专利名称：一种雪菊总黄酮的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于天然产物有效成分提取技术领域，特别涉及一种从天然产物雪菊中提取分离总黄酮的提取方法，同时还涉及该总黄酮作为抗氧化剂在医药和化妆品行业中的应用。
背景技术：
雪菊不是一个独立的物种，其实是生长在新疆的蛇目菊的商品名称，其学名是:蛇目菊、双色金鸡菊。在新疆人们称之为:雪菊、昆仑雪菊、昆仑血菊、天山雪菊、高寒雪菊、高寒香菊等。它是维吾尔族世代传承集养生、保健和维药材一身的天然植物，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振及疮疖肿毒等症。雪菊由于生长环境较少污染、富含多种对人体有益成分，故现今已经逐渐作为一种茶饮普及开来。目前，已从雪菊中分离鉴定出20余类，300多种天然成分，包括30多种黄酮类物质，30多种人体必需的矿物元素，20多种氨基酸，数十种芳香族化合物，还有丰富的有机酸、萜烯类、维生素、木脂体、酶类、多糖等具有生物活性的天然成分。其中，总黄酮含量可达12%左右，远远超过了其他各种菊类。现代药理研究表明，雪菊中的黄酮类物质，是一种很强的抗氧化剂，可有效地清除体内的氧自由基。自由基生物学研究表明，氧自由基可以导致生物分子如蛋白质、脂质以及DNA的氧化损伤，能引起心脑血管疾病、糖尿病、癌症等多种的疾病。而雪菊总黄酮这种阻止氧自由基氧化的能力是维生素E的10倍以上，可以有效的阻止细胞的退化、衰老及癌变的发生。该总黄酮作为抗氧化剂在医药和化妆品行业中的应用目前尚未见报道。因此，该总黄酮在医药和化妆品行业中的具有广阔的应用前景和研究价值。有关雪菊总黄酮的提取分离目前已有报道，主要有①水提醇沉，树脂分离纯化；②有机溶剂萃取，大孔树脂分离纯化。 这些方法均不同程度地存在提取率较低，有机溶剂用量大、处理时间长、环境污染严重、不利于人体健康等缺点。因此研究绿色环保、简单方便的中药成分提取分离方法已成为当今生物医药的前沿课题之一。膜分离技术是一种使用半透膜分离方法，其分离原理是依据物质分子尺度的大小，借助膜的选择渗透作用，在外界能量或化学位差的推动作用下对混合物中双组分或多组分溶质和溶剂进行分离、分级提纯和富集，从而达到分离、提纯和浓缩的目的。双水相分离技术是指某些有机物之间或有机物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后，形成互不相溶的两相或多相体系即双水相体系。利用不同物质在双水相体系中有不同的分配系数，当物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，表现出一定的分配系数，从而达到分离纯化的目的。膜分离技术联合双水相分离技术对天然产物的提取分离有极大的优势，通过对体系中的不同组分实现选择性的分离，可以达到分子水平上的分离和纯化。该技术属于物理分离方法，具有活性损失小、分离步骤少、操作条件温和，易于工艺放大和连续操作等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种雪菊总黄酮的制备方法和用途，该方法采用膜分离技术联合双水相分离技术对天然产物雪菊进行了提取分离，得到雪菊总黄酮，通过该方法获得的雪菊总黄酮经试验证实雪菊总黄酮具有清除氧自由基抗氧化延缓衰老和美白的功效，开拓了雪菊新的应用价值。本发明所述的一种雪菊总黄酮的制备方法，按下列步骤进行:
一种雪菊总黄酮的制备方法，其特征在于按下列步骤进行:
a、将干燥的雪菊粉碎过20-60目筛成药粉，用8-10倍量的浓度为60-80%的乙醇加热回流1-2小时，提取2-3次，合并提取液，滤过，回收乙醇，并浓缩至在温度50°C时测定相对密度为1.10-1.20，得到浓缩液；
