制备忍冬纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含该提取物的组合物的制作方法

制备忍冬纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含该提取物的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含有该提取物的组合物。忍冬的纯化提取物显示出在重度败血症CLP模型试验中有效的抗败血症活性，对MODS的效果，和对各种促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、HMGB-1等的抑制效果，同时，在与可商业获得的抗菌剂、例如广谱抗生素组合的情况下，它还出乎本领域技术人员意料地显示出对败血症和败血性休克的治疗的协同效应，因此，它可以作为药物和健康功能食品用于治疗和预防败血症和败血性休克。
【专利说明】制备忍冬纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和 败血性休克的含该提取物的组合物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备忍冬（LoniceraJaponicaTHUNBERG)的纯化提取物的方法 以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含有该提取物的组合物。

【背景技术】
[0002] 重度败血症是致命的疾病，其具有由伴随有器官功能衰竭和灌注不足的败血症病 情引起的高死亡率，所述灌注不足导致系统需氧和供氧之间的不平衡，这迅速进展成败血 性休克和多器官功能障碍综合征（MODS)。该疾病的典型症候群为高热、低体温症、正性变 时（positivechronotrophy)、增加的心输出量、降低的体循环抵抗力、呼吸性碱中毒、不正 常增加或减少量的WBC等，这引起导致致命死亡的迅速的器官功能障碍。已经报道患有重 度败血症和败血性休克的患者的死亡率在美国为29%，在欧洲为27%，这是重症监护病房 的患者中的主要死亡原因（Jean-LouisVincent，EdwardAbraham，TheLastlOOyearsof S印sis，AmJRespirCritCare]^(1，2006，173，第256-263页）。在美国，每年多于750000 名患者患有败血性综合征，其中每年多于210000患者死于该疾病。而且，在欧洲在重症监 护病房住院的约37 %的患者患有重度败血症，15 %的患者患有败血性休克，在韩国由重度 败血症导致的死亡率为65%。
[0003] 败血症可能会因非传染性来源，例如除传染性来源如细菌、病毒、真菌等之外 的创伤而恶化，并加重成败血性休克或MODS(Deitch，E.A.Multipleorganfailure. Pathophysiologyandpotentialfuturetherapy,Ann.Surg. ,1992,216 (2),第 117-134 页）。败血症发病机理的最明显的特征为在初始阶段体内炎症系统的过度活化，即识别外 来污染物如细菌内毒素并被该外来污染物激活的促炎性细胞因子的过度分泌，这被称为 "细胞因子风暴"并从败血症发病起维持10至12小时。在细胞因子中，在血液中在初始 阶段最开始所检测到的细胞因子TNG-a不仅刺激其他细胞因子如IL-5、IL-8的分泌，也 促进中性粒细胞和血管内皮细胞中的细胞黏附分子以及导致炎症反应加重的其他细胞因 子的表达（WadaH.等人，Increasedplasmalevelofinterleukin_6indisseminated intravascularcoagulation,BloodCoagul.Fibrinolysis, 1993,4(4);第 583-590 页； Qin,S.等，RoleofHMGBlinapoptosis-mediatedsepsislethality,J.Exp.Med. ,2006, 203 (7)，第1637-1642页）。从淋巴细胞和单核细胞分泌的炎性细胞因子IL-6在败血症发病 后 6 小时达到最高水平（Hotchkiss，R.S.，等，Apoptosisandcaspasesregulatedeath andinflammationinsepsis.Nat.Rev.Immunol. ,2006,6(11),第 813-822 页）。
[0004] 因此，已经有抑制伴随并刺激炎症的炎性介质如TNF-a、IL-6、IL-1、IL-8等的 大量尝试，例如抗炎剂如NSAIDS;或者抑制细胞因子的释放的大量尝试，例如TLR4选择性 抑制剂如来自TakedaPharm.CompanyLimited的TAIC-242?和来自EisaiCo.Ltd?的 Eritorail?。但是治疗具有一些缺点，例如有限的功效等。
[0005] 最近美国和欧洲批准的重度败血症的单一治疗剂Xigris?(Elilillyand company)已经用来治疗重度败血症，但是它也具有缺点，例如有限的适应症和功效、不良反 应如严重的出血或中风等（R.PhillipDellinger等，Importantissuesinthedesign andreportingofcinicaltrilasinseveresepsisasacutelunginjury,Journal ofCriticalCare.，23,第 493-499 页，2008 ;www.fda.gov。）
[0006] 因此，目前仍需要开发具有强效和较小毒性的新的抗败血症药物，并且尝试由在 韩国因为无毒性而频繁被开处方和使用的自然资源开发有效的药物。
[0007] 已经报道分布于韩国的忍冬的花包含木犀草素、肌醇、皂苷、单宁、异绿原酸、绿原 酸等（B.S.CHUNG等，Dohaehyangyakdaesajeon，Youngrimpress，第 939-940 页，1998)。
[0008] 但是，在以上所引用文献的任何一个中都未报道或公开忍冬的纯化花提取物对败 血症的治疗性效果或改善性效果，上述文献的公开通过引用并入本文。
[0009] 为了研究用于制备含有大量活性成分、如绿原酸及其衍生物的忍冬的纯化花提取 物的新方法，和研究忍冬的纯化花提取物对败血症的治疗效果，本发明的发明人已经深入 地进行了组分分析以及一些动物模型试验，例如重度败血症CLP模型试验，对MODS的效果， 对各种促炎性细胞因子如TNF-a、IL-1P、IFN-y等的抑制效果，最终通过确认花 提取物的纯化提取物包含大量活性成分并显示出对败血症和败血性休克有效地治疗效果 完成了本发明。
