专利名称：一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法
一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法技术领域
本发明属于天然药物化学及中药学领域，具体涉及一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法。
背景技术：
灵芝，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。始载于《神农本草经》，后列入《本草纲目》， 被列为上品，味甘性平，扶正固本。具有抗肿瘤，免疫调节，抗氧化，抗放射线损伤及化疗药损伤，改善睡眠，强心降压，镇咳平喘的作用。
灵芝孢子粉，为灵芝子实体生长成熟期所产生的生殖细胞灵芝孢子的集合。含有脂肪酸类，留醇类，三萜类，生物碱类，内酯，蛋白质和氨基酸，糖肽以及无机盐，现代药理研究表明灵芝孢子粉的抗肿瘤的作用抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的转移，促进肿瘤细胞的分化，抑制肿瘤内血管生成，同时通过增强人体的免疫力达到抗肿瘤的功能。
灵芝孢子油是由破壁灵芝孢子粉中通过超临界C02提取提出的天然成分，富集了灵芝孢子粉中的灵芝三萜类、脂肪酸类、麦角留醇类成分，抗肿瘤活性成分比灵芝孢子粉更高，具有调节血脂，增强免疫，抗肿瘤等多方面作用。
但是灵芝孢子油的成分复杂，哪些成分具有更大的抗肿瘤的生物活性在目前还不十分明确，仍然是学术界研究的热点。灵芝孢子油的成分大部分为已知的各种脂肪酸及甘油三酯，其中真正起抗肿瘤作用的成分尚不明确。而有关于灵芝孢子油的抗肿瘤活性应用多是将灵芝孢子油与其他中药或中成药相混合。
中国专利200610086075.1 一种富含萜类的灵芝孢子油类制剂加工方法采用膜分离的方法收集特定分子量的孢子油以提高有效成分含量，其总三萜纯度能提高I倍但是并未提供具体的抗肿瘤活性数据。
中国专利申请20110168831. 6 一种提高灵芝孢子油抗肿瘤功效的加工方法采用超声离心静置的方法分离特定层的孢子油以提高抗肿瘤活性，新孢子油得率为26 27%，剂量为160mg/kg时，该新孢子油对小鼠肉瘤的抑瘤率为55. 57%，对小鼠胸腔积液中原代肿瘤的抑 瘤率为56. 06%。但是该新孢子油的抗肿瘤功效的成分并未提及。发明内容
本发明的目的是提供一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，该组合物具有良好的抗肿瘤功效。
本发明的目的是通过以下方式实现的一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，它包括以下步骤1.1.将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入O. 1-1. OV 升的石油醚或乙酸乙酯(分析纯)、0. 1-1. OV升的无水乙醇或甲醇(分析纯)和O. 5-1. OV升纯净水(18ΜΩ. cm)；1. 2.将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取O. 5小时；1. 3.静置O. 5小时后分层，分离下层溶液；1.4.将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至O.OlV升；1. 5 将上述这O. OlV升浓缩液用O. 02-0. 025V升大孔树脂搅拌，挥干甲醇，再装入O.25-0. 6V升的大孔树脂柱进行分离；1.6用体积为大孔树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于75%乙醇进行梯度洗脱；1.7收集浓度大等于75%乙醇的洗脱液；1.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20°C，捕水器温度为_50°C， 得到抗肿瘤组合物。
本发明所指的石油醚或乙酸乙酯、无水乙醇或甲醇为分析纯。
或它包括以下步骤2.1.将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入O. 1-1. OV 升的石油醚或乙酸乙酯(分析纯)、0. 1-1. OV升的无水乙醇或甲醇(分析纯)和O. 5-1. OV升纯净水(18ΜΩ. cm)；2.2.将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取O. 5小时；2.3.静置O. 5小时后分层，分离下层溶液；2.4.将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至O.OlV升；2.5将上述这O. 01 V升浓缩液用O. 02-0. 025 V升聚酰胺树脂搅拌，挥干甲醇，再装入O. 25-0. 6 V升的聚酰胺树脂柱进行分离；2.6用体积为聚酰胺树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于85%乙醇进行梯度洗脱；2.7收集浓度大等于85%乙醇的洗脱液；2.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20°C，捕水器温度为_50°C， 得到抗肿瘤组合物。
按上述方法制备所得的组合物通过高效液相色谱仪(HPLC)的指纹图谱的测定，有主要4个成分具有良好的抗肿瘤功效。通过本发明得到的组合物，对小鼠的前列腺癌细胞 RM-1的半抑制率IC50是2. 19 (μ g/mL)，对小鼠肺腺癌细胞LA795是4. 49，对小鼠淋巴白血病细胞L1210是5. 47，(IC50小于10为有效)。该组合物对荷有前列腺觀_1癌肿瘤的小鼠，用量110mg/kg时，对小鼠抑瘤率为56. 9%，有好的抑瘤效果。