b、将步骤a浓缩液用水按体积比1:1稀释，静置，过滤，滤液以15000转/分离心分离，取离心后所得上清液，再用孔径0.02-0.1 μ m的微滤膜除沉过滤，跨膜压力为0.5Mpa-l.0Mpa，料液温度25_35°C，得到透过液；
C、将步骤b的透过液进行中空纤维超滤膜分离，跨膜压力微0.5Mpa-l.0Mpa，料液温度为25-35°C，得到超滤液；
d、将步骤c的超滤液再进行中空纤维纳滤膜分离，跨膜压力为1.0Mpa-2.0Mpa，料液温度为25-35°C，得浓缩液；
e、将步骤d所得浓缩液减压浓缩，干燥得固状物；
f、将步骤e的固状物采用双水相萃取，在室温2000-4000转/分离心，双水相体系分为上下两相，取上相减压浓缩，干燥，即可得到雪菊总黄酮。步骤c中空纤维超滤膜的截留分子量为2000-8000。步骤d中空纤维纳滤膜的截留分子量为200-600。步骤f双水相萃取的体系为按3-5mL乙醇+5_7mL水+2_4g硫酸铵+0.15g固状物混合均匀。所述的方法获得的雪菊总黄酮在制备抗氧化剂的药物中的用途。所述的方法获得的雪菊总黄酮在制备妆品行业中的用途。本发明所述的一种雪菊总黄酮的制备方法，通过该方法获得的雪菊总黄酮含量测定方法:
利用黄酮类化合物与三氯化铝作用后生成黄酮的铝盐络合物而黄色深浅与黄酮的含量成一定的比例关系的原理，对雪菊总黄酮进行定量测定。1、供试品溶液的制备:精密称取温度105°C干燥至恒重的雪菊总黄酮适量，加甲醇溶解，定量转移到IOmL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
2、对照品溶液的制备:精密称取温度105°C干燥至恒重的芦丁对照品适量10.05mg，力口入甲醇使其溶解，转移至25mL容量瓶中，定容，摇匀即得芦丁标准液(0.402mg/mL)；
3、标准曲线的制备:精密吸取对照品溶液液0.5，1.0,2.0,3.0, 4.0, 5.0mL,分别置于25mL容量瓶中，加水至6mL，按顺序依次分别加入5% NaNO2溶液1.0mL混匀，放置6min，加10% AL (NO2) 3溶液1.0mL放置6min，再加入4% NaOH溶液10mL，并加蒸馏水稀释至刻度摇匀放置15min;以不加芦丁为空白，在波长510nm下分别测定其吸光度值(A);以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，得回归方程:A=12.02C-0.0110，r=0.9997，浓度C与吸光度A在8.04-80.4 μ g/mL范围内线性良好；
4、含量测定:精密吸取样品溶液1.0mL，加蒸馏水至6mL，按“3项”下的条件测定吸光度，平行测定3次，按回归方程计算雪菊中总黄酮的含量。本发明所述的一种雪菊中总黄酮的制备方法和用途，其优点是:本发明克服了现有提取分离技术的不足，采用膜分离技术联合双水相分离技术对雪菊提取物进行了提取分离，膜分离技术和双水相分离技术属于物理分离方法，既不破坏物质成分，又有选择性，是一种低能耗，低污染的分离方法。该方法提高了目标成分-总黄酮的含量，去除了大部分无效成分，产品的活性成分得到了有效富集。本发明因为对分离目标有较高的选择性，所以可根据实际对产品的需要，改变微滤膜、超滤膜和纳滤膜规格和操作条件，从而方便的控制所得目标产物的组成。用本发明提供的方法从雪菊中分离纯化总黄酮，有效成分富集率高，损失少，产物中总黄酮含量达到90%以上，在不改变有效成分结构的前提下，缩短了生产周期，降低了能耗，产品质量得到了大幅提高。本发明所提供的方法具有分离步骤少、操作条件温和易于工艺放大和连续操作等优点，是一种绿色环保型萃取技术。
图1为本发明不同质量分数雪菊总黄酮的抗氧化能力图，其中一 一为雪菊总黄酮，一■一为Vc ；
图2为本发明不同质量分数雪菊总黄酮抑制酪氨酸酶的活性图，其中一 一为雪菊总黄酮，一■ 一为熊果苷。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