[0010] 通过下文中提供的本发明的详细公开，本发明的这些及其他目的会变得明显。


【发明内容】

[0011] 技术问题
[0012] 因此，本发明的一个目的是提供一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法，其包括 以下步骤：在第一步骤，利用提取溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗制提 取物经受选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理，优选过滤法以提供忍冬的粗制提取 物；在第三步骤，通过添加水使粗制提取物悬浮于水中以制备悬浮溶液，然后将该溶液分级 成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提 供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的 量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗 溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提取物；和真空下对该提取物进行浓缩，并干燥以 提供忍冬的纯化提取物，所述提取物含有大量的活性成分，具体地，含有基于干燥的纯化提 取物的重量的2. 0%至30. 0% (重量/重量）、优选5. 0%至20. 0% (重量/重量）、更优 选7.0%至15.0% (重量/重量）的量的绿原酸及其衍生物。
[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，上述方法中第一步骤的提取溶剂包括基于花材 料重量的约1至100倍、优选2至20倍、更优选5至15倍体积（体积/重量）的至少一种 溶剂，该至少一种溶剂选自水、酒精制剂、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、己烷、乙酸乙酯、环己烷、 DMS0、氯仿和二氯甲烷，优选地选自水、甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，更优选水，最优选使基于花 材料的重量的〇. 1 %至5%、优选0. 2%至2%重量（重量/重量）的量的弱碱如NaHC03、 NaC03等溶解于水中以提高提取效率的碱性溶液。
[0014] 在本发明的一个优选实施方案中，通过选自热水回流提取、花香提取、索氏提取、 超声波提取及其组合的至少一种方法，优选在20°C至120°C、优选30°C至10(TC持续约1至 72小时、优选2至12小时的热水回流提取来进行上述方法中第一步骤的提取过程。
[0015] 在本发明的一个优选实施方案中，通过选自过滤法、离心或其组合的至少一种处 理，优选过滤法来进行上述方法中第二步骤的提供忍冬的粗制提取物的处理。
[0016] 在本发明的一个优选实施方案中，通过以下过程来进行上述方法中第三步骤的提 供第一纯化提取物的过程：添加约0. 005至5倍体积、优选0. 05至3倍体积的水（体积/ 重量，基于粗提取物的重量）以制备悬浮溶液；和通过添加约〇. 1至50倍体积、优选0. 5至 10倍体积的非极性溶剂（体积/体积，基于悬浮溶液的体积）将溶液分级成非极性溶剂可 溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质，所述非极性溶剂例如是己烷、二氯甲 烷、氯仿、乙酸乙酯等，优选己烷、二氯甲烷、或乙酸乙酯，更优选己烷或二氯甲烷。
[0017] 通过第三步骤的纯化过程，可以从提取物中有效地移出提取物中的非极性可溶物 质，例如精油如十六烷酸、亚油酸甲酯、芳樟醇、香芹酚、棕榈酸甲酯等，和留醇类化合物如 3谷留醇等。
[0018] 在本发明的一个优选实施方案中，通过以下过程来进行上述方法中第四步骤的提 供忍冬的第二纯化提取物的过程：将1至30倍重量、优选2至15倍重量、更优选5至10倍重 量的水（重量/重量，基于第一纯化提取物的重量）添加至第一纯化提取物以使其经受吸 附色谱来进一步纯化，所述吸附色谱使用与水的量相等的量的吸附树脂，优选选自SP207、 HP20SS、DiaoionHP20、SP-850 树脂、活性炭、或AmberliteXAD-2,4 的至少一种树脂，更 优选选自DiaionHP20、SP-850树脂或AmberliteXAD-2,4的至少一种树脂。
[0019] 在本发明的一个优选实施方案中，通过经受离子柱色谱来进行上述方法中第四步 骤的提供忍冬的第二纯化提取物的过程，所述离子柱色谱使用与水的量相等的量的离子树 月旨，例如，选自AG50W-x8、AmberlteIR-120、AmberliteIRA-400、Dowex50W-X8 或SK1B 的至少一种强酸性树脂，或者选自AmberlteIRC-50、Bi〇-Rex70、Duolite-436或WK40的 至少一种弱酸性树脂，或者选自AmberlteIR-67或Dowex3-x4的至少一种弱碱性树脂，优 选选自AmberlteIR_120、AmberliteIRA-400或SK1B的至少一种强酸性树脂，更优选选自 AmberlteIR-120 或AmberliteIRA-400 的至少一种强酸性树脂。
[0020] 在本发明的一个优选实施方案中，通过重复地用选自水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或 其混合物的至少一种清洗溶剂，优选水与甲醇的混合溶剂清洗吸附到树脂的吸附物质来进 行上述方法中第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的清洗过程。
[0021] 通过第四步骤的纯化，可以从提取物中有效地移出不显示药理活性的非活性物 质，例如氨基酸如脯氨酸等，和糖类如葡萄糖、蔗糖、肌醇等。
[0022] 在本发明的一个替代实施方案中，优选进行除上述方法中第四步骤的纯化步骤外 的另外的纯化步骤，例如葡聚糖凝胶柱色谱，葡聚糖凝胶柱色谱使用选自Sephadex LH-20 树脂、Sephadex G15树脂或Sephadex G35等的至少一种葡聚糖凝胶树脂。
