延长的可溶性ph20多肽及其用途的制作方法

专利名称：延长的可溶性ph20多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了包括延长的可溶性PH20多肽在内的可溶性PH20多肽及其用途。本发明还提供了其他C端截短的PH20多肽和部分去糖基化的PH20多肽以及它们的用途。
背景技术：
乙酰透明质酸(透明质酸；HA)是在许多细胞的胞外基质中，特别是在软结缔组织中发现的多肽。HA还主要在哺乳动物的皮肤、软骨和滑液中发现。乙酰透明质酸还是眼睛玻璃体的主要成分。HA在各种生理过程中发挥作用，如水和血衆蛋白稳态(Laurent TC etal (1992) FASEB J6:2397-2404)。某些疾病与乙酰透明质酸的表达和/或产生有关。透明质酸酶是降解乙酰透明质酸的酶。通过催化HA，透明质酸酶可以用于治疗与HA或其他糖胺聚糖的积累相关的疾病或病症。而且，因为HA是间质屏障的主要组分，所以透明质酸酶增加了组织通透性并因此可以用于增加治疗剂的分散和递送。各种透明质酸酶在治疗上使用(例如Hydase 、Vitrase 和Wydase )，通常作为分散和铺展剂与其他治疗剂组合。许多这样的透明质酸酶是绵羊或牛形式，对于人治疗可能具有免疫原性。亟需可以用于治疗的改进的透明质酸酶组合物。发明概述本文提供了包括延长的可溶性PH20(esPH20)多肽在内的可溶性PH20多肽和组合物。本文提供的PH20多肽为C端截短的可溶性蛋白，并且包括缺少所有GP1-锚附着信号(anchor attachment signal)序列的那些PH20多肽(例如在氨基酸位置450-490处截短的)。可溶性PH20多肽还包括延长的可溶性PH20多肽，其保留了一个或多个位于相应全长野生型PH20多肽的GP1-锚附着信号序列的残基。本文还提供了含有C端截短的其他修饰的PH20多肽。本文还提供了任何多肽的部分去糖基化形式。本文还提供了利用本文提供的PH20多肽的治疗方法。本文提供了分离且基本上纯化的延长的可溶性PH20(esPH20)透明质酸酶，其可以为N-糖基化或N-部分糖基化的。在一些实例中，N-部分糖基化的esPH20多肽含有至少一个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少两个N-联部分的每一个，例如SEQ ID NO: 107的氨基酸残基368和393或者与SEQ ID NO: 107的氨基酸残基368和393对应的残基。在一些方面，N-部分糖基化的esPH20多肽含有至少两个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少两个N-联部分的每一个。本文提供的N-部分糖基化的esPH20多肽还可以含有支化的糖。本文提供了 esPH20多肽，其具有SEQ ID NO:60-63和102-104中任一个所示的氨基酸序列或者其等位基因或物种变体。本文还提供了 esPH20多肽变体，其与SEQ IDNO:60-63 和 102-104 的任一个具有至少 40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列相同性，并且保留了至少30%的相应的未修饰形式或由核酸编码的多肽的透明质酸酶活性，所述核酸编码具有SEQ ID NO: 107的氨基酸36-482的多肽。这样的esPH20多肽保持可溶并且在中性条件下是有活性的。在一实例中，esPH20为人esPH20，如具有SEQ ID NO:60-63和102-104中任一个所示的氨基酸序列的 esPH20 ;或者黑猩猩esPH20，如具有SEQ ID NO: 197 的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494,36-495,36-496,36-497 或 36-498 所示的氨基酸序列的 esPH20。本文还提供了基本上纯化的PH20多肽。这些PH20多肽可以具有SEQID NO:55-63和64-95中任一个所示的氨基酸序列或者其等位基因或物种变体。在其他实例中，PH20多肽为与 SEQ ID NO:55-63 和 64-95 的任一个具有至少 40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列相同性的变体，其保留了至少30%的相应的未修饰形式或由核酸编码的多肽的透明质酸酶活性，所述核酸编码具有SEQID NO: 107的氨基酸36-482的多肽。这样的PH20多肽在中性条件下是有活性的。本文提供的PH20多肽可以是N-糖基化或N-部分糖基化的。在一些实例中，N-部分糖基化的esPH20多肽含有至少一个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少两个N-联部分的每一个，例如SEQ ID NO: 107的氨基酸残基368和393或者与SEQ IDNO: 107的氨基酸残基368和393对应的残基。在一些方面，N-部分糖基化的PH20多肽含有至少两个N-乙酰葡 糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少两个N-联部分的每一个。