专利名称：雌激素的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物领域，具体为雌激素在制备治疗脂肪肝药物、调节SHP基因的药物方面的应用，以及SHP基因在制备治疗脂肪肝药物方面的应用
背景技术：
随着人们生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)已经成为一个越来越严重的健康问题，其在发达国家的患病率已接近30%，成为慢性肝病的首要原因。机体脂质代谢平衡紊乱时，过多的甘油三酯会以脂滴的形式积聚在肝细胞，从而引起肝细胞脂肪样变，和NAFLD的形成。研究表明NAFLD与肥胖与胰岛素抵抗等密切相关，然而其发生机制尚未明确，预防和治疗手段则更是有限。肝脏的糖脂代谢紊乱，特别是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，与代谢综合征的发生密切相关，并常伴随着胰岛素抵抗，肥胖，高脂血症等。NAFLD带来的代谢紊乱，使得NAFLD成为2型糖尿病以及慢性心血管疾病的重要危险因素。肝脏作为胰岛素的靶器官之一，在机体糖脂代谢过程中发挥重要的作用。在空腹状态下，肝脏通过糖异生作用产生葡萄糖，升高血糖；而在餐后等机体血糖浓度高的状态下时，胰岛素通过抑制肝糖异生，促进糖原合成，降低血糖浓度。当机体糖脂代谢调节紊乱时，如胰岛素抵抗状态下，不适当的肝脏糖异生作用成为2型糖尿病高血糖的重要原因。此外，肝细胞可以摄取血液中的游离脂肪酸，合成甘油三酯，以VLDL的形式释放入血，为其他组织提供能量。机体脂质代谢平衡紊乱时，过多的甘油三酯积聚在肝细胞，引起肝细胞脂肪变性，形成NAFLD，进一步加重糖脂代谢紊乱。长期的脂肪积累引起肝脏炎症反应，进而引起非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝细胞进一步死亡，星状细胞激活，肝纤维化，最终可进展为肝硬化，肝癌。`NALFD与胰岛素抵抗和T2DM、中心性肥胖、高脂血症、高血压以及其他与胰岛素抵抗相关的其他病理状态(如PC0S)相关。所以，NAFLD目前被认为是代谢综合征在肝脏的表现。长期以来，人们对肝脏的糖脂代谢的研究主要集中在胰岛素抵抗。本发明发现，雌激素在肝脏糖脂代谢中也具有至关重要的作用。
发明内容
本发明旨在提供将雌激素应用于制备治疗脂肪肝和改善胰岛素抵抗的药物。本发明旨在提供将雌激素用于制备调控SHP基因的药物。本发明还将SHP基因用于制备和筛选治疗脂肪肝的药物。本发明的技术方案是，雌激素在肝脏糖脂代谢过程中的作用具有重要作用，对肝脏有保护作用。因此可用作制备治疗脂肪肝，尤其为非酒精性脂肪肝的药物。雌激素通过调肝脏SHP (小二聚体伴侣)基因的表达，抑制SREBPlc，从而抑制肝脏甘油三酯与脂肪酸的合成，发挥改善脂肪肝的作用。FXR (法尼醇X受体，是一种胆汁酸受体)基因下游的SHP基因在肝脏胆汁酸与甘油三酯的代谢调节中发挥重要作用。胆汁酸通过激活胆汁酸受体FXR，引起下游SHP的表达水平增高，SHP通过LXR抑制SREBPlc的表达，引起其下游FASN，S⑶-1等甘油三酯合成基因的表达降低，从而降低肝脏甘油三酯的合成。雌激素所调控的受体为SHP基因。雌激素作为一种重要的内分泌激素广泛作用于全身的靶器官，参与调控众多生理功能。雌激素不仅在性腺发育及生殖系统功能方面至关重要，其在糖脂代谢的调节方面也有着不可忽视的作用。临床研究发现，一些代谢性疾病的发生和临床表现具有性别差异，例如，代谢综合征，心血管疾病，脂肪肝等。