[0023] 在本发明的一个优选实施方案中，通过以下过程进行上述方法中第五步骤的提供 忍冬的纯化提取物的浓缩过程和干燥过程以提供忍冬提取物的创造性纯化提取物（下文 中表示为"HS-23提取物"）：在10°C至80°C的温度、优选小于60°C的温度，在真空下浓缩提 取物，并通过选自室温干燥法、冷冻干燥法、热空气干燥法或其组合的至少一种干燥方法， 优选冷冻干燥法来干燥提取物。
[0024] 通过以上的创造性纯化过程，本发明人已经发现，通过上述方法制备的忍冬的创 造性纯化提取物含有大量的活性成分，具体地，约5. 8倍产率的绿原酸和约5. 2倍产率的 包括绿原酸及其衍生物的总绿原酸衍生物，例如基于干燥纯化提取物的重量的2. 0%至 30. 0% (重量/重量）、优选5. 0%至20. 0% (重量/重量）、更优选7. 0%至15. 0% (重 量/重量）的量的3, 5-0-咖啡酰奎宁酸、3, 5-二-0-咖啡酰奎宁酸甲酯等，其产率是通过 本领域中用于制备忍冬提取物的众所周知的提取方法的产率的5倍以上。
[0025] 此外，HS提取物显示出在重度败血症CLP模型试验中的抗败血症活性、对MODS的 效果、和对各种促炎性细胞因子如TNF-a、IL-1 0、IFN-y等的抑制效果，同时，对 于本领域技术人员，在与可商业获得的抗菌剂、例如广谱抗生素组合的情况下，它还出乎本 领域技术人员意料地显示出对败血症和败血性休克的治疗的协同效应（在诱发重度败血 症的动物模型中，与单一治疗组相比约120%增加的存活率）。
[0026]技术方案
[0027]因此，本发明的一个目的是一种忍冬的纯化HS-23提取物，其含有基于干燥的纯 化提取物的重量的2. 0%至30. 0% (重量/重量）、优选5. 0%至20. 0% (重量/重量）、 更优选7.0%至15.0% (重量/重量）的量的绿原酸及其衍生物，所述干燥的纯化提取物 是通过以下步骤制备的：在第一步骤，利用提取溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二 步骤，使粗提取物经受选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理，优选过滤法以提供忍冬 的粗提取物；在第三步骤，通过添加水使粗提取物悬浮于水中以制备悬浮溶液，然后将该溶 液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质并通过收集剩 余物提供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至第一纯化提取物以使其经受选自使用 与水的量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和 用清洗溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提取物；和真空下对该提取物进行浓缩，并 干燥以提供用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的忍冬的纯化提取物。
[0028]因此，本发明的一个目的是提供一种药物组合物，其包含通过上述方法纯化的忍 冬的纯化HS-23提取物作为用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
[0029] 具有与通过众所周知的提取方法制备的提取物相比更有效的药理学作用的创造 性纯化HS-23提取物可以含有基于干燥纯化提取物的重量的2. 0%至30. 0% (重量/重 量）、优选5. 0%至20. 0% (重量/重量）、更优选7. 0%至15. 0% (重量/重量）的量的 绿原酸及其衍生物。
[0030] 本发明的一个目的是提供通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物用于制 备用于治疗和预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的治疗剂的用途。
[0031] 本发明的一个目的是提供一种治疗或预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或 败血性休克的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的通过上述方法纯化的忍冬的纯化 HS提取物以及其药学可接受的载体。
[0032] 本文中所公开的术语"败血症"包括但不限于各种败血症，例如中度败血症，重度 败血症，或由烧伤、急性咽喉炎、溃疡性结肠炎、IBS(肠道易激综合征）、风湿性关节炎、退 行性关节炎、急性肝炎、慢性肝炎等引起的败血症或感染症状，优选地，中度败血症、重度败 血症、或由烧伤引起的败血症或感染症状。
[0033] 本文中所公开的术语"MODS(多器官功能障碍综合征）"包括但不限于发生在受损 器官中的各种MODS，例如发生在由中度败血症、重度败血症、或由烧伤引起的败血症或感染 症状，优选重度败血症导致的选自肝、肾、心脏、肺、小肠、大肠、十二指肠、胃、胰、脾等的受 损器官中，优选肝、肾、或心脏中的MODS。
[0034] 在本文中所公开的术语"败血性休克"包括但不限于各种败血性休克，例如由中度 败血症、重度败血症、或由烧伤引起的败血症或感染症状导致的败血性休克。
[0035] 显示有效抗败血症活性的HS提取物可以与可商业获得的抗菌剂组合以获得治疗 和预防败血症、MODS或败血性休克的协同效应。
[0036] 因此，本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其包含通过上述方法纯化的 忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合作为用于治疗和预防败血症、MODS 或败血性休克的活性成分。
[0037] 本发明的一个目的是提供通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商 业获得的抗菌剂的组合用于制备用于治疗和预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败 血性休克的治疗剂的用途。