本文提供的N-部分糖基化的PH20多肽还可以含有支化的糖。在一些方面，本文提供的PH20多肽是可溶的，并且可以选自人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴(cynomolgus monkey)、小鼠、兔、豚鼠、奶牛或绵羊PH20。本文提供的esPH20和PH20多肽可以被修饰，例如唾液酸化(sialation)、白蛋白化(albumination)、法尼基化、羧基化、羟基化或磷酸化。在一些方面，esPH20和PH20多肽被诸如葡聚糖或PEG的聚合物修饰。本文还提供了含有esPH20或PH20多肽的缀合物。示例性缀合物包括esPH20或PH20缀合至多聚化结构域(如Fe结构域)、毒素、可检测标记或药物的缀合物。本文提供了编码上述和本文提供的esPH20和PH20多肽的核酸。这些核酸包括编码具有以下氨基酸的esPH20或PH20多肽的核酸:与SEQ ID NO: 107的氨基酸36-450、36-451、36-452、36-453、36-454、36-455、36-456、36-457、36-458、36-459、36-460、36-461、36-462、36-463、36-464、36-465、36-484、36-485、36-486、36-487、36-489、36-491、36-492、36-493,36-494,36-495,36-496或36-497对应的氨基酸；以及包括编码具有以下氨基酸的 esPH20 的核酸:与 SEQ ID NO: 197 的氨基酸 36-491,36-492,36-493,36-494,36-495,36-496、36-497或36-498对应的氨基酸。本文还提供了含有这些核酸的载体以及含有所述载体的细胞，如CHO细胞。本文提供了含有任意一种或多种本文所述的esPH20或PH20多肽的组合物。在一些实例中，所述组合物含有多种esPH20或PH20多肽。例如，所述组合物可以含有多种esPH20多肽，其由编码以下氨基酸的核酸分子编码:与SEQ ID NO: 107的氨基酸36-450、36-451、36-452、36-453、36-454、36-455、36-456、36-457、36-458、36-459、36-460、36-461、36-462、36-463、36-464、36-465、36-484、36-485、36-486、36-487、36-489、36-491、36-492、36-493,36-494,36-495,36-496或36-497对应的氨基酸；以及由编码具有以下氨基酸的esPH20 的核酸分子编码:与 SEQ ID NO: 197 的氨基酸 36_491、36-492、36-493、36_494、36-495、36-496、36-497或36-498对应的氨基酸。在一些实例中，所述组合物含有从CHO细胞分泌的esPH20或PH20多肽。本文提供的组合物可以为药物组合物。在一些实例中，所述组合物含有额外的治疗剂，所述治疗剂可以与所述组合物一起配制或配制在单独的组合物中。可以包括在本文提供的组合物中的治疗剂的实例为化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀变形虫剂(amoebicidal agent)、杀毛滴虫剂(trichomonocidal agent)、抗帕金森剂、抗痕剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、a -肾上腺素能激动剂(alpha-adrenergic agonist agent)、a阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀细菌剂、抑菌剂、P肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、避孕剂、减充血剂、利尿剂、抑制剂(depressant agent)、诊断剂、电解质剂、催眠剂、激素剂、升血糖齐U、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂(muscle contractant agent)、眼科剂(ophthalmic agent)、拟副交感神经剂、心力加强剂(psychic energizer agent)、镇静剂、拟交感神经剂、安定齐U、泌尿剂(urinary agent)、阴道剂、杀病毒剂、维生素剂、非类固醇抗炎剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多 肽、蛋白、核酸、药物、有机分子和睡眠诱导剂(sleep inducer)。在特定的实例中，治疗剂为抗体、免疫球蛋白、二膦酸盐(如唑来膦酸(zolentronic acid))、细胞因子、化疗剂或胰岛素(如速效胰岛素)。