图1为抗肿瘤组合物的HPLC指纹图谱具体实施方式
下面结合视图对本发明进行详细的描述，下面的实施例可以使本专业的技术人员更理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
本发明所述纯净水的电阻率大等于18ΜΩ . cm。
一种灵芝孢子油 中抗肿瘤组合物及其制备方法，它包括以下步骤1.1.将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入O. 1-1. OV 升的石油醚或乙酸乙酯(分析纯)、0. 1-1. OV升的无水乙醇或甲醇(分析纯)和O. 5-1. OV升纯净水(18ΜΩ. cm)；1.2.将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取O. 5小时；1.3.静置O. 5小时后分层，分离下层溶液；1.4.将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至O. OlV升；1.5 将上述这O. OlV升浓缩液用O. 02-0. 025V升大孔树脂搅拌，挥干甲醇，再装入 O. 25-0. 6V升的大孔树脂柱进行分离；1.6用体积为大孔树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于75%乙醇进行梯度洗脱；1.7收集浓度大等于75%乙醇的洗脱液；1.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20°C，捕水器温度为_50°C， 得到抗肿瘤组合物。
实施例1 :1.将200mL的灵芝孢子油加入IOOOmL分液容器内，再依次加入200mL的石油醚、IOOmL 的无水乙醇和IOOmL纯净水，总液体体积为600mL ；2.将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取O.5小时；3.静置O.5小时后分层，分离下层溶液；4.将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至2mL;5.将这2mL浓缩液用5mL大孔树脂(HZ816)搅拌，挥干，再加入到50mL的大孔树脂柱 (HZ816)进行分尚；6.用体积为大孔树脂柱2倍(IOOmL)纯净水和体积为大孔树脂柱2倍(IOOmL)50%乙醇、体积为大孔树脂柱3倍(150mL) 75%乙醇进行梯度洗脱；7.收集75%的乙醇洗脱液；8.将洗脱液进行冷冻干燥，真空度为20Pa,冻结温度为为_20°C,捕水器温度为_50°C, 得到抗肿瘤组合物，得率为O. 47%。
实施例21.将200mL的灵芝孢子油加入IOOOmL分液漏斗内，再依次加入IOOmL的石油醚、200mL 的甲醇和200mL纯净水，总液体体积为700mL ；2.将分液漏斗固定在全自动液液萃取器内，进行提取O.5小时；3.静置O.5小时后分层，分离下层溶液；4.将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至2mL;5.将这2mL浓缩液用5mL大孔树 脂(HZ816)搅拌，挥干，再加入到IOOmL的大孔树脂柱(HZ816)进行分尚；6.用体积为大孔树脂柱2倍(200mL)纯净水和体积为大孔树脂柱3倍(300mL)50%乙醇、体积为大孔树脂柱3倍(300mL) 85%乙醇梯度洗脱；7.收集85%的乙醇洗脱液；8.将洗脱液进行冷冻干燥，真空度为20Pa,冻结温度为为_20°C,捕水器温度为_50°C, 得到抗肿瘤组合物，得率为O. 55%.制作组合物的另一种方法它包括以下步骤2.1.将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入O. 1-1. OV 升的石油醚或乙酸乙酯(分析纯)、0. 1-1. OV升的无水乙醇或甲醇(分析纯)和O. 5-1. OV升纯净水(18ΜΩ. cm)；2.2.将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取O. 5小时；2.3.静置O. 5小时后分层，分离下层溶液；2.4.将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至O. OlV升；2.5将上述这O. 01 V升浓缩液用O. 02-0. 025 V升聚酰胺树脂搅拌，挥干甲醇，再装入O. 25-0. 6 V升的聚酰胺树脂柱进行分离；2.6用体积为聚酰胺树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于85%乙醇进行梯度洗脱；2.7收集浓度大等于85%乙醇的洗脱液；2.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为_20°C，捕水器温度为_50°C， 得到抗肿瘤组合物。
实施例31.将200mL的灵芝孢子油加入IOOOmL分液漏斗内，再依次加入IOOmL的乙酸乙酯、 2OOmL的无水乙醇和150mL纯净水，总液体体积为650mL ；2.将分液漏斗固定在全自动液液萃取器内，进行提取O.5小时；3.静置O.5小时后分层，分离下层溶液；4.将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至2mL;5.将这2mL浓缩液用5mL聚酰胺树脂搅拌，挥干，再加入到IOOmL的聚酰胺树脂柱进行分离；6.用体积为聚酰胺树脂柱2-3倍(200-300mL)的纯净水、250mL50%的乙醇和300mL95% 的乙醇梯度洗脱；7.收集95%的乙醇洗脱液；8.将洗脱液进行冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为_20°C，捕水器温度为_50°C，得到抗肿瘤组合物，得率为O. 60%ο