男性和绝经期后的女性更容易发生这类代谢性疾病。由于雌激素对这些代谢性疾病的保护作用，使得男性和女性在能量的储存和代谢方面存在差异。因此，雌激素在能量代谢方面的作用也越来越受到关注。肝脏的糖脂代谢紊乱，特别是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，与代谢综合征的发生密切相关，并常伴随着胰岛素抵抗，肥胖，高脂血症等。NAFLD带来的代谢紊乱，使得NAFLD成为2型糖尿病以及慢性心血管疾病的重要危险因素。NAFLD是肝脏胰岛素抵抗最典型的改变。本发明以NAFLD为切入点，根据雌激素对肝脏糖脂代谢的作用机制，通过人群研究发现女性NAFLD的发病率在绝经期后显著升高。给予雌激素抑制剂他莫西芬，可在小鼠体内诱导出脂肪肝。而卵巢切除，增加了小鼠肝脏的脂质沉积。给予高脂喂养的小鼠雌激素处理，可显著改善其肝脏甘油三酯沉积。基因表达分析提示，SHP可能为雌激素在肝脏的作用靶点。SHP作为FXR的主要下游基 因，在肝脏胆汁酸与甘油三酯的代谢调节中发挥重要作用。胆汁酸通过激活胆汁酸受体FXR，引起下游SHP的表达水平增高，SHP通过LXR抑制SREBPlc的表达，引起其下游FASN，S⑶-1等甘油三酯合成基因的表达降低，从而降低肝脏甘油三酯的合成。在FXR敲除型小鼠的血清中，游离脂肪酸和甘油三酯含量增加，肝脏中甘油三酯含量也显著增加。基因表达分析证实肝脏SHP显著下调，脂质生成的关键基因如SREBP-lc、FASN,SCD-1等显著上调。此外，胰岛素耐受试验也提示FXR敲除型小鼠的胰岛素敏感性下降。这些结果表明FXR在维持肝脏糖脂代谢中具有重要意义。利用FXR敲除型小鼠，验证了雌激素与SHP的调控关系。首先，鉴于雌激素调控糖脂代谢的重要作用，我们比较了不同性别的FXR敲除小鼠的代谢表型。结果显示，FXR敲除的雄性小鼠出现明显的糖脂代谢紊乱。与野生型相比，敲除型小鼠胰岛素敏感性下降，糖耐量受损，肝脏及血清甘油三酯水平升高；而雌性的敲除型小鼠与野生型小鼠相比，没有明显的代谢表型改变。基因表达研究发现，雄性敲除型小鼠FXR的下游基因SHP有明显下调，SHP的下游SREBPlc以及S⑶-1均有明显上调；而雌性敲除型小鼠的SHP、SREBPlc、S⑶-1与野生型相比，均无明显改变。将野生型和敲除型的雌性小鼠均行卵巢切除术。术后敲除型小鼠与野生型小鼠比，出现了代谢恶化的表型，胰岛素敏感性下降，糖耐量受损，敲除型小鼠肝脏的SHP, SREBPlc，FASN均出现相应改变。而给予两组小鼠均补充雌激素后，敲除型小鼠的代谢紊乱得以改善，两组小鼠代谢表型的差异消失。以上的研究结果提示，在雌性小鼠中，雌激素可诱导肝脏SHP的表达，从而代偿FXR敲除引起的代谢紊乱。
本发明发现了 SHP为雌激素在肝脏糖脂代谢中的特异性作用靶点，为筛选治疗脂肪肝药物提供了靶点；并且确定了雌激素对SHP的调控作用及与NAFLD的相关关系，证明雌激素在肝脏可通过上调SHP的表达，从而抑制肝脏甘油三酯合成，改善脂肪肝和胰岛素抵抗，为探索脂肪肝的预防和治疗靶点提供了可靠的依据和线索，也将从内分泌调节的角度，为糖脂代谢性疾病的预防和治疗开辟一条新的道路。