可以包含在本文提供的组合物中的其他治疗剂包括但不限于:阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式维生素A酸)；别嘌醇；六甲蜜胺；阿伏西地；安巴腙；安波霉素；阿美蒽醌；氨磷汀；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；安曲霉素；阿帕奇醌；精美司那；三氧化二砷 ’天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴诺蒽醌；巴他布林；巴马司他；活卡介苗(BCG Live);贝那昔滨；莱达莫司汀；莱佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；比立考达；比生群；比生群；甲磺酸双奈法德；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素C ;卡鲁睾酮；卡纳替尼；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡钼；卡波醌；卡莫氟；卡莫司汀与聚苯丙生(Carmustines withPolifeprosans);卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来考昔；西马多丁 ；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；施钼锭；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷脂质体(Cytarabine liposomal);阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D ;达贝泊汀a ;柔红霉素脂质体(Daunorubicin liposomal);柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素-毒素连接物；右尼古地平；右奥马钼(Dexonnaplatin);右雷佐生；地扎狐宁；地卩丫醌；二溴螺氯铵(Dibrospidium);地诺孕素；地那林(Dinalin);地舍莫来；多西他赛；多非喹达；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体(Doxorubicin liposomal);盐酸多柔比星；盐酸多柔比星脂质体注射液(Docorubicin HCL liposome injection);多柔比星；屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依考莫司汀；依达曲沙；艾特咔林；依氟鸟氨酸；依拉克达(Elacridar);依利奈法德；Elliott’ s B Solution ;依沙芦星；乙卩密替氟；恩洛钼；恩普氨酯；恩扎啕林；依匹哌啶；表柔比星；阿法依泊汀；依他前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16 ;依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；
5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；力口柔比星；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/奥佐米星；吉罗酚；吉马替康；吉美嘧啶；格洛沙腙；葡磷酰胺；醋酸戈舍瑞林；羟基脲；替伊莫单抗；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；伊洛马司他；甲磺酸伊马替尼；伊美克；英丙舒凡；吲地磺胺；英丙醌；干扰素a -2a ；干扰素a-2b;干扰素a ;干扰素@ ;干扰素Y ;干扰素；白介素-2和其他白介素(包括重组白介素)；茚托利辛；碘苄胍[131-1];异丙钼；伊立替康；伊索拉定；伊沙匹隆；酮曲沙；L_阿拉诺新；兰瑞肽；拉帕替尼；来多蒽琼；来曲唑；亚叶酸；亮丙立德；亮丙瑞林(亮丙立德)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛钼；洛美曲索；洛莫司汀/CCNU ;洛莫司汀；氯那法尼(Lonafarnib);洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酹；美登素；氮芥(Mechlorethamine);氮芥/氮芥(Nitrogen mustard);醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；MelphalanslL-PAM ;美诺立尔；美雄烷；巯嘌呤；6_巯嘌呤(Mecaptopurine);美司钠；美替辛德；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；氯苯氨唳；美妥替哌；米钼；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C ;丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；米伏布林；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；莫立替尼；麦考酚酸；苯丙酸南诺龙；奈达钼；奈拉滨(Nelzarabine);奈莫柔比星；尼曲卩丫唳；诺考达唑；诺莫单抗；诺拉霉素；诺拉曲塞；诺托生琼；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马钼；奥他赛；奥替拉西；奥沙利钼；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇 ；帕米膦酸(Pamidronate);帕土匹龙(Patubilone);培加酶；培门冬酶；培非司亭；培得星；培利霉素；吡利曲索；培美曲塞；奈莫司汀；喷司他丁 ；培洛霉素；培磷酰胺；哌立福辛；吡钼(Picoplatin);吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；匹蒽醌；普来曲塞；普卡霉素(Plicamycid)光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；卟吩姆(Porfimer);紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；丙螺氯铵(Prospidium);嘌喃替派；嘌呤霉素；批唑呋林；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；链黑霉素(Rufocromomycin);沙柔比星；沙芬戈；沙格司亭；沙钼；司钼；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；磷乙酰天冬氨酸(Sparfosate);膦门冬酸；司帕霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺钼；螺钼；角鲨胺；链黑霉素(Streptonigrin);链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；苹果酸舒尼替尼；
6-TG;他地那兰；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；他立喹达；牛磺莫司汀；替可加兰；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26 ;替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤(Thiamiprine);硫鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；噻唑呋林(Tiazofurin);噻氯咪索；替洛隆；汀考达；噻莫西酸；替拉扎明；托匹生琼；托泊替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲贝替定(海鞘素743);曲妥珠单抗；曲托龙(Trestolone);维々酸/ATRA ;曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；四硝酸三钼(Triplatin Tetranitrate);曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；戊柔比星；伐司朴达(Valspodar);伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗辛；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄链霉素A (Xanthomycin A’s)(胍甲环素)；折尼钼；亚苄维C[2-H];净司他丁 ；唑来膦酸(Zoledronate);佐柔比星；和佐舒喹达。本文提供了治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况的方法，其中向个体给予本文提供和描述的esPH20或PH20，或者含有esPH20或PH20的组合物。本文还提供了这样的方法，其用于治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖积累、治疗心血管病症、治疗眼病症、治疗肺疾病、增加化疗剂对实体瘤的渗透、治疗皮下脂肪团(cellulite)、或者增加药物和其他治疗剂的生物利用度。这样的方法包括向个体给予任何本文所述的esPH20或PH20多肽或者组合物。 本文提供的esPH20和PH20多肽可以用于代替PH20透明质酸酶，单独或组合地用于以下公开中所用的PH20透明质酸酶的任何治疗方法或联合治疗:美国公开第US20040268425号、第US20050260186号和第US20060104968号以及美国申请系列号12/381，844、12/386，249、12/387，225 和 12/386，222。


