专利名称：一种免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot and moush disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus, FMDV)引起的一种使偶蹄类动物发生的急性、热性高度接触性的传染病。目前世界上很多国家都有这种疾病的流行，对畜牧业造成极大地经济损失。而且该病的隐性感染可以使患病动物的生产能力下降，造成巨大的经济损失，我国将其列为第一类动物疾病。目前，国际上在口蹄疫的防控上主要采取两种措施:紧急捕杀和免疫预防。在我国主要采取强制免疫预防，而对于急性爆发区采取封锁捕杀政策。疫苗的免疫注射是我国目 前预防口蹄疫的主要措施，但现在使用的口蹄疫疫苗主要以灭活疫苗为主，现有的灭活疫苗的缺点也很明显，在使用中存在疫苗免疫后抗体产生慢、抗体水平低、抗体持续期短及对变异毒株保护力差的缺点。兰兽研资料表明，口蹄疫灭活疫苗免疫后40天抗体才能达到有效保护水平，抗体有效期只能维持90天。冉多良等调查发现当前猪口蹄疫疫苗免疫30天后，抗体合格率仅在26%-60%之间。曹波等研究表明猪O型口蹄疫灭活疫苗免疫后3个月抗体效价水平明显下降，免疫保护率仅为67.77% ;与孟国庆等研究结果一致(66.7%);另外，李云岗等检测了 3个厂家的O型疫苗抗体水平，结果免疫后3个月基本下降到免疫保护临界值。所以在实际应用中，需要对免疫动物进行多次免疫，这些缺点不但造成了严重的经济损失，也不利于口蹄疫的疫情防控。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起猪的一种急性肠道传染病。该病由猪流行性腹泻病毒感染猪而引起，以 发热、厌食、水样腹泻、呕吐、严重脱水、消化道黏膜发炎及糜烂和食欲下降为主要特征，俗称冬季拉稀病。该病己成为世界流行性的疾病，是各养猪国家导致仔猪早期死亡的重要疫病之一。给养猪业造成严重的经济损失。猪流行性腹泻的灭活疫苗为铝胶佐剂，抗体产生期长，窗口期长，在冬季给免疫后未产生抗体的易感猪健康带来极大的风险。猪圆环病毒病是主要由猪2型圆环病毒(PCV2)引起的免疫抑制性疾病，表现为断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、仔猪心肌炎、增生性和坏死性肺炎、饲料报酬低、死亡率上升等。现有猪圆环病毒灭活苗，副反应较大，且需要免疫后3周加强免疫，给猪体带来严重的外界刺激。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫增强剂，能够显著提高免疫动物对抗原的免疫应答，提高抗体水平，从而提高疫苗的免疫效果，同时能够缩短免疫窗口期，延长保护期。本发明的另一目的是提供含有所述免疫增强剂的灭活疫苗，其免疫后抗体水平高，免疫效果好，免疫窗口期短，保护期延长。
本发明的目的是提供上述灭活疫苗的制备方法，该方法简单方便，成本低。一种免疫增强剂，所述免疫增强剂含有0.l-21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5_125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg /mL的β -葡聚糖。所述免疫增强剂为油乳剂。所述油乳剂的制备方法如下:
(O配制水相溶液:将含有单磷酰脂质Α、胞壁酰二肽和β -葡聚糖的母液与吐温-80混合，得到成水相溶液；
(2)配制油相溶液:将白油和司盘-80混合，得到油相溶液；