图1为实施例2中雌激素拮抗剂他莫西芬诱导的肝脏甘油三酯积聚。图2为实施例2中雌激素缺乏引起肝脏甘油三酯积聚。两组小鼠分别进行卵巢切除(OVX)及假手术(SHAM)处理，检测血清及肝脏甘油三酯水平。图3为实施例3中卵巢切除(OVX)小鼠与假手术组(SHAM)肝脏基因表达分析。通过Real time-PCR检测肝脏参与甘油三酯代谢重要基因的mRNA表达水平。包括转录因子SHP、SREBPlc、甘油三酯及脂肪酸合成的关键基因S⑶1、FASN、ACCl以及参与脂肪酸β氧化的关键基因MCAD和ACOXl。图4为实施例3中雌激素对高脂(HFD)诱导的肥胖小鼠糖脂代谢的改善作用。给予高脂喂养的雄性C57小鼠雌激素(50ug/kg/d)处理两周，观察表型肝脏(A)和血清(B)甘油三酯含量测定，IPGTT (C)和ITT试验(D)。图5为实施例4中雌激素对SHP表达调控作用。FXR野生型和敲除型小鼠的肝脏原代细胞，给予IOOnM的雌激素或对照处理，通过Real time-PCR,检测SHP的mRNA表达水平(A)。HEPG2细胞转染SHP启动子报告基因质粒，以及空载(pcmv)或人ERa表达质粒(ER a )，转染后细胞给予IOnM雌激素及对照处理16小时(B)，或IuM ICI182780 (ICI)，IuM ICI182780加IOnM E2(E2+ICI)处理16h(C)进行报告基因检测。HEPG2细胞转染野生型SHP启动子报告基因质粒(WT-ERE)，或SHP启动子区4个ERE位点突变的报告基因质粒(Mut-ERE)，转染后细胞给予IOnM雌激素及对照处理16小时，进行报告基因检测(D)。
具体实施例方式实施例1为研究雌激素在肝脏糖脂代谢，尤其是在NAFLD发生发展中的作用，我们对人群中女性的NAFLD发生率进行了分析，结果如表I。共收入研究对象808例，分为绝经期前组和绝经期后组，以B超作为NAFLD的诊断方法。绝经前女性与绝经后女性分别为280人和528人，平均年龄分别为45. 3±4.1岁和56. 8±4. 7岁。分析其数据可以看出，后者的BMI和腰臀比都显著高于前者，提示绝经后女性代谢紊乱的状况较绝经前女性严重。NAFLD的发生率在两组也有显著差异，起在绝经期前组的患病率为42. 9%，而在绝经期后组则高达60. 2%,显著高于前者(p〈0. 001)。这一现象提示，雌激素在NAFLD的发生中具有重要的作用。表1.女性绝经期前后NAFLD患病率及其他基线资料比较
权利要求
1.雌激素在制备治疗脂肪肝药物方面的应用。
2.雌激素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物方面的应用。
3.雌激素在制备调节SHP基因的药物方面的应用。
4.雌激素在制备改善胰岛素抵抗的药物方面的应用。
5.SHP基因在制备治疗脂肪肝药物方面的应用。
6.SHP基因在制备和筛选治疗非酒精性脂肪肝药物方面的应用。
全文摘要
本发明属于医药生物领域。雌激素在肝脏糖脂代谢过程中的作用具有重要作用，对肝脏有保护作用，可用作制备治疗脂肪肝，尤其为非酒精性脂肪肝的药物。雌激素所调控的受体为SHP基因，通过调肝脏SHP基因的表达，从而抑制肝脏甘油三酯与脂肪酸的合成，发挥改善脂肪肝的作用。本发明为筛选治疗脂肪肝药物提供了特异性靶点；并且确定了雌激素对SHP的调控作用及与NAFLD的相关关系为探索脂肪肝的预防和治疗靶点提供了可靠的依据和线索，也将从内分泌调节的角度，为糖脂代谢性疾病的预防和治疗开辟一条新的道路。
文档编号A61K45/00GK103055314SQ20131002374
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者宁光, 王晓琳, 李小英, 王计秋, 陆炎 申请人:上海市内分泌代谢病研究所