专利名称：一种以异型双功能试剂为连接桥的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明提供了一种新型的制备脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖结合疫苗的结合技术；基于此结合技术，制备 出了脑膜炎荚膜多糖结合疫苗，可用于脑脊髓膜炎等重要疾病的免疫预防，属于生物医药领域。
背景技术：
流行性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜发炎的疫症，至今仍未得到有效控制。脑膜炎奈瑟氏球菌主要经由咳嗽，喷嚏或接吻传播，由鼻咽部侵入血循环，最后局限于脑膜和脊髓膜，形成化脓性脑脊髓膜病变。常见的病征包括发高烧、剧烈头痛、后颈僵硬；亦会有嗜睡、呕吐、惧光或皮疹等情况出现。此病可引致脑部受损甚至死亡，病死率较高，维持在5-10%之间，遍见于世界各国，呈散发或大、小流行，以儿童发病率为高。使用抗生素可以有效治疗流行性脑膜炎。在未使用抗生素以前该病的病死率在70%左右，使用抗生素治疗以来病死率降低至5% 15%，甚至低于5%。然而，由于抗生素的过度使用，细菌的耐药菌株数量和种类迅速地增长，导致治疗更加困难。这引起了医学界的广泛忧虑，并增加了病人的治疗成本和难度。为了应对不断恶劣化的抗药性病菌对人类的威胁，世界各地的医生开始严格地控制使用抗生素，同时扩大疫苗的接种范围。因此，研制与开发预防流行性脑膜炎的疫苗具有十分重大的意义。脑膜炎奈瑟氏菌根据其荚膜多糖的特异性可将脑膜炎球菌分成A、B、C、D、29E、H、
1、K、L、W135、X、Y、Z十三个血清群，所有血清群的细菌均可致病，但A、C、W135和Y毒力最强，上述4个血清群占病例数的95%以上，是引起脑膜炎流行最常见的菌株。荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系统识别，防止补体系统被细菌表面的蛋白激活和免疫细胞吞噬。如果细菌被免疫细胞吞噬，荚膜多糖也能够避免细菌被杀灭。荚膜多糖是脑膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作为疫苗对较大的儿童有一定的保护力。然而，荚膜多糖对2岁以下婴幼儿、老年人以及B细胞免疫缺陷的人群免疫效果差，接种剂不能达到抗体保护水平，且抗体很快消失。该多糖疫苗与其它多糖疫苗一样，属T细胞非依赖性抗原，具有年龄相关的免疫原性，且不诱生T细胞依赖性的加强应答。通过将多糖与某种蛋白质共价结合，可使多糖转化成T细胞依赖性抗原，从而刺激婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可产生加强应答，同时还能提高免疫球蛋白(IgG)的抗体比例。这种多糖结合疫苗不仅能够保护婴幼儿(2岁以下儿童)，还能够大大地增强抵抗力差的病人对细菌感染的抵抗力，因此具有十分广阔的应用前景。细菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗最早出现在20世纪30年代，Goebel和Avery将3型肺炎球菌多糖连接到马血清球蛋白上，产生的偶联物能在动物身上产生多糖专一的抗体，同时提供相应的免疫保护。1987年，世界上第一个多糖蛋白结合疫苗，B型流感嗜血杆菌(HiB)多糖-破伤风类毒素(TT)结合疫苗被美国FDA批准进入市场。默克公司、辉瑞公司和诺华公司相继开发了 HiB多糖-破伤风类毒素结合疫苗和流行性脑膜炎多糖-破伤风类毒素结合疫苗，并成功上市。中国专利(ZL02159032.X)公开了一种多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，也是目前制备多糖结合疫苗最常使用的技术之一。在该技术中，以己二酸二酰肼(ADH)作为连接剂结合多糖与蛋白。这种结合方式首先需要将多糖经溴化氰活化，即在碱性条件下用溴化氰作用于多糖分子上的羟基，形成氰酸酯，然后与ADH反应；氰酸酯中的一个碳氧键断裂，与ADH—端的氨基发生加成反应，从而将酯酰肼(AH)基团导入多糖分子，形成多糖-AH衍生物；多糖-AH衍生物在碳二亚胺(EDAC)的介导下与载体蛋白形成稳定的结合物。这样的结合方式可减少多糖与载体蛋白结合的空间位阻，保留了多糖的抗原表位，同时避免了多糖本身的溶解性，减少多糖与抗血清反应的副作用。然而，上述传统的多糖-蛋白结合技术存在着以下不足之处:(I)多糖-AH衍生物会继续与溴化氰活化的多糖反应，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的结合效率；