图1描述了人(SEQ ID NO: 107)和黑猩猩(SEQ ID NO: 197)PH20多肽的氨基酸序列的比对(利用ClustalW2比对程序进行)。人PH20GP1-锚附着信号序列的氨基酸残基和黑猩猩PH20序列中的相应氨基酸为黑体和下划线。表示在比对中上面的残基在两个序列中是相同的。表示保守性取代，而”表示半保守性取代。图2描述了脊椎动物中N-聚糖的主要类型，包括高甘露糖聚糖、杂合(hybrid)聚糖和复杂(complex)聚糖。图3描述了内切糖苷酶切割位点。图3A示出内切糖苷酶Fl和肽N糖苷酶F(PNGaseF)的切割位点。图3B示出内切糖苷酶F2和PNGaseF的切割位点。图3C示出内切糖苷酶F3和PNGaseF的切割位点。图3D示出内切糖苷酶F4和PNGaseF的切割位点。发明详述综述A.定义B.综述1.PH20a.糖基化b.GP1-锚定C.延长的可溶性PH20多肽1.人 esPH20 多肽
2.其他物种esPH20多肽
D.N-部分糖基化的PH20多肽1.PH20 多肽2.C端截短的PH20多肽3.额外修饰缀合至聚合物E.产生编码延长的可溶性PH20和其他可溶性PH20透明质酸酶及其多肽的核酸的方法1.载体和细胞2.表达a.原核细胞b.酵母细胞c.昆虫细胞d.哺乳动物细胞e.植物3.纯化技术 F.延长的可溶性PH20多肽和其他可溶性PH20多肽的制备、制剂和给药1.注射剂、溶液和乳剂冻干粉2.体表(topical)给药3.用于其他给药途径的组合物4.剂量和给药5.包装、制品和试剂盒G.测定1.透明质酸酶活性2.溶解性H.治疗方法及延长的可溶性PH20和其他可溶性PH20的用途及联合治疗1.用作铺展剂和联合治疗2.用于去除过量的糖胺聚糖(Glycosaminoglycanase)a.在癌症治疗中的用途b.在治疗脑中的糖胺聚糖积累中的用途c.在治疗心血管疾病中的糖胺聚糖积累中的用途d.在玻璃体切开术以及眼病症和疾病状况中的用途e.在皮下输液中的用途f.在基因治疗中的用途g.美容用途h.在器官移植中的用途1.在肺疾病中的用途3.其他用途1.实施例A.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同意义。整个公开中提到的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站和其他公开的材料，除非另有说明，整体援引加入本文。如果本文的术语有多种定义，则以本节中的为准。当提及URL或者其他这样的标识符或地址时，应当理解这些标识符可以改变，并且在网络上特定的信息可以交流，但是通过搜索网络可以找到等同的信息。对其引用证明了这些信息的可得性和公开传播。如本文所用，透明质酸酶指降解乙酰透明质酸的一类酶。透明质酸酶包括但不限于细菌透明质酸酶(EC4.2.2.1或EC4.2.99.1)，来源于水蛭、其他寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶(EC3.2.1.36)，以 及哺乳动物型透明质酸酶(EC3.2.1.35)。透明质酸酶包括任何非人来源的透明质酸酶，包括但不限于鼠、犬、猫、兔、鸟、牛、绵羊、猪、马、鱼、蛙、细菌，以及来源于水蛭、其他寄生虫和甲壳动物的任何透明质酸酶。示例性人透明质酸酶包括HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和PH20(SEQ ID NO: 107)。透明质酸酶还包括可溶性透明质酸酶，包括绵羊和牛PH20、可溶性人PH20及rHuPH20。可商购的牛或绵羊可溶性透明质酸酶的实例为Vitrase :透明质酸酶(绵羊透明质酸酶)和Amphadase :透明质酸酶(牛透明质酸酶)。如本文所用，PH20指存在于精子中并且在中性条件下是有活性的一类透明质酸酶。PH-20存在于精子表面和溶酶体衍生的顶体，其中PH-20结合至顶体内膜。PH20包括任何来源的PH20，包括但不限于人、黑猩猩、食蟹猴、恒河猴、鼠、牛、绵羊、豚鼠、兔和大鼠来源。示例性PH20多肽包括来自人(SEQ ID NO: 107)、黑猩猩(SEQ ID NO: 197)、恒河猴(SEQID NO: 198)、食蟹猴(SEQ ID NO: 114)、奶牛(例如 SEQ ID NO: 111 和 119)、小鼠(SEQ IDNO: 117)、大鼠(SEQ ID NO: 116)、兔(SEQ ID NO: 112)、绵羊(SEQ ID NO: 113、118 和 120)和豚鼠(SEQ ID NO: 115)的PH20多肽。所指的PH20包括前体PH20多肽和成熟PH20多肽(如其中信号序列已被去除的PH20多肽)，具有活性的其截短形式；并且包括等位基因变体和物种变体，剪接变体编码的变体，以及其他变体，其包括与SEQ ID NO: 107和109所示的前体多肽或其成熟形式具有至少 40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列相同性的多肽。PH20多肽还包括含有化学或翻译后修饰的PH20多肽以及不含有化学或翻译后修饰的PH20多肽。这样的修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化(farnysylation)、羧基化、轻基化、磷酸化和其他本领域已知的多肽修饰。