[0038] 本发明的一个目的是提供一种治疗或预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或 败血性休克的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的通过上述方法纯化的忍冬的纯化 HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合以及其药学可接受的载体。
[0039] 本文中所公开的术语"通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获 得的抗菌剂的组合"包括（a)通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与（b)可商业 获得的抗菌剂以按重量计〇. 1至10:0. 1至10 (重量/重量）、优选按重量计1至10:1至 10 (重量/重量）、更优选按重量计1至5:1至5 (重量/重量）的混合比混合的的组合。
[0040] 本文中所公开的术语"可商业获得的抗菌剂"包括但不限于各种可商业获得的抗 菌剂，例如选自以下的至少一种抗菌剂：抗生素，如青霉素、喹诺酮、氨曲南（monobactam)、 氨基糖苷类、头孢菌素、四环素、糖肽类、碳青霉烯等；抗炎剂，如甲灭酸、吲哚美辛、异丁苯 丙酸、吡罗昔康、双氯芬酸等；抗真菌剂，如两性霉素B、制真菌素、灰黄霉素、唑类抗真菌剂 等；抗过敏剂，如西替利嗪、非索非那定、氯苯卩比胺（chlroropeniramine)等；优选选自抗 生素如青霉素、喹诺酮、氨曲南、氨基糖苷类、头孢菌素、四环素、糖肽类、碳青霉烯等的抗菌 齐U;更优选选自阿莫西林、氨节西林、万古霉素、阿米卡星、亚胺培南（imipenam)等的抗菌 剂。
[0041] 本发明的药物组合物可以含有基于组合物总重量的约0. 01重量％至50重量％的 上述提取物。
[0042] 根据本领域中众所周知的使用方法，该创造性组合物可以另外包含常规的载体、 佐剂或稀释剂。优选的是所述载体是根据使用和应用方法作为合适的物质使用的，但其不 受限制。在Remington' s Pharmaceutical Science (Mack Publishing co, Easton PA)的 书面文本中列出了合适的稀释剂。
[0043] 在下文中，以下配制方法及赋形剂仅仅是示例性的，并且不以任何方式限制本发 明。
[0044] 含有本组合物的药物制剂可以以任何形式制备，例如口服给药形式，如作为固体 口服制剂的冻干剂型、散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、酏剂药丸、袋装制剂等，作为 液体口服制剂的悬浮剂、溶液、乳剂、糖浆、含水药物等；局部用剂型，如霜剂、药膏剂、洗剂、 凝胶剂、香膏剂、贴剂、糊剂、喷雾溶液、气雾剂等；或肠胃外给药形式，例如栓剂或可注射剂 型，如无菌溶液、悬浮剂、冻干剂型、无水型注射剂、或含水型注射剂，优选无菌的可注射剂 型。
[0045] 根据本发明的组合物可以作为药物组合物提供，所述药物组合物含有药学可接受 的载体、佐剂或稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖 醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯卩比咯烷酮、 水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂可以另外包括溶剂、 添加剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂、稳定剂、抗氧化剂、镇痛剂、乳化剂、填充剂、抗凝剂、润滑 齐IJ、湿润剂、调味剂、防腐剂等。特别地，所述溶剂、添加剂、或稀释剂包括无菌蒸馏水、生理 盐水溶液、pH调节剂、白蛋白、氯化钠、甘露醇、林格氏溶液（Ringer'ssolution)、葡萄糖 等。固体口服制剂，如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、酏剂药丸、袋装制剂等可以通 过将创造性提取物与至少一种佐剂混合来制备，所述佐剂例如是淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、 明胶等，如果必要的话，与作为将被配制的另一添加剂的润滑剂如硬脂酸镁、滑石等混合。 液体口服制剂，如悬浮剂、溶液、乳剂、糖浆、含水药物等可以通过将创造性提取物与待配制 的至少一种佐剂混合来制备，所述佐剂例如是湿润剂、调味剂、甜味剂、防腐剂，而不与待配 制的常用稀释剂如水或液态石蜡混合来制备。作为肠胃外给药形式，例如，在本发明中，可 注射剂型，如无菌溶液、悬浮剂、冻干剂型、无水型注射剂、或含水型注射剂可以使用丙二 醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射的酯如油酸乙酯（ethylolate)等作为基体；而栓 剂可以使用whitepsol、macrogol、吐温（tween) 61、可可油、月桂油、甘油明胶等作为基体。
[0046] 可以配制本发明的组合物以提供在通过采用本领域中众所周知的过程中的任何 一种对患者施用活性成分后，活性成分的快速、持续或延迟的释放。
[0047] 例如，本发明的组合物可以溶解于常用于制备注射剂的油、丙二醇或其他溶剂中。 载体的合适的实例包括生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、肉豆蘧酸异丙酯等，但不限于 此。为了局部施用，本发明的提取物可以以软膏剂和霜剂的形式配制。
[0048]药学给药形式的本发明的组合物可以以它们药学可接受的盐的形式使用，并且也 可以单独使用或者以合适的组合使用，以及与其他药学活性的化合物组合使用。
[0049]创造性提取物或组合物的期望剂量根据对象的病情和体重、严重程度、药物形式、 施用途径及周期而变化，本领域技术人员可以选择剂量。然而，为了获得期望的效果，通常 建议施用1微克/天至5毫克/天、优选8微克/天至2毫克/天、更优选16微克/天至 1毫克/天的量的本发明的创造性提取物。剂量可以每天单次施用或分成多次施用；周期 性施用，例如2天至一周的周期一次，但是不打算限制于此。本发明的范围可以包括任何修 改，或者给药的任何量和次数方面的变化，和本领域技术人员可想到的任何施用途径。在组 合物方面，创造性提取物的量可以是基于组合物总重量的以重量计0.01%至50%、优选以 重量计0.5%至40%。