(2)EDAC在介导ADH衍化多糖与载体蛋白结合的同时，容易弓丨起多糖与载体蛋白的自身交联，从而降低多糖-蛋白的结合效率；(3)多糖和载体蛋白均为大型生物分子，中间靠仅有6个碳原子长度的ADH相连，多糖和蛋白质的结构势必会相互影响，使得多糖的一些重要抗原表位易被蛋白质所屏蔽，进而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白结合疫苗的免疫原性和抗体持效性仍有待进一步提高，如多糖结合疫苗需要免疫三次才能产生免疫效果。这些不足之处限制了多糖结合疫苗的进一步发展。聚乙二醇(PEG)是一种安全的、良好水溶性、无免疫原性、无毒的聚合物，并被美国FDA批准在人体使用。PEG作为一种修饰剂已在开发蛋白质药物和运载药物的脂质体方面获得广泛应用，并取得良好的效果。2006年，Singh等(Vaccine, 2006，24:4161-4166)发现在包埋HIV-1的gp41表位的脂质体分子上引入PEG可增强疫苗的免疫保护效果。据推测是由于PEG分子能在脂质体周围形成水化层，导致免疫细胞吞噬作用下降，从而增强了疫苗的免疫持效性；同时，PEG分子还增加了抗体中和抗原的难度，从而增强了抗体产生强度。因此，将PEG分子作为连接桥来制备多糖-蛋白结合疫苗，预计能提高结合疫苗的免疫原性和抗体持效性。
发明内容
本发明提供了一种以异型双功能试剂为连接桥来制备多糖结合疫苗的技术，制备出了脑膜炎荚膜多糖结合疫苗。本发明的另一个目的还在于通过使用PEG作为多糖和蛋白之间的连接桥，进一步提高多糖结合疫苗的免疫原性和抗原持效性。本发明的脑膜炎荚膜多糖结合疫苗，其中的荚膜多糖为A群、B群、C群、W135群或Y群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。本发明的脑膜炎荚膜多糖结合疫苗，其中的蛋白载体为破伤风类毒素、CRM197、白喉类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、外毒素A、外膜复合物C、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌粘附素蛋白质、卵清蛋白、牛血清白蛋白或结核菌素纯化蛋白衍生物等。其中，所述的荚膜多糖和载体蛋白的质量比为(0.2 3): 1，以1:1为优。本发明涉及多糖结合疫苗的制备工艺 ，包括以下步骤:
I)多糖的活化取IOmg多糖溶于生理盐水中，使其终浓度为5mg/ml。然后，加入溴化氰活化
0.5-1.5小时，溴化氰终浓度为5 μ g/ml。溴化氰活化期间，用0.5M氢氧化钠维持溶液pH值为10.5。活化结束后，用0.5M的盐酸调节溶液pH值至8.5，终止反应。然后，分别加入三种不同的异型双功能试剂(N-2-胺乙基-马来酰亚胺，胺-PEG2K-马来酰亚胺和胺-PEG5K-马来酰亚胺)，多糖与异型双功能试剂的质量比为1: (0.5-10)，于室温下反应6-24小时；其中优化的质量比为1:1，于室温下反应16小时。多糖活化后的氰基与异型双功能试剂一端的氨基反应。反应结束后，用透析袋充分透析，除去未反应的溴化氰和异型双功能试剂。2)载体蛋白的活化载体蛋白溶于生理盐水中，浓度为8.5mg/ml，然后加入2_亚氨基硫烷(2-1minothiolane)进行活化6_24小时，载体蛋白与2-亚氨基硫烧的摩尔比为1: (10-50)，其中优化的活化时间为16小时，摩尔比为1:30。2-亚氨基硫烷会将载体蛋白上暴露在外面的氨基转化成巯基。活化结束后，用透析袋透析充分除去未反应的2-亚氨基硫烧。3)多糖与载体蛋白的偶联将第I步得到的活化多糖与第2步得到的活化载体蛋白混合，多糖与载体蛋白的质量比为(0.2-3): 1，于4°C下反应12-36小时，其中优化的质量比为1: 1，于4°C下反应24小时。4)多糖结合疫苗的分离纯化制备的多糖结合疫苗需要与未反应的多糖和载体蛋白分离开来。纯化方法选用分子排阻层析，优选Superdex200凝胶过滤柱(2.6cmX60cm)。