(3)将所述水相溶液与油相溶液混合乳化后，得所述兽用免疫增强剂。一种含有所述免疫增强剂的灭活疫苗。所述灭活疫苗还包括灭活的抗原溶液。所述灭活疫苗还包括油相溶液。所述免疫增强剂与灭活的抗原溶液组成了水相溶液，所述水相溶液与油相溶液的体积比为46:40-60 ;所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积比为1:1-3。所述油相溶液为ISA206。所述灭活的抗原溶液为灭活的猪O型口蹄疫病毒液、猪圆环病毒2型病毒液和猪流行性腹泻病毒液。一种所述灭活疫苗的制备方法，将免疫增强剂与灭活的抗原溶液混合，得到水相溶液；将水相溶液与油相溶液混合，得到灭活疫苗。本发明免疫增强剂由于其组分之间的协同效应，提高机体的免疫水平、对抗原的免疫应答，从而提高免疫后的抗体水平、缩短免疫窗口期，增强疫苗的免疫效果。本发明含有免疫增强剂的灭活疫苗，免疫后产生的抗体水平高，保护期长，免疫窗口期短。本发明含有免疫增强剂的灭活疫苗的制备方法简单，易操作，成本低。
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图1表示仔猪免疫不同疫苗后平均液相阻断ELISA抗体滴度随时间的变化。图2表示仔猪免疫不同疫苗后平均液相阻断ELISA抗体滴度随时间的变化。图3:各组仔猪免疫后血清的平均中和抗体水平；其中PEDV灭活苗是猪流行性腹泻灭活疫苗的缩写，PEDV灭活苗B是猪流行性腹泻灭活疫苗B的缩写，PEDV灭活苗C是猪流行性腹泻灭活疫苗C的缩写，PEDV灭活苗D是猪流行性腹泻灭活疫苗D的缩写。图4免疫后21天各组仔猪的ELISA抗体水平；其中PCV2自制灭活苗是猪圆环病毒灭活疫苗的缩写，PCV2灭活苗B是猪圆环病毒灭活疫苗B的缩写、PCV2灭活苗C是猪圆环病毒灭活疫苗C的缩写、PCV2灭活苗D是猪圆环病毒灭活疫苗D的缩写。
具体实施方式
: 单磷酰脂质A缩写为MPL。胞壁酰二肽缩写为MDP。MPL> MDP和β -葡聚糖均购自InvivoGen公司。ISA206购自赛百克公司。本发明，采用口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒(兰州兽医研究所)检测液相阻断ELISA抗体滴度。实施例1免疫增强剂I对口蹄疫灭活疫苗免疫效力的影响 1、实验材料
灭活的猪O型口蹄疫病毒液(毒株为猪O型口蹄疫病毒緬甸98株)，经二乙烯亚胺灭活，146s 含量为 4ug/mL。6-7周龄健康易感仔猪，液相阻断ELISA抗体滴度≤1:8。2、疫苗的配制:
免疫增强剂I含有2mg/mL的MPL、20mg/mL的MDP和0.4 mg/mL的β -葡聚糖，溶剂为
蒸馏水。将免疫增强剂I与灭活的猪O型口蹄疫病毒液按照体积比为1:3混合制备水相溶液。先将ISA206和水相溶液分别放置于室温，大约30分钟。将ISA206放入乳化罐中，在200转/分，将水相溶液放入乳化罐中，搅拌均匀；在2000转/分搅拌10分钟，得到疫苗I。其中水相溶液与ISA206的体积比为46:54。疫苗I中MPL浓度为0.23mg/mL, MDP浓度为
2.3mg/mL, β -葡聚糖浓度为 0.046mg/mL。配制MPL水溶液，其中MPL浓度为2mg/mL。采用MPL水溶液替代免疫增强剂I，按照疫苗I的制备方法制备对照疫苗1-1.配制MDP水溶液，其中MDP浓度为20mg/mL。采用MDP水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗I的制备方法制备对照疫苗1-2.配制β -葡聚糖水溶液，其中β -葡聚糖浓度为0.4 mg/mL。采用β -葡聚糖水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗I的制备方法制备对照疫苗1-3.配制MPL、β -葡聚糖水溶液，其中MPL浓度为2mg/mL，β -葡聚糖浓度为0.4mg/mL。采用MPL、β -葡聚糖水溶液替代免疫增强剂I，按照疫苗I的制备方法制备对照疫苗1-4.配制MPL、MDP水溶液，其中MPL浓度为2mg/mL，MDP浓度为20mg/mL。采用MPL、MDP水溶液替代免疫增强剂I，按照疫苗I的制备方法制备对照疫苗1-5.配制MDP、β -葡聚糖水溶液，其中MDP浓度为20mg/mL，β -葡聚糖浓度为0.4 mg/mL。采用MDP、β -葡聚糖水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗I的制备方法制备对照疫苗1-6.用蒸馏水替代免疫增强剂1，按照疫苗I的制备方法制备对照疫苗1-7。3、分组、免疫和抗体检测
