPl中的一种或多种显示一定程度的亲和力、特异性 和/或选择性的抗体： (i) PfEMPl抗原或其一个或多个片段； (ii) 结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl ; (iii) PfEMPl 变体 HB3var6 ; (iv) PfEMPl 变体 TM284varl ; (v) POEMPl 变体 ITvar6〇 ; (vi) PfEMPlDBL 结构域； (vii) NTS-DBLla 结构域； (viii) DBL4 ε 结构域； (ix) PfEMPl 变体 HB3var6 的 NTS-DBL1 α 结构域； (x) PfEMPl 变体 TM284varl 的 NTS-DBL1 α 结构域； (xi) PfEMPl 变体 ITvar60 的 DBL4 ε 结构域；和 (x)(i)-(ix)中任一个的（免疫原性/抗原性）片段。
14. 如权利要求13所述的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
15. 如权利要求13或14所述的抗体，其用于 (i) 治疗或预防痕疾和/或重症痕疾；和/或 (ii) 预防疟疾中的红细胞玫瑰花结形成。
16. -种诊断疟疾或重症疟疾的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 提供来自要被测试的受试者的样品；和 (b) 将（a)中提供的样品与根据权利要求13或14所述的抗体在足以允许所述抗体和 存在于所述样品中的任何PfEMPl抗原之间的结合的条件下接触； (c) 任选地移除未结合的抗体；和 (d) 检测抗体/PfEMPl抗原复合物的存在； 其中检测出抗体/PfEMPl抗原复合物指示受试者患有疟疾和/或重症疟疾，或处于发 展为痕疾和/或重症痕疾的风险中。
17. 如权利要求16所述的方法，其中所述受试者是人受试者或青少年人受试者。
【文档编号】A61K39/015GK104093417SQ201280067766
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年11月22日 优先权日:2011年11月22日
【发明者】简·亚历山德拉·罗, 阿什法克·古姆拉 申请人:爱丁堡大学董事会