[0050] 本发明的药物组合物可以通过各种途径施用至对象动物，如哺乳动物（大鼠、小 鼠、家畜或人类）。考虑施用的所有方式，例如施用可以是口服、经直肠、或通过静脉内注射、 肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、鞘内注射、脑膜外注射或脑室内注射来完成。
[0051] 本发明的创造性提取物没有毒性和不良反应，因此，它们可以安全使用。
[0052] 本发明提供了一种健康功能食品，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23 提取物作为用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
[0053]本发明提供了一种健康功能食品，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23 提取物与可商业获得的抗菌剂的组合作为用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的活 性成分。
[0054]本发明还提供了一种健康功能食品，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物和饮食学可接受的添加剂用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克。
[0055]本发明还提供了一种健康功能食品，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合，和饮食学可接受的添加剂用于缓解和预防败 血症、MODS或败血性休克。
[0056]在一个优选实施方案中，本发明的另一个目的是提供一种保健食品，其包含用于 缓解或预防败血症、MODS、或败血性休克的通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物， 以及饮食学可接受的添加剂。
[0057]在一个优选实施方案中，本发明的另一个目的是提供一种保健食品，其包含用于 缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与 可商业获得的抗菌剂的组合，以及饮食学可接受的添加剂。
[0058]创造性健康功能食品或保健食品的粗制药物组合物是以其粉末状形式、从其中提 取的形式或其干燥提取物形式使用的。
[0059] 以此公开的术语"饮食学可接受的添加剂"包括可以是本领域中众所周知的可常 规获得的添加剂，例如美国食品药品管理局所公布的食品添加剂列表（参见WWW. fda. gov/ food)。
[0060]用于预防和改善目标疾病的健康功能食品可以含有基于组合物总重量的约0.01重量％至95重量％、优选0. 5重量％至80重量％的上述粗制提取物。
[0061]其中上述粗制药物组合物可以添加至食品、添加剂或饮料用于预防和改善目标疾 病。为了预防和改善目标疾病的目的，其中，在食品或饮料中上述粗制药物组合物的量对于 健康食品组合物一般可以是食品总重量的约0. 1重量％至15重量％，优选1重量％至10 重量％,对于健康饮料组合物可以是l〇〇ml健康饮料组合物中1至30g，优选3至10g。 [0062]假设本发明的健康饮料组合物含有所示比例的上述提取物作为主要组分，对其他 液体组分没有特别限制，其中所述其他组分可以是与常规饮料一样的各种除臭剂或天然碳 水化合物等。前述天然碳水化合物的实例是单糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麦芽糖、蔗糖 等；常规糖，如糊精、环糊精；和糖醇，如木糖醇和赤藓醇等。至于除前述实例外的其他除 臭剂，可以有力地使用天然除臭剂，如索马甜（taumatin);甜叶菊提取物，如levaudioside A、甘草甜素等；以及合成除臭剂，如糖精、阿斯巴甜等。上述天然碳水化合物的量一般为 100ml本饮料组合物中约lg至20g，优选5g至12g。
[0063] 除前述组合物外的其他组分在奶酪、巧克力等的情况下是各种营养素、维生素、矿 物质或和电解质、合成调味剂、着色剂和改良剂，在碳酸饮料等中使用的果胶酸及其盐、海 藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体黏合剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳化剂。除 前述组分外的其他组分可以是用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果汁，其中所述 组分可以独立地使用或组合地使用。组分的比例不是那么重要，但一般为每100重量％本 组合物约0至20重量％。
[0064] 对本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的精神或范围的条件下，可以在本 发明的组合物、用途以及制备物中进行各种修改和变化。
[0065] 有益效果
[0066] 本发明提供一种用于制备包含大量活性成分的忍冬的纯化提取物的方法。
[0067] 本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的忍冬的纯化提取物作为活性成分用 于预防和治疗败血症和败血性休克。
[0068] 本发明还提供上述提取物用于制备治疗和预防哺乳动物或人类中败血症和败血 性休克的药物组合物的用途。

【专利附图】

【附图说明】
[0069] 根据结合附图的以下详细描述，会更清楚地理解本发明的以上和其他目的、特征 和其他优势，其中：
[0070]图 1 示出了CGA(A)、HS-23(b)和SL-101 (c)的HPLC数据（* 保留时间-18 分钟 (CGA)，9&21 分钟-CGA衍生物）；
[0071] 图2示出了在重度败血症CLP模型中亚胺培南治疗组和亚胺培南与HS-23组合治 疗组中存活率的变化。

【具体实施方式】
[0072] 对本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的精神或范围的条件下，可以在本 发明的组合物、用途以及制备物中进行各种修改和变化。
[0073] 本发明提供一种用于制备包含大量活性成分的忍冬的纯化提取物的方法。