将健康易感仔猪随机分组，每组10头，共8组。将疫苗1、对照疫苗1-1、对照疫苗1-2、对照疫苗1-3、对照疫苗1-4、对照疫苗1-5、对照疫苗1-6和对照疫苗1-7各免疫一组健康易感仔猪，免疫剂量为2 mL。免疫后第14天和第28天，对各组健康易感仔猪采血分离血清，检测液相阻断ELISA抗体滴度。当液相阻断ELISA抗体滴度大于等于26为抗体合格。免疫后第14天和第28天抗体合格率如表I所示。
表I各组仔猪免疫后第14天和第28天抗体合格率(抗体合格头数/免疫总头数)
权利要求
1.种免疫增强剂，其特征在于:所述免疫增强剂含有0.l_21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5-125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg /mL的β -葡聚糖。
2.据权利要求1所述免疫增强剂，其特征在于所述免疫增强剂为油乳剂。
3.据权利要求2所述免疫增强剂，其特征在于所述油乳剂的制备方法如下: (O配制水相溶液:将含有单磷酰脂质Α、胞壁酰二肽和β -葡聚糖的母液与吐温-80混合，得到成水相溶液； (2)配制油相溶液:将白油和司盘-80混合，得到油相溶液； (3)将所述水相溶液与油相溶液混合乳化后，得所述免疫增强剂。
4.种含有权利要求1所述免疫增强剂的灭活疫苗。
5.据权利要求4所述灭活疫苗，其特征在于:所述灭活疫苗还包括灭活的抗原溶液。
6.据权利要求5所述灭活疫苗，其特征在于:所述灭活疫苗还包括油相溶液。
7.据权利要求6所述灭活疫苗，其特征在于:所述免疫增强剂与灭活的抗原溶液组成了水相溶液，所述水相溶液与油相溶液的体积比为46:40-60 ;所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积比为1:1-3。
8.据权利要求7所述灭活疫苗，其特征在于:所述油相溶液为ISA206。
9.据权利要求8所述灭活疫苗，其特征在于:所述灭活的抗原溶液为灭活的猪O型口蹄疫病毒液、猪圆环 病毒2型病毒液和猪流行性腹泻病毒液。
10.种权利要求5-8之一所述灭活疫苗的制备方法，其特征在于:将免疫增强剂与灭活的抗原溶液混合，得到水相溶液；将水相溶液与油相溶液混合，得到灭活疫苗。
全文摘要
本发明提供一种免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法,涉及生物制药领域。免疫增强剂含有0.1-21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5-125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg/mL的β-葡聚糖。一种含有所述免疫增强剂的灭活疫苗。一种所述灭活疫苗的制备方法，将免疫增强剂与灭活的抗原溶液混合，得到水相溶液；将水相溶液与油相溶液混合，得到灭活疫苗。本发明免疫增强剂由于其组分之间的协同效应，提高机体的免疫水平、对抗原的免疫应答，从而提高免疫后的抗体水平、缩短免疫窗口期，增强疫苗的免疫效果。本发明含有免疫增强剂的灭活疫苗，免疫后产生的抗体水平高，保护期长，免疫窗口期短。
文档编号A61K39/135GK103083663SQ20131004298
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者陈瑾, 郑其升, 侯立婷, 李鹏成, 于晓明, 徐海, 侯继波 申请人:江苏省农业科学院