截短的PH20透明质酸酶是其任何C端缩短的形式，特别是当N-糖基化时截短和在中性条件下是有活性的形式。如本文所用，可溶性PH20指在生理条件下可溶的任何形式的PH20。例如，可溶性PH20可以通过在37° C下其分配入Triton X-114溶液的水相来鉴定(Bordier etal.，(1981) J.Biol.Chem.，256:1604-7)。膜锚定 PH20，如包括 GP1-锚定的 PH20 在内的脂质锚定PH20，会分配入去污剂丰富相，但是用磷脂酶-C处理后会分配入去污剂贫乏相或水相。可溶性PH20包括膜锚定PH20，其中与PH20锚定至膜相关的一个或多个区域已被去除或修饰，其中可溶性形式保留透明质酸酶活性。可溶性PH20还包括重组可溶性PH20，以及包含在天然来源中或从天然来源纯化的可溶性PH20，例如来自绵羊或奶牛的睾丸提取物。这样的可溶性PH20的实例为可溶性人PH20。如本文所用，可溶性人PH20或sHuPH20包括在C端缺少全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚序列的PH20多肽，从而在表达时，多肽在生理条件下是可溶的。溶解性可以通过任何在生理条件下证明溶解性的合适方法来评价。这样的方法的实例为Triton X-114测定，其评价分配入水相并且如上文和实施例中所述。此外，如果在诸如CHO-S细胞的CHO细胞中产生，则可溶性人PH20多肽为表达并分泌入细胞培养基中的多肽。然而，可溶性人PH20多肽不限于在CHO细胞中产生的可溶性人PH20多肽，其可以在任何细胞中或通过任何方法产生，包括重组表达和多肽合成。所指的在CHO细胞中的分泌是定义性的。因此，如果多肽可以在CHO细胞中表达和分泌并且是可溶的，即当用Triton⑧X-114提取时分配入水相，则无论是否是这样产生的，其都为可溶性PH20多肽。sHuPH20多肽的前体多肽可以包括信号序列，如异源或非异源(即天然)信号序列。前体的实例为包括信号序列的前体，如在氨基酸位置1-35处的天然35氨基酸信号序列(参见，例如SEQ ID NO: 107的氨基酸1-35)。如本文所用，“延长的可溶性PH20”或“esPH20”包括可溶性PH20多肽，其含有直至GPI锚附着信号序列的残基以及来自GP1-锚附着信号序列的一个或多个连续残基，从而esPH20在生理条件下是可溶的。生理条件下的溶解性可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测定。例如，其可以通过如上文和实施例中所述的Triton⑩X-114测定来评价。此夕卜，如上文所述，如果在诸如CHO-S细胞的CHO细胞中产生，则可溶性PH20为表达并分泌入细胞培养基中的多肽。然而，可溶性人PH20多肽不限于在CHO细胞中产生的多肽，其可以在任何细胞中或通过任何方法产生，包括重组表达和多肽合成。所指的在CHO细胞中的分泌是定义性的。因此，如果多肽可以在CHO细胞中表达和纯化并且是可溶的，即当用Triton= X-114抽提时分配入水相，则无论是否是这样产生的，其为可溶性PH20多肽。除残基36-490之外，人可溶性esPH20多肽还包括从SEQ ID NO: 107的氨基酸残基位置491开始的一个或多个连续氨基酸，从而所得的多肽是可溶的。示例性人esPH20可溶性多肽为具有与SEQID NO: 107 的氨基酸 36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496 和 36-497 对应的氨基酸残基的多肽。其实例为具有SEQ ID N0:60-63和102-104中任一个所示的氨基酸序列的人esPH20可溶性多肽。还包括等位基因变体和其他变体，如任何与SEQ ID NO:60-63和 102-104 的相应多肽具有 40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列相同性的变体，其保持在中性条件下是有活性的并且是可溶的。所指的 序列相同性指具有氨基酸取代的变体。如本文所用，所指的esPH20包括前体esPH20多肽和成熟esPH20多肽(如其中信号序列已被去除的esPH20多肽);具有酶活性(保留全长形式的至少1%、10%、20%、30%、40%、50%或更多)并且可溶的其截短形式；还包括等位基因变体和物种变体；剪接变体编码的变体；以及其他变体，包括与SEQ ID NO: 107和109所示的前体多肽或其成熟形式具有至少 40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列相同性的多肽。如本文所用，所指的esPH20还包括含有化学或翻译后修饰的esPH20以及不含有化学或翻译后修饰的esPH20。这些修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、磷酸化和其他本领域已知的多肽修饰。如本文所用，可溶性重组人PH20(rHuPH20)指在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达和分泌的人PH20的可溶形式。