进一步说明本发明，但并不局限于下列实施方式；
实施例1
取干燥雪菊粉碎，过20目筛，取2kg雪菊药粉，加入10倍量浓度为60%乙醇溶液加热回流I小时，提取2次，合 并提取液，滤过，回收乙醇，并浓缩至在温度50°C时测定相对密度为1.10-1.20，得到浓缩液；
将浓缩液用水稀释为药材:药液=1:1的溶液(指将浓缩液用水稀释成与药材重量体积相等的溶液，即IOOg药材，将浓缩液稀释成IOOml )，静置，过滤，滤液以15000转/分离心分离，取离心后所得上清液，采用孔径0.02μ m的微滤膜除沉过滤，跨膜压力为0.5Mpa，料液温度为25°C，得到透过液；
将所得透过液用截留分子量为2000的超滤膜超滤，跨膜压力0.5Mpa，料液温度为25°C，得到超滤液；
将超滤液再进行截留分子为200中空纤维纳滤膜分离，跨膜压力1.0Mpa，料液温度为25°C，得到浓缩液，再减压浓缩，干燥得固状物；
将固状物采用双水相萃取，双水相萃取体系比按5mL乙醇+5mL水+2g硫酸铵+0.15g固状物混合均匀，在室温2000转/分离心，双水相体系分为上下两相，取上相减压浓缩，干燥，即可得到雪菊总黄酮，本品含总黄酮(以芦丁记)为93.5%。实施例2
取干燥雪菊粉碎，过40目筛，取2kg雪菊药粉，加入9倍量浓度为70%乙醇溶液加热回流2小时，提取2次，合并提取液，滤过，回收乙醇，并浓缩至在温度50°C时测定相对密度为
1.10-1.20，得到浓缩液；将浓缩液用水稀释为药材:药液=1: I的溶液，静置，过滤，滤液以15000转/分离心分离，取离心后所得上清液，以孔径0.04μ m的微滤膜除沉过滤，跨膜压力为1.0Mpa，料液温度30°C，得到透过液；
将所得透过液用截留分子量为4000的超滤膜超滤，跨膜压力1.0Mpa，料液温度30°C，得到超滤液；
将超滤液再进行截留分子量为400的中空纤维纳滤膜分离，跨膜压力2.0Mpa，料液温度30°C，得浓缩液，再减压浓缩，干燥得固状物；
将固状物采用双水相萃取，双水相萃取体系比按4mL乙醇+6mL水+3g硫酸铵+0.15g固状物混合均匀，在室温3000转/分离心，双水相体系分为上下两相，取上相减压浓缩，干燥，即可得到雪菊总黄酮，本品含总黄酮(以芦丁记)为96.7%。实施例3
取干燥雪菊粉碎，过60目筛，取2kg雪菊药粉，加入8倍量浓度为80%乙醇溶液加热回流I小时，提取3次，合并提取液，滤过，回收乙醇，并浓缩至在温度50°C时测定相对密度为1.10 1.20，得到浓缩液；
将浓缩液用水稀释为药材:药液=1: I的溶液，静置，过滤，滤液以15000转/分离心分离，取离心后所得上清液，以孔径0.08 μ m的微滤膜除沉过滤，跨膜压力为1.0Mpa,料液温度35°C，得到透过液；
将所得透过液用截留分子量为8000的超滤膜超滤，跨膜压力1.0Mpa，料液温度35°C，得到超滤液；`
将超滤液再进行截留分子量为600的中空纤维纳滤膜分离，跨膜压力1.0Mpa，料液温度35°C，得浓缩液，再减压浓缩，干燥得固状物；
将固状物采用双水相萃取，双水相萃取体系比按3mL乙醇+7mL水+4g硫酸铵+0.15g固状物混合均匀，在室温4000转/分离心，双水相体系分为上下两相，取上相减压浓缩，干燥，即可得到雪菊总黄酮，本品含总黄酮(以芦丁记)为95.9%。实施例4
通过本发明所述方法获得的雪菊总黄酮经试验证实雪菊总黄酮具有清除氧自由基抗氧化延缓衰老和美白的功效，为其以后在医药和化妆品行业的应用提供依据，有关实验资料如下:
I材料:
1.1试剂:
将实施例1-实施例4得到任意一种雪菊总黄酮；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH.)，分析纯，北京恒业中远化工有限公司；酪氨酸酶，北京恒业中远化工有限公司；熊果苷和维生素Vc，分析纯，上海源叶生物科技有限公司；