[0074] 本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的忍冬的纯化提取物作为活性成分用 于预防和治疗败血症和败血性休克。
[0075] 本发明还提供上述提取物用于制备治疗和预防哺乳动物或人类中败血症和败血 性休克的药物组合物的用途。
[0076] 通过以下实施例更具体地说明本发明。然而，应理解，本发明不以任何方式受限于 这些实施例。
[0077]实施例
[0078] 以下的参照实施例、实施例和实验实施例旨在进一步说明本发明而不限制其范 围。
[0079] 发明的实施方式
[0080] 比较例1忍冬的常规粗制提取物（SL-101)的制备
[0081] 将忍冬的干花添加至10倍体积的蒸馏水，用热水回流提取法在l〇〇°C进行提取3 小时。过滤溶液，用真空蒸发器（EYELAN-1000，EYELALtd.日本）在低于60°C下浓缩滤 液，并用冻干器（FDCF-12012,OperonCo.韩国）进行干燥，以获得忍冬的干燥粗制花提取 物（产率：40.0%，下文中表示为"SL-101"）。该干燥粉末在以下实验中用作比较试验样 品。
[0082] 实施例1 :忍冬的纯化提取物（HS_23a. 23b)的制备
[0083] 1-1?使用5倍重量的HP-20树脂（HS_23a)
[0084] 将忍冬的干花添加至10倍体积的蒸馏水，用热水回流提取法在100°C进行提取3 小时。过滤溶液，用真空蒸发器（EYELAN-1000，EYELALtd.日本）在低于60°C下浓缩滤 液，并用冻干器（FDCF-12012,OperonCo.韩国）进行干燥，以获得忍冬的干燥粗制花提取 物。使提取物悬浮于1. 5倍体积的水中（体积/重量，基于粗制提取物的重量），用等体积 的乙酸乙酯使悬浮液分级三次以移出乙酸乙酯可溶部分以提供第一纯化提取物。向提取 物添加5倍重量的水（重量/重量，基于第一纯化提取物的重量），再向其中添加等重量的 HP-2树脂（MitsubishiChemical)并搅拌5小时以移出水溶性物质。向剩余部分添加10 倍体积的水和等量的30%甲醇作为清洗溶剂并搅拌5小时以提供第二纯化提取物。用真空 蒸发器（EYELAN-1000，EYELALtd.日本）在低于60°C的真空下浓缩吸附的吸附物质，并用 冻干器（FDCF-12012,OperonCo.韩国）进行干燥，获得忍冬的纯化花提取物（最终产率： 3. 1%，下文中表示为"HS-23a"）。该干燥粉末在以下实验中用作试验样品。
[0085] 1-2.使用 10 倍重量的HP-20 树脂（HS-23b)
[0086] 除了HP-21树脂的使用量为水的10倍重量外（重量/重量，基于第一纯化提取物 的中重量），所有的纯化过程与实施例1-1中公开的程序相同，以获得忍冬的纯化花提取物 (最终产率：3. 1%，下文中表示为"HS-23b"）。该干燥粉末在以下实验中用作试验样品。
[0087] 实施例2:忍冬的纯化提取物（HS-23c)的制备
[0088] 将忍冬的干花添加至10倍体积的蒸馏水，用热水回流提取法在100°C进行提取3 小时。过滤溶液，用真空蒸发器（EYELAN-1000,EYELALtd.日本）在低于60°C下浓缩滤 液，并用冻干器（FDCF-12012,OperonCo.韩国）进行干燥，以获得忍冬的干燥粗制花提取 物。使提取物悬浮于1.5倍体积的水中（体积/重量，基于粗制提取物的重量），用等体积 的乙酸乙酯使悬浮液分级三次以移出乙酸乙酯可溶部分以提供第一纯化提取物。向提取物 添加10倍重量的水（重量/重量，基于第一纯化提取物的重量），再向其中添加等重量的 SP-850树脂（MitsubishiChemical)并搅拌5小时以移出水溶性物质。向剩余部分添加 10倍体积的水作为清洗溶剂，同时检查剩余的水溶性物质。向剩余部分加3倍体积的10% 甲醇，搅拌5小时，并用相似的方法向剩余树脂添加3倍体积的20%甲醇，在真空下进行浓 缩，并干燥。使用30%甲醇重复清洗过程，洗脱液与来自使用10%、20%和30%甲醇的清洗 过程的洗脱液一起收集。用真空蒸发器（EYELAN-1000，EYELALtd.日本）在低于60°C的 真空下浓缩收集的第二纯化提取物，并将浓缩物溶解于3倍体积的30%甲醇。用Sephadex LH树脂（GEHealthcare，美国）进一步纯化溶液以移出分子量小于2. 5kD的剩余无效成分， 例如类固醇、萜类、脂类、多元酚、生物碱、氨基酸等。用真空蒸发器（EYELAN-1000,EYELA Ltd.日本）在低于60°C的真空下浓缩用30%甲醇溶剂作为流动相流出的剩余洗脱液，并 用冻干器（FDCF-12012,OperonCo.韩国）进行干燥以获得忍冬的纯化花提取物（最终产 率：1. 6%，下文中表示为"HS-23C"）。该干燥粉末在以下实验中用作试验样品。
[0089] 实施例3:忍冬的纯化提取物（HS_23d)的制备
[0090] 将忍冬的干花添加至10倍体积的蒸馏水，用热水回流提取法在100°C提取3小 时。过滤溶液，用真空蒸发器（EYELAN-1000，EYELALtd.日本）在低于60°C下浓缩滤液， 并用冻干器（FDCF-12012,OperonCo.韩国）进行干燥，以获得忍冬的干燥粗制花提取物。 使提取物悬浮于1. 5倍体积的水中（体积/重量，基于粗制提取物的重量），用等体积的 乙酸乙酯使悬浮液分级三次以移出乙酸乙酯可溶部分以提供第一纯化提取物。向提取物 添加10倍重量的水（重量/重量，基于第一纯化提取物的重量），再向其中添加等重量的Amberlite-XAD-2树脂（Rohm&HaasCo.，美国）并搅拌5小时以移出水溶性物质。向剩余 部分添加10倍体积的水和等量的30%甲醇作为清洗溶剂，并搅拌5小时以提供第二纯化提 取物。用真空蒸发器（EYELAN-1000，EYELALtd.日本）在低于60°C的真空下浓缩吸附的 吸附物质，并用冻干器（FDCF-12012,0peronCo.韩国）进行干燥以获得忍冬的纯化花提取 物（最终产率：2. 8%，下文中表示为"HS-23d")。该干燥粉末在以下实验中用作试验样品。
[0091] 实施例4组分分析
[0092] 用根据表1中公开的条件的HPLC分析在比较例和实施例中制备的提取物的组分， 结果不于表2。
[0093] 1-1?试剂