本发明的多糖结合疫苗，可添加免疫佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝等佐剂，用于进一步提高疫苗的免疫原性。本发明制备了以PEG为连接桥的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其技术优势体现在以下几方面:I)本发明使用异型双功能试剂作连接桥，即连接桥两端不同的2个官能团能分别连接荚膜多糖和载体蛋白，可有效地避免在制备过程中荚膜多糖和蛋白质的自身偶联，能够提高结合产物的收率，并且利于产品的质量控制。2)本发明提供的多糖蛋白结合技术，未显著改变荚膜多糖和载体蛋白的结构特征。3)本发明使用PEG作为连接 桥，可有效延长荚膜多糖与载体蛋白之间的空间距离，减小了载体蛋白对荚膜多糖抗原表位的空间屏蔽效应，有利于提高荚膜多糖的免疫原性。4)本发明使用PEG作为连接桥，由于PEG亲水性较强，因此在水溶液中，其外侧会形成一个巨大水化层，该水化层会对载体蛋白与多糖分子形成不同程度的屏蔽效应，具体来讲，由于载体蛋白为球形，PEG水化层对其屏蔽效应会较为强烈，但多糖作为一种线状分子，PEG水化层对其屏蔽效应会大大减弱。
图1多糖结合疫苗的制备反应示意图。图2凝胶过滤分析多糖结合疫苗。用分析型凝胶过滤柱Superdex200 (IcmX 30cm)检测多糖结合疫苗。分析条件:流动相为20mM的磷酸缓冲液(pH7.4)，流速0.5毫升/分钟，检测波长为280纳米。图3 NMR分析多糖结合疫苗。1H-NMR分析由Bruker600MHz核磁共振仪完成。图4多糖结合疫苗产生的多糖特异性抗体。图a为多糖特异性的IgG抗体滴度；图b为多糖特异性的IgGl抗体滴度；图c为多糖特异性的IgG2a抗体滴度；图d为多糖特异性的IgG2a/1gGl。多糖特异性抗体滴度由ELISA方法测定。图5多糖特异性抗体的免疫持效性。通过测定三针免疫后18周内多糖特异性IgG的滴度，来研究多糖特异性抗体的免疫持效性。多糖特异性IgG滴度由ELISA方法测定。图6多糖结合疫苗产生的多糖特异性抗体的特异性。
具体实施方式
:实施例1:多糖结合疫苗的制备连接桥不含PEG的多糖结合疫苗(PS-TT)、以PEG2K为连接桥的多糖结合疫苗(PS-P2K-TT)、以PEG5K为连接桥的多糖结合疫苗(PS-P5K-TT)的制备反应如图1所示。将IOmg Y群脑膜炎球菌荚膜多糖溶于2ml生理盐水中，加入20 μ L溴化氰溶液(w/v50%)进行活化，室温反应I小时。活化过程中，用0.5M NaOH维持溶液的pH值为10.5。活化结束后，用0.5M的盐酸调节溶液的pH值至8.5，终止反应。随后分别加入IOmg N-2-胺乙基-马来酰亚胺，60mg胺-PEG2K-马来酰亚胺(PEG分子量为2kDa)和75mg胺-PEG5K-马来酰亚胺(PEG分子量为5kDa)。于室温反应过夜。反应结束后，用截留分子量为50kDa的滤膜于6000g离心5次，除去未反应的小分子，获得3种带马来酰亚胺基团(mal)的多糖活化产物，即 PS-mal、PS-P2K-mal 和 PS-P5K_mal。将破伤风类毒素(TT)与2-亚氨基硫烷以摩尔比1:30混合，反应pH值为7.4，于室温下反应12小时，2-亚氨基硫烷会将破伤风类毒素分子的氨基转化成巯基。用截留分子量为50kDa的滤膜于6000g离心5次，除去未反应的2-亚氨基硫烷。巯基化的破伤风类毒素分别与PS-mal、PS-P2K-mal和PS-P5K_mal的马来酰亚胺基团反应。巯基化的破伤风类毒素与活化的多糖以质量比1:1混合，反应PH值为7.4，于4°C下反应24小时，得到三种多糖结合疫苗，即 PS-TT、PS-P2K-TT 和 PS-P5K-TT。实施例2:对三种多糖结合疫苗的表征将实施例1所涉及的多糖-蛋白结合产物，用Superdex200凝胶过滤柱(2.6cmX60cm)进 行分离纯化，洗脱液为20mM的磷酸缓冲液(pH7.4)，流速为3毫升/分钟。分别收集对应于PS-TT、PS-P2K-TT和PS-P5K-TT的洗脱峰。以Superdex200凝胶过滤柱(1.0cmX30cm)对纯化产品进行鉴定,洗脱液为20mM的磷酸缓冲液(PH7.4)，流速为0.5毫升/分钟。如图2所示，与载体蛋白相比，PS-TT,PS-P2K-TT和PS-P5K-TT的出峰时间明显提前。这表明载体蛋白与肺炎荚膜多糖结合后，分子量显著增加。由于三种结合产物均在凝胶过滤柱的外水体积出峰，三种结合产物的出峰时间一致。