专利名称：一种仙台病毒抗原肽组合物及其在仙台病毒感染检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种仙台病毒抗原肽组合物及其在仙台病毒感染检测中的应用。
背景技术：
仙台病毒(Sandaivirus)属于副粘病毒科副粘病毒亚科、呼吸道病毒属病毒，为单股负链RNA病毒，是一种实验啮齿类常见和高发的感染性副流感病毒，是引起啮齿类动物呼吸系统疾病的主要病原，小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等啮齿类实验动物均易感。仙台病毒多数情况下无明显临床表现，但会对实验动物的免疫系统产生影响，在合并其他细菌性病原体的感染后造成致死性的影响，是啮齿类实验动物必须排查的病原体，其传染性强，容易扩散，在多数情况下呈隐性感染，可影响幼鼠发育成长和降低成年鼠的繁殖率，改变体内细胞免疫反应，且很难从鼠群中清除。1953年在日本仙台的一次新生儿肺炎流行中首次分离出，又名Hemagglutinating virus of Japan(HVJ),即Fushimi株。由于许多特性与流感不同，以后又陆续分离到其他毒株，故命名为副流感病毒。
仙台病毒几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性。其表面具有血凝素和溶血素，溶血素有溶细胞作用，能溶解某些动物的红细胞，与病毒的感染性有关，血凝素则能凝集某些哺乳类和禽类的红细胞。仙台病毒感染可侵犯呼吸道的表层组织，在上皮细胞中增殖，所致的免疫反应不牢固易再次感染，成人中通常引起轻型呼吸道感染，而5岁以下儿童发病率高、病情重，表现为急性阻塞性喉-支气管-气管炎和肺炎。由于仙台病毒不仅感染动物，而且还会导致儿童患严重的呼吸道疾病，所以开发一种能够及时的、准确的检测仙台病毒感染的产品，对动物和人类的健康具有重要意义。目前的检测多采用血清学的方法包括ELISA、IFA以及血凝抑制实验等。这些血清学的检测方法比较经典，在实际应用中却存在一些问题，而最为主要的是血清学检测使用的抗原质量的稳定性和适用性。在血清学检测中最为关键的因素是抗原的质量。抗原的特异性和代表性，抗原的免疫原性和抗原性，这些因素均会影响到最终对血清学检测结果的判定。近年来随着多肽展示技术的应用，已经针对许多病原体的特异抗原表位进行了相关分析，也找到了一些有用的多肽表位，有些在微生物检测中也得到了应用。使用的线性表位多肽库，虽然不能包含天然空间构象表位，但是仍有许多线性表位具有良好的抗原性，多个抗原表位的组合可以很好的满足血清学检测的需要。在目前的国家标准推荐的检测方法中使用病毒全颗粒作为抗原物质来检测实验动物血清中可能存在的抗体。但是由于病毒全颗粒在实验室的扩增培养以及分离纯化等过程中存在着许多的变量，包括病原体本身的变异、每次生产病毒可能掺入的非特异性抗原成分等，这些因素均会影响到抗原的稳定性。虽然病毒全颗粒保证了全部抗原位点的存在，但是抗原暴露的不同方式也会影响到抗原表位的展示最后影响检测工作的结果。而且病毒全颗粒抗原会和其他病原体的产生交叉抗原最终影响检测的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种仙台病毒抗原肽组合物及其在仙台病毒感染检测中的应用，本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物提高了多肽组合的特异性和针对性，因此可提高实验动物微生物检测的准确性。本发明提供了一种仙台病毒抗原肽组合物，包括具有如SEQ ID NO:1所示序列的多肽、如SEQ ID NO:2所示序列的多肽和如SEQ ID N0:3所示序列的多肽。本发明还提供了一种仙台病毒抗原肽组合物,包括在具有如SEQ ID NO:1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、在具有如SEQ ID NO:2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和在具有如SEQ ID N0:3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。优选地，本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物中，在具有如SEQ ID NO:1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性大于85% ；优选地，本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物中，在具有如SEQ ID NO:2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽的氨基酸序列与SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的同源性大于85% ；优选地，本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物中，在具有如SEQ ID NO:3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽的氨基酸序列与SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的同源性大于85%。本发明提供的抗原肽组合物中的抗原肽是仙台病毒的优势抗原表位，且分子量较小，因此降低了与其他分子发生交叉反应的可能，提高了多肽组合的特异性和针对性，从而提高了对仙台病毒感染检测的准确率。优选地，编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。优选地，编码如SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的DNA分子，具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。优选地，编码如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的DNA分子，具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种仙台病毒疫苗，包括本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物及药学上可接受的辅料。其中，本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物，包括具有如SEQ ID NO:1所示序列的多肽、SEQ ID NO:2所示序列的多肽和SEQ ID NO:3所示序列的多肽，或包括在具有如SEQID NO:1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、在具有如SEQ IDN0:2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和在具有如SEQ IDNO:3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。优选地，本发明提供的仙台病毒疫苗的剂型为口服制剂或注射剂。
由于本发明提供的抗原肽组合物中的抗原肽是仙台病毒的优势抗原表位，所以在制备疫苗时，可减少仙台病毒对动物的危害。