[0094]在实验中使用了CGA(绿原酸> 96%，Aldrich C3878)、TFA(三氟乙酸，Sigma Aldrich 299537)、HP_20树脂（Mitsubishi Chemicals)、乙臆（Burdick&Jackson，HPLC 用）、水（Burdick&Jackson，HPLC用）和乙酸乙酯（Junsei)。
[0095] 1-2?样品处理
[0096] 将100mg在比较例和实施例中制备的三种提取物溶解于70ml蒸馏水，通过超声提 取进行提取。过滤提取物，将蒸馏水添加至滤液以使其为100ml，通过HPLC分析各个滤液的 组分以确定各提取物中的组分模式以及活性成分的量。
[0097][表 1]HPLC条件
[0098]

【权利要求】
1. 一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法，其包括以下步骤：在第一步骤，利用提取 溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗制提取物经受选自过滤法、离心或其组 合的至少一种处理，以提供忍冬的粗制提取物；在第三步骤，通过添加水使所述粗制提取物 悬浮于水中以制备悬浮溶液，和将该溶液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分 以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至 所述第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子 柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提 取物；和真空下对所述提取物进行浓缩，并干燥，以提供含有大量的活性成分的忍冬的纯化 提取物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中第一步骤的所述提取溶剂包括基于花材料重量的 1至100倍体积（体积/重量）的至少一种溶剂，所述至少一种溶剂选自水、酒精制剂、甲 醇、乙醇、丙醇、丁醇、己烷、乙酸乙酯、环己烷、DMSO、氯仿和二氯甲烷。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中第一步骤的所述提取溶剂包括1至100倍体积的 碱性溶液，所述碱性溶液是使基于花材料重量的0. 1 %至5 %重量（重量/重量）的量的弱 碱，例如NaHC03、NaC03等溶解于水以提高提取效率。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中通过选自热水回流提取、花香提取、索氏提取、超 声波提取及其组合的至少一种提取方法来进行第一步骤的提取过程。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中通过选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理 来进行第二步骤的提供忍冬的粗制提取物的所述处理。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中通过以下过程来进行第三步骤的提供第一纯化提 取物的过程：添加约0. 005至5倍体积的水（体积/重量，基于所述粗制提取物的重量）以 制备所述悬浮溶液；和通过添加约〇. 1至50倍体积的非极性溶剂（体积/体积，基于所述 悬浮溶液的体积），例如己烷、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯，将该溶液分级成非极性溶剂可溶 部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中通过以下过程来进行第四步骤的提供忍冬的第 二纯化提取物的过程：将1至30倍重量的水（重量/重量，基于所述第一纯化提取物的重 量）添加至所述第一纯化提取物以使其经受吸附色谱来进一步纯化，所述吸附色谱使用选 自 SP207、HP20SS、Diaoion HP20、SP-850 树脂、活性炭、或 Amberlite XAD-2,4 的至少一种 树脂并且吸附树脂的量与水的量相等。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中通过经受离子柱色谱来进行第四步骤的提供 忍冬的第二纯化提取物的过程，所述离子柱色谱使用选自AG50W-X8、Amberlte IR-120、 Amberlite IRA-400、Dowex 50W_x8 或 SK1B 的至少一种强酸性树脂，选自 Amberlte IRC-50、Bio-Rex 70、Duolite-436或WK40的至少一种弱酸性树脂，或者选自Amberlte IR-67或Dowex 3_x4的至少一种弱喊性树脂，优选选自Amberlte IR-120、Amberlite IRA-400或SK1B的至少一种强酸性树脂，并且离子树脂的量与水的量相等。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中通过重复地用选自水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其 混合物的至少一种清洗溶剂清洗吸附到树脂的吸附物质来进行第四步骤的提供忍冬的第 二纯化提取物的所述清洗过程。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的所述 清洗过程进行至除第四步骤的纯化过程外的另外的葡聚糖凝胶柱色谱，所述葡聚糖凝胶柱 色谱使用选自Sephadex LH-20树脂、Sephadex G15树脂或Sephadex G35的至少一种葡聚 糖凝胶树脂。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中通过以下过程进行第五步骤的提供忍冬的纯化 提取物的浓缩过程和干燥过程以提供忍冬提取物的创造性纯化提取物：在10°c至80°C的 温度在真空下浓缩所述提取物，和通过选自室温干燥法、冷冻干燥法、热空气干燥法或其组 合的至少一种干燥方法来干燥所述提取物。