我们对制得的组合物进行检测和动物试验该组合物的高效液相色谱(HPLC)的指纹图谱的测定方法1.仪器与试药岛津LC-20A，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，甲酸(色谱纯)，纯净水(18ΜΩ. cm)。
2.色谱条件流动相甲醇-乙腈-O. 04%甲酸水溶液；柱子0DS_3, 5 μ mX 4. 6mmX 250mm ;流速2mL/min ；波长278nm ；柱温40 °C ；进样 L 20 μ L0
3.指纹图谱鉴定如图1所示，灵芝孢子油的组合物有主要4个成分，具有良好的抗肿瘤功效。
以下通过实验例对本发明方法的效果做进一步阐述。根据化学药物临床前指导原则IC50提取物在30 μ g/mL之内，合成物在10 μ g/mL之内为抑瘤有效。
实验例1:该组合物对小鼠肿瘤细胞增殖的抑制效果实验材料按照本专利的实施例1方法制备得到组合物实验方法制备小鼠前列腺癌细胞RlTl，小鼠肺腺癌细胞LA795，小鼠淋巴细胞白血病 L1210细胞悬液加入96孔培养板中每孔细胞浓度为RlTl =10000/孔，LA795 :1500/孔， L1210 :2X IO5/孔，共90 μ L。放置于37°C培养箱中培养12小时；加入不同浓度的组合物O.5 μ g/mL, O. 5 μ g/mL, 2. 5 μ g/mL, 10 μ g/mL, 20 μ g/mL, 40 μ g/mL, 80 μ g/mL 各 10 μ L ;在溶剂对照组中加入乙酸乙酯(分析纯)10 μ L ;将96孔板放置于37°C培养箱孵育72小时；每孔加入10 μ L的CCK-8孵育2小时，测定450nm吸光度。
实验结果用半抑制率IC5tl (即某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%的浓度)来表示， 表1.组合物对不同癌细胞的半抑制
权利要求
1. 一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，其特征在于它包括以下步骤1.1.将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入O. 1-1. OV升的石油醚或乙酸乙酯、O. 1-1. OV升的无水乙醇或甲醇和O. 5-1. OV升纯净水；1.2.将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取O. 5小时；静置O. 5小时后分层，分离下层溶液；1.4.将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至O.OlV升；1.5 将上述这O. OlV升浓缩液用O. 02-0. 025V升大孔树脂搅拌，挥干甲醇，再装入 O. 25-0. 6V升的大孔树脂柱进行分离；1.6用体积为大孔树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于75%乙醇进行梯度洗脱；1.7收集浓度大等于75%乙醇的洗脱液；1.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20°C，捕水器温度为_50°C， 得到抗肿瘤组合物。
2.一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，其特征在于它包括以下步骤2.1.将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入O. 1-1. OV升的石油醚或乙酸乙酯、O. 1-1. OV升的无水乙醇或甲醇和O. 5-1. OV升纯净水；2.2.将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取O. 5小时；静置O. 5小时后分层，分离下层溶液；2.4.将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至O.OlV升；2.5将上述这O. 01 V升浓缩液用O. 02-0. 025 V升聚酰胺树脂搅拌，挥干甲醇，再装入O. 25-0. 6 V升的聚酰胺树脂柱进行分离；2.6用体积为聚酰胺树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于85%乙醇进行梯度洗脱；2.7收集浓度大等于85%乙醇的洗脱液；2.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为_20°C，捕水器温度为_50°C， 得到抗肿瘤组合物。
3.根据权利要求1或2所述的灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，其特征在于， 所述纯净水的电阻率大等于18ΜΩ. cm。
全文摘要
本发明公开一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，该方法是将破壁灵芝孢子粉提取得到灵芝孢子油，在加入石油醚，乙醇等有机溶剂和纯净水进行提取，提取得到的下层溶液进行浓缩，浓缩液使用大孔树脂柱等进行柱分离，用纯净水、50%乙醇及浓度大等于75%乙醇进行梯度洗脱；收集最后一次洗脱液经冷冻干燥后得到抗肿瘤组合物。通过本发明得到的组合物能抑制体外及体内的肿瘤细胞生长，抑瘤率达到56.3%以上。
文档编号A61K36/074GK103054910SQ201310043010
公开日2013年4月24日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者李晔, 姚渭溪, 周岩飞, 朱忠敏, 李卫东 申请人:福建仙芝楼生物科技有限公司