用1H-NMR进行检测多糖结合疫苗。如图3所示，与荚膜多糖分子相比，PS-TT,PS-P2K-TT和PS-P5K-TT在0.4-1.4ppm处出现了特征峰，对应于载体蛋白的脂肪链氨基酸残基。在7.2ppm处出现了对应于载体蛋白的芳香族氨基酸残基的特征峰。这表明荚膜多糖分子成功地偶联了载体蛋白。如图3插图所示，PS-TT、PS-P2K-TT和PS-P5K-TT在6.2ppm处出现了对应于琥珀酰亚胺的特征峰，这表明多糖结合疫苗的连接桥中含有琥珀酰亚胺。此外，由于PEG分子中大量亚甲基的存在，PS-P2K-TT和PS-P5K-TT在3.6ppm处的特征峰强度要远大于PS-TT。这表明PS-P2K-TT和PS-P5K-TT的连接桥中PEG分子。因此，荚膜多糖在结合载体蛋白前后，其结构未发生明显改变。实施例3:多糖结合疫苗免疫原性的测定选取32只5周龄的雌性Blab/C小鼠，体重为15_22克。随机分为4组，即荚膜多糖组、PS-TT组、PS-P2K-TT组和PS-P5K-TT组，每组8只小鼠。腹腔注射，每只每次注射含有5微克多糖，每周注射I次，共注射3次。21天后眼眶取血。用ELISA法检测小鼠血浆中抗荚膜多糖的IgG、IgGl和IgG2a。如图4所示，荚膜多糖组产生的抗荚膜多糖的IgG和IgGl滴度较弱，而IgG2a未检测到。荚膜多糖与载体蛋白偶·联后抗体滴度显著增加。与荚膜多糖组相比，PS-TT组抗荚膜多糖的IgG和IgGl的抗体滴度分别是荚膜多糖组的37.1倍和58.6倍。PS-P2K-TT组产生的抗荚膜多糖抗体滴度要显著高于PS-TT组，其中IgG、IgGl和IgG2a的抗体滴度分别分别是PS-TT组的2.5倍、2.4倍和6.0倍。PS-P5K-TT组产生的抗荚膜多糖IgG.1gGl和IgG2a的抗体滴度分别分别是PS-TT组的1.6倍、1.4倍和10.9倍。PS-P2K-TT组和PS-P5K-TT组的IgG2a/IgGl分别是PS-TT组的2.9倍和9.1倍。这表明PEG能增强多糖结合疫苗的Thl型免疫应答。实施例4:多糖特异性抗体的免疫持效性通过测定三针免疫后18周内多糖特异性抗体的滴度，来研究多糖特异性抗体的免疫持效性。如图5插图所示，荚膜多糖组产生的多糖特异性IgG滴度较低，随着注射时间增加而逐渐降低，第4周后已无法检测到。如图5所示，PS-P5K-TT组产生的多糖特异性IgG滴度要低于PS-P2K-TT组，而高于PS-TT组。三种结合产物的多糖特异性IgG滴度在第2周达到峰值，在第4-18周内逐渐下降，其中PS-TT组的下降速度最快。第18周后，PS-TT组、PS-P2K-TT组和PS-P5K-TT组的多糖特异性IgG滴度分别是其峰值的11.9%, 23.0%和19.2%。因此，PEG能够增强多糖特异性抗体的免疫持效性。实施例5:多糖特异性抗体的特异性和亲合性向200倍稀释的PS-TT组、PS-P2K-TT组和PS-P5K-TT组小鼠血浆中加入不同量的荚膜多糖，用ELISA方法检测小鼠血浆中抗荚膜多糖的抗体水平。如图6所示，随着多糖加入量的增加，多糖特异性抗体结合96孔板中多糖的能力逐渐降低。当加入的多糖达到15 μ g时，抗体结合多糖的能力丧失。这表明小鼠产生的抗荚膜多糖抗体能够特异性地结合荚膜多糖。用硫氰酸铵法测定抗荚膜多糖的抗体亲合性。荚膜多糖组的多糖特异性抗体亲和指数为1.18mol/L，而PS-TT组、PS-P2K-TT组和PS-P5K-TT组的抗体亲和指数分别为
2.25mol/L、2.09mol/L和2.16mol/L。这表明结合载体蛋白能显著提高多糖特异性抗体的
亲合性。
权利要求
1.一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗，以共价键的方式将脑膜炎荚膜多糖连接到载体蛋白上。
2.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，以聚乙二醇(PEG)为连接桥连接脑膜炎荚膜多糖和载体蛋白，PEG的分子量为200-10000Da，优化的PEG分子量为2000Da。
3.根据权利要求2所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其特征在于所述PEG为异型双功能试剂，以PEG分子为骨架，结构式为NH2-PEG-R, PEG分子的一端为氨基，PEG分子的另一端(R)为能与巯基反应的化学基团，其中，优选的R基团为马来酰亚胺酯。