1.2主要仪器:
UV5500型紫外-可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司；
2方法:
2.1清除自由基抗氧化能力检测:
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH.)是一种稳定的有机自由基，最大吸收波长为516nm，在乙醇溶液中，每个DPPH.可生成一个稳定的含氮自由基，具有典型的紫色，当它与提供I个电子的自由基清除剂作用时，生成无色产物，使溶液的典型紫色变浅，其褪色程度与配对电子数成化学计量关系；因而可用分光光度法进行定量分析来检测自由基清除情况，从而评价样品的抗氧化能力；其抗氧化能力用清除率来表示，清除率越大，则表明其抗氧化能力越强；实验通过DPPH.法检测雪菊总黄酮的抗氧化能力，以标准Vc为阳性对照，比较它们抗氧化能力的大小；
待测样品溶液的配置:将清除自由基抗氧化的活性成分(雪菊总黄酮和V。)分别用去离子水配制成质量分数为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%的溶液，备用；每组样品溶液平行实验3次，测试样1:2960yL DPPH.溶液(I ΧΙΟ—4 mo I / L无水乙醇溶液)与40 μ L待测样品溶液；测试样2:2960 μ L DPPH.溶液(ΙΧΙΟΛιοΙ / L无水乙醇溶液)与40 μ L去离子水；测试样3:2960 μ L无水乙醇与40 μ L待测样品溶液；
3个测试样品液同时配制好后，在温度25°C下恒温反应30 min，转移至3mL比色皿中，于516 nm处测吸光度A，按以下公式计算对自由基的清除率:
清除率=[(A2 +A3 -A1) / A2 ] X 100%
式中A1为待测样品组的吸光度值;A2为空白组的吸光度值;A3为待测样品组在反应体系中自身的吸光度值；。2.2美白功效检测:
酪氨酸酶是黑色素细胞合成反应的限速酶，具有酪氨酸羟基酶和多巴羟基酶两方面活性。样品对酪氨酸酶抑制作用越好，美白效果越明显。酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴，多巴转化生成多巴醌，多巴醌呈红褐色，在475 nm处有最大吸收值，利用分光光度测定加入美白剂和未加美白剂反应中生成多巴醌量的变化来检测美白剂对酪氨酸酶的抑制率；实验通过抑制酪氨酸酶活性的方法检测雪菊总黄酮美白功效，以熊果苷为阳性对照，比较它们美白功效的大小；待测样品溶液的配置:抑制酪氨酸酶的活性成分(雪菊总黄酮和熊果苷)分别用去离子水配制成质量分数为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的溶液，备用；每组样品溶液平行实验3次，测试样1:0.5 mL的L-酪氨酸溶液(质量分数0.1%)+2.0 mL磷酸缓冲液(pH =6.8)+0.5 mL酪氨酸酶溶液(用磷酸缓冲液配置，质量浓度为200 Ug /mL);测试样2:2.5 mL磷酸缓冲液(pH:6.8) +0.5 mL酪氨酸酶溶液(用磷酸缓冲液配置，质量浓度为200 yg / mL);测试样3:0.5 mL的L-酪氨酸溶液(质量分数0.1%)+0.5mL测试样品溶液+ 1.5 mL磷酸缓冲液(pH=6.8)+0.5 mL酪氨酸酶溶液(用磷酸缓冲液配置，质量浓度为200 yg / mL);测试样4:0.5 mL的测试样品溶液+2.0 mL磷酸缓冲液(pH=6.8) +0.5 mL酪氨酸酶溶液(用磷酸缓冲液配置，质量浓度为200 μ g / mL )。4个测试样品液同时配制好后，在温度25°C下恒温反应3.5 h，转移至3 mL比色皿中，于475nm处测吸光度A，按以下公式计算对酪氨酸酶的抑制率:
抑制率=[1 一 (A3 一 A4 ) / (A1 — A2) ] X 100%