另外，本发明还提供了本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物在仙台病毒感染检测中的应用。其中，本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物，包括具有如SEQ ID NO:1所示序列的多肽、SEQ ID NO:2所示序列的多肽和SEQ ID NO:3所示序列的多肽，或包括在具有如SEQID NO:1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、在具有如SEQ IDN0:2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和在具有如SEQ IDNO:3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。用抗原的优势表位检测动物体是否感染该抗原的原理是:当动物体感染抗原后，动物体就会产生针对该抗原的抗体，该抗体分布在动物的血清中，通过检测血清中该抗体的存在与否，就能得知动物体是否感染抗原。动物体产生的抗体一般是针对抗原的优势表位，即所产生的抗体能特异性的与抗原的优势表位相结合。所以通过抗原优势表位检测血清中是否存在与其结合的抗体，就能得知动物体是否感染该病毒。本发明提供了一种非诊断目的检测仙台病毒感染的方法，包括以下步骤:步骤1:将本发明提供的抗原肽组合物包被到酶标板上，经第一洗涤后封闭，获得封闭后的酶标板；步骤2:取待测样品加入封闭后的酶标板中，经孵育、第二洗涤、标记二抗、第三洗涤后显色，获得受检溶液；步骤3 :取受检溶液，用酶标仪检测OD45tl值，采用Cut off值法判断检测结果；Cut off值法判断的标准为:受检溶液的OD45tl值> S+3SD为阳性，受检溶液的OD45tl值< ;+2SD为阴性，X+3SD >受检溶液的OD450的值> X+2SD为可疑，重新测受检溶液的OD450值，受检溶液的OD45tl值小于I+3SD则判为阴性；其中， 为所有阴性对照样品的OD45tl平均值，SD为所有阴性样品OD45tl的标准差；阴性对照样品与待测样品的检测方法一致；其中，本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物，包括具有如SEQ ID NO:1所示序列的多肽、SEQ ID NO:2所示序列的多肽和SEQ ID NO:3所示序列的多肽，或包括在具有如SEQID NO:1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、在具有如SEQ IDN0:2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和在具有如SEQ IDNO:3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。^值和SD值对某一物种而言为固定值，可在检测后保存，再次检测时可不对阴性对照进行检测。作为优选，包被具体为:将100 μ L含有10 μ g/mL抗原肽组合物的包被缓冲液加入酶标板上，4 0C条件下放置过夜。优选地，包被缓冲液的pH为9.6。更优选地，包被缓冲液的溶剂为蒸馏水。更优选的，包被缓冲液中Na2CO3的质量-体积浓度为1.59g/L，NaHCO3的质量体积浓度为2.93g/L。
作为优选，第一洗涤采用洗涤缓冲液。优选地，洗涤缓冲液洗涤缓冲液pH值为7.4。更优选地，洗涤缓冲液的溶剂为蒸馏水。更优选地，洗涤缓冲液中各组分的含量为:
权利要求
1.一种仙台病毒抗原肽组合物，其特征在于，包括具有如SEQ ID N0:1所示序列的多肽、SEQ ID NO:2所示序列的多肽和SEQ ID N0:3所示序列的多肽。
2.一种仙台病毒抗原肽组合物，其特征在于，包括在具有如SEQ ID N0:1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、在具有如SEQ ID NO: 2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和在具有如SEQ ID N0:3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
3.一种编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ IDN0:4所示的核苷酸序列。
4.一种编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ IDN0:5所示的核苷酸序列。
5.一种编码SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ IDN0:6所示的核苷酸序列。
6.一种仙台病毒疫苗，其特征在于，包括如权利要求1 2任一项所述的抗原肽组合物及药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的剂型为口服制剂或注射剂。
8.如权利要求1 2任一项所述的抗原肽组合物在仙台病毒感染检测中的应用。
9.一种非诊断目的检测仙台病毒感染的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1:将如权利要求1 2任一项所述的抗原肽组合物包被到酶标板上，经第一洗涤后封闭，获得封闭 后的酶标板； 步骤2:取待测样品加入所述封闭后的酶标板中，经孵育、第二洗涤、标记二抗、第三洗涤后显色，获得受检溶液； 步骤3:取所述受检溶液，用酶标仪检测OD45tl值，采用Cut off值法判断检测结果； 所述Cut off值法判断的标准为: 受检溶液的0队5(|值> t3SD为阳性， 受检溶液的0队5(|值< T、-2SD为阴性， X+3SD >受检溶液的OD450的值> ;+2SD为可疑，重新测受检溶液的OD45tl值，受检溶液的OD45tl值小于I+3SD则判为阴性； 其中，S为阴性对照样品的OD450平均值，SD为阴性样品OD45tl的标准差。
10.一种仙台病毒感染检测试剂盒，其特征在于，包括包被有如权利要求1 2任一项所述抗原肽组合物的平板、洗涤缓冲液、样品稀释液、终止液和底物缓冲液。
全文摘要
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及仙台病毒抗原肽组合物及其在仙台病毒感染检测中的应用。本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物包括具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽、SEQ ID NO:2所示序列的多肽和SEQ ID NO:3所示序列的多肽，或包括在具有如SEQ ID NO:1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基的多肽、在具有如SEQ ID NO:2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基的多肽和在具有如SEQ ID NO:3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基的多肽。本发明提供的仙台病毒抗原肽组合物分子量小，降低了与其他分子发生交叉反应的可能性，提高了检测准确性。
文档编号A61K39/155GK103159859SQ20131009499
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者向志光, 杨志伟, 佟巍, 刘先菊, 李雨函, 魏强 申请人:中国医学科学院医学实验动物研究所, 北京华阜康生物科技股份有限公司