4.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，以不含PEG的异型双功能试剂为连接桥连接脑膜炎荚膜 多糖和载体蛋白，不含PEG的异型双功能试剂的结构式为NH2-R1-R2，一端为氨基，另一端(R2 )为能与巯基反应的化学基团，其中，优选的R2基团为马来酰亚胺酯。
5.根据权利要求4所述的不含PEG的异型双功能试剂NH2-R1-R2，Rl为碳数为1_10的烷基，优选的异型双功能试剂为N-2-胺乙基-马来酰亚胺。
6.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，所用的脑膜炎荚膜多糖为A群、B群、C群、W135群和Y群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。
7.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，所用的载体蛋白包括但不限于破伤风类毒素、CRM197、白喉类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、外毒素A、外膜复合物C、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌粘附素蛋白质、卵清蛋白、牛血清白蛋白或结核菌素纯化蛋白衍生物。
8.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于由以下三步组成:(1)脑膜炎球菌多糖的活化反应与衍化反应；(2)载体蛋白的巯基化；(3)衍化的脑膜炎球菌多糖与巯基化的载体蛋白结合。
9.根据权利要求8所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于脑膜炎球菌多糖的活化反应与衍化反应先用溴化氰活化脑膜炎球菌多糖，然后用含PEG或不含PEG的异型双功能试剂去衍化脑膜炎球菌多糖。
10.根据权利要求9所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于衍化反应于室温下进行6-24小时，以16小时为优。脑膜炎球菌多糖与异型双功能试剂的质量比为 1: (0.5-10)，以 1:1 为优。
11.根据权利要求8所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，载体蛋白的巯基化，所用的巯基化试剂能将载体蛋白的氨基转化为巯基，所用的巯基化试剂包括但不限于2-亚氨基硫烧(2-1minothiolane),载体蛋白与2-亚氨基硫烧的摩尔比为1: (10-50),以 1:30 为优。
12.根据权利要求8所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，衍化的脑膜炎球菌多糖与巯基化的载体蛋白结合步骤中，脑膜炎球菌多糖和载体蛋白的质量比为(0.2-3):1，以1:1为优；于4°C下反应12-36小时，以24小时为优。
13.按权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗制剂是注射剂型。
14.按权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，可用于预防脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌的感染。
全文摘要
本发明提供了一种以含PEG的异型双功能试剂作桥连剂的新型多糖结合疫苗制备技术，并基于此技术，开发出了脑膜炎球菌多糖结合疫苗，此技术的优势在于(1)避免了传统工艺中多糖和蛋白质各自的自身交联，提高了产率，也利于质量控制；(2)长的PEG链可增大多糖和蛋白质之间的距离，降低两者之间相互的空间屏蔽效应，提高多糖结合疫苗的免疫原性。
文档编号A61K39/095GK103083652SQ201310047118
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者胡涛, 安文琪, 苏志国, 范蓓, 黄庆瑞, 马小伟, 潘若文 申请人:中国科学院过程工程研究所, 华兰生物工程股份有限公司, 华兰生物疫苗有限公司