式中A1为空白组的吸光度值;A2为反应体系自身的吸光度值；A3为待测样品组的吸光度值-A4为待测样组在反应体系中自身的吸光度值；
3结果:
3.1清除自由基抗氧化能力实验结果:
雪菊总黄酮和Vc溶液清除自由基抗氧化能力的比较见图1，从图1可知，雪菊总黄酮具有体外清除自由基抗氧化的能力，且清除率和雪菊总黄酮的浓度成正相关性；在医药品中，普遍采用清除自由基活性最强的物质之一 Vc作为阳性对照来评价某种物质清除自由基抗氧化的能力，清除效果越接近Vc，表明该物质清除自由基抗氧化的效果越好；从图1可以看出，质量分数为0.4%的雪菊总黄酮对自由基的清除率几乎达到了同浓度下Vc溶液的水平，表明雪菊总黄酮具有很好的抗氧化性能，可以作为延缓衰老的药品原料药使用。3.2美白功效实验结果: 雪菊总黄酮和熊果苷溶液美白功效的比较如图2所示，从图2可知，雪菊总黄酮具有体外抑制酪氨酸酶活性的能力，且抑制率和雪菊总黄酮的浓度成正相关性；熊果苷是国际上公认的一种能够抑制酪氨酸酶活性，具有美白功效的物质，它可以在较低的浓度下有效抑制酪氨酸酶的活性，阻断皮肤中酪氨酸在酪氨酸酶的催化下转变为黑色素，从而减少黑色素的生成，达到美白的效果；因此，在化妆品行业中一般用熊果苷作为阳性对的效果越接近熊果苷，表明该物质抑制酪氨酸酶效果越好，从而减少黑色素形成，达到美白效果，从图2可以看出，雪菊总黄酮抑制酪氨酸酶的能力基本与同浓度的熊果苷溶液接近，证明雪菊总黄酮具有一定的美白功效，可以作为美白化妆品添加剂使用。
权利要求
1.一种雪菊总黄酮的制备方法，其特征在于按下列步骤进行: a、将干燥的雪菊粉碎过20-60目筛成药粉，用8-10倍量的浓度为60-80%的乙醇加热回流1-2小时，提取2-3次，合并提取液，滤过，回收乙醇，并浓缩至在温度50°C时测定相对密度为1.10-1.20，得到浓缩液； b、将步骤a浓缩液用水按体积比1:1稀释，静置，过滤，滤液以15000转/分离心分离，取离心后所得上清液，再用孔径0.02-0.1 μ m的微滤膜除沉过滤，跨膜压力为0.5Mpa-l.0Mpa，料液温度25_35°C，得到透过液； C、将步骤b的透过液进行中空纤维超滤膜分离，跨膜压力微0.5Mpa-1.0Mpa，料液温度为25-35°C，得到超 滤液； d、将步骤c的超滤液再进行中空纤维纳滤膜分离，跨膜压力为1.0Mpa-2.0Mpa，料液温度为25-35°C，得浓缩液； e、将步骤d所得浓缩液减压浓缩，干燥得固状物； f、将步骤e的固状物采用双水相萃取，在室温2000-4000转/分离心，双水相体系分为上下两相，取上相减压浓缩，干燥，即可得到雪菊总黄酮。
2.根据权利要I所述的方法，其特征在于步骤c中空纤维超滤膜的截留分子量为2000-8000。
3.根据权利要I所述的方法，其特征在于步骤d中空纤维纳滤膜的截留分子量为200-600。
4.根据权利要I所述的方法，其特征在于步骤f双水相萃取的体系为按3-5mL乙醇+5-7mL水+2-4g硫酸铵+0.15g固状物混合均匀。
5.一种权利要I所述的方法获得的雪菊总黄酮在制备抗氧化剂的药物中的用途。
6.一种权利要I所述的方法获得的雪菊总黄酮在制备妆品行业中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种雪菊总黄酮的制备方法和用途，该方法采用膜分离技术联合双水相分离技术对天然产物雪菊进行了提取分离，得到雪菊总黄酮，通过该方法获得的雪菊总黄酮经试验证实雪菊总黄酮具有清除氧自由基抗氧化延缓衰老和美白的功效，开拓了雪菊新的应用价值。
文档编号A61K36/28GK103083379SQ201310064628
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者周军, 张琼, 孙江兵, 曾平, 雷权, 卢静, 陈召晖 申请人:中国人民解放军兰州军区乌鲁木齐总医院