12. -种忍冬的纯化HS-23提取物，其含有基于干燥的纯化提取物的重量的2. 0 %至 30.0% (重量/重量）的量的绿原酸及其衍生物，所述忍冬的纯化HS-23提取物是通过以 下步骤制备的：在第一步骤，利用提取溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗 制提取物经受选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理以提供忍冬的粗制提取物；在第 三步骤，通过添加水使粗提取物悬浮于水中以制备悬浮溶液，和将该溶液分级成非极性溶 剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提供第一纯化 提取物；在第四步骤，将水添加至第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的量相等的量 的吸附树脂的吸附色谱、离子柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗溶剂反复地 清洗以提供忍冬的第二纯化提取物；和真空下对所述提取物进行浓缩，并干燥以提供用于 治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的忍冬的纯化提取物。
13. -种药物组合物，其包含通过根据权利要求1所述的方法制备的忍冬的纯化HS-23 提取物作为用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
14. 根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述败血症是中度败血症，重度败血症， 或由烧伤、急性咽喉炎、溃疡性结肠炎、IBS(肠道易激综合征）、风湿性关节炎、退行性关节 炎、急性肝炎、慢性肝炎引起的败血症或感染症状。
15. 根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述MODS发生在由中度败血症、重度 败血症、或由烧伤引起的败血症或感染症状导致的受损器官中，所述器官选自肝、肾、心脏、 肺、小肠、大肠、十二指肠、胃、胰、脾。
16. 根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述败血性休克是由中度败血症、重度 败血症、或由烧伤引起的败血症或感染症状导致的败血性休克。
17. -种药物组合物，其包含通过根据权利要求1所述的方法制备的忍冬的纯化HS-23 提取物与可商业获得的抗菌剂的组合作为用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的活 性成分。
18. 根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述组合是（a)通过根据权利要求1 所述的方法纯化的忍冬的纯化HS提取物与（b)可商业获得的抗菌剂以按重量计0. 1至 10:0. 1至10 (重量/重量）的混合比混合的组合。
19. 根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述可商业获得的抗菌剂是选自以下的 至少一种抗菌剂：抗生素，如青霉素、喹诺酮、氨曲南、氨基糖苷类、头孢菌素、四环素、糖肽 类、碳青霉烯等；抗炎剂，如甲灭酸、吲哚美辛、异丁苯丙酸、吡罗昔康、双氯芬酸等；抗真菌 齐?，如两性霉素 B、制真菌素、灰黄霉素、唑类抗真菌剂等；抗过敏剂，如西替利嗪、非索非那 定、氯苯吡胺等。
20. -种健康功能食品，其包含通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化 HS-23提取物作为用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
21. -种健康功能食品，其包含通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化 HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合作为活性成分，其用于缓解和预防败血症、MODS 或败血性休克。
22. -种保健食品，其包含用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的通过根据权 利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物以及饮食学可接受的添加剂。
23. -种保健食品，其包含用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的通过根据权 利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合以及饮 食学可接受的添加剂。
24. 通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物用于制备用于治 疗和预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的治疗剂的用途。
25. 通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的 抗菌剂的组合用于制备用于治疗和预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克 的治疗剂的用途。
26. -种治疗或预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的方法，其包 括向所述哺乳动物施用有效量的通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS提 取物以及其药学可接受的载体。
27. -种治疗或预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的方法，其包 括向所述哺乳动物施用有效量的通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23 提取物与可商业获得的抗菌剂的组合以及其药学可接受的载体。
【文档编号】A61K36/355GK104244963SQ201280072577
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2012年11月1日 优先权日:2012年4月27日
【发明者】尹圣泰, 金桢熏, 林芳虎, 金映睦, 延成钦, 金炫锈, 李善美 申请人:休恩有限公司