可溶性rHuPH20由包括信号序列的核酸编码，并且如SEQ ID NO: 109所示。还包括其等位基因变体和其他可溶性变体的DNA分子。将编码可溶性rHuPH20的核酸在分泌成熟多肽的CHO细胞中表达。当在培养基中产生时，在C端具有异质性，从而产物包括多种物质(species)的混合物，其可以包括各种丰度的SEQ ID NO: 122至SEQ ID NO: 127的任一种或多种。相似地，对于诸如esPH20的其他形式的PH20，重组表达的多肽及其组合物可以包括在C端表现出异质性的多种物质。例如，通过表达SEQ ID N0:8的多肽而产生的重组表达的esPH20的组合物可以包括含有较少氨基酸的形式，如36-496、36-495，该SEQ ID NO:8编码具有氨基酸36-497的esPH20。如本文所用，N-联部分指多肽的天冬酰胺(N)氨基酸残基，其能够被多肽的翻译后修饰糖基化。人PH20的示例性N-联部分包括SEQ ID NO: 107所示的人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368 和 N393。如本文所用，N-糖基化的多肽指含有至少3个N-联氨基酸残基的寡糖键的PH20多肽或其截短形式，例如与SEQ ID NO: 107的氨基酸残基N235、N368和N393对应的N-联部分。N-糖基化的多肽可以包括3、4、5个和高达所有N-联部分连接至寡糖的多肽。N-联寡糖可以包括甘露低聚糖，复杂、杂合或硫酸化的寡糖，或者其他寡糖和单糖。如本文所用，N-部分糖基化的多肽指最少含有一个N-乙酰葡糖胺聚糖的多肽，所述N-乙酰葡糖胺聚糖连接至至少3个N-联部分。部分糖基化的多肽可以包括各种聚糖形式，包括单糖、寡糖和支化的糖形式，包括那些通过用End0H、EndoFl、EndoF2和/或EndoF3处理多肽形成的形式。例如，这样的酶对聚糖的切割在图2中描述。如本文所用，去糖基化的PH20多肽指本文提供的PH20多肽，其中少于所有可能的糖基化位点是糖基化的。可以影响去糖基化，例如通过去除糖基化、通过阻止糖基化或修饰多肽以消除糖基化位点。如本文所示，特定的N-糖基化位点不是活性所需要的，而其余的是。 如本文所用，乙酰透明质酸相关疾病、病症或疾病状况指任何疾病或疾病状况，其中乙酰透明质酸水平作为起因、结果或者在疾病或疾病状况中观察到的其他方式而升高。乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况与组织或细胞中升高的乙酰透明质酸表达、增加的组织液压力、减少的血管容积和/或组织中增加的水含量相关。乙酰透明质酸相关疾病、病症或疾病状况可以通过给予含有乙酰透明质酸降解酶例如透明质酸酶如可溶性透明质酸酶的组合物来治疗，单独或者与另一疗法和/或物质组合或者除另一疗法和/或物质之外给予。示例性疾病和疾病状况包括但不限于乙酰透明质酸丰富的癌症，例如肿瘤，包括实体瘤，如晚期癌症、转移癌、未分化癌、卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和其他癌症。此外，乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况的实例为与升闻的组织液压力相关的疾病，如与椎间盘压力(disc pressure)相关的疾病和水肿，例如器官移植、中风、脑外伤或其他损伤引起的水肿。示例性乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况包括与升高的组织液压力、减少的血管容积和/或组织中增加的水含量相关的疾病和疾病状况，包括癌症、椎间盘压力和水肿。在一实例中，乙酰透明质酸相关疾病状况、疾病或病症的治疗包括对于增加的组织液压力(IFP)、减少的血管容积和组织中增加的水含量的一个或多个的改善、减轻或其他有益效果。如本文所用，缀合物指直接或间接连接至一个或多个其他多肽或化学部分的可溶性PH20多肽。这样的缀合物包括融合蛋白、通过化学缀合产生的缀合物和通过任何其他方法产生的缀合物，由此至少一个可溶性PH20多肽直接或间接连接至其他多肽或化学部分，只要缀合物保留透明质酸酶活性。本文提供的缀合物的实例包括直接或间接连接至诸如Fe部分的多聚化结构域、毒素、标记或药物的PH20多肽。如本文所用，融合蛋白指核酸序列编码的多肽，所述核酸序列含有来自一个核酸分子的编码序列和来自另一个核酸分子的编码序列，其中所述编码序列在相同的阅读框中，从而当融合构建体在宿主细胞中转录和翻译时，产生含有两个蛋白的蛋白。两个分子可以在构建体中相邻或被接头(linker)多肽分开，所述接头多肽含有1、2、3个或更多，但通常少于10、9、8、7或6个氨基酸。融合构建体编码的蛋白产物称为融合多肽。融合多肽的实例包括Fe融合。如本文所用，缀合至诸如透明质酸酶的乙酰透明质酸降解酶的聚合物指直接或通过接头来共价或其他方式稳定连接至乙酰透明质酸降解酶的任何聚合物。这样的聚合物通常增加血清半衰期，并且包括但不限于唾液酸部分、聚乙二醇化部分、葡聚糖和糖以及其他部分，如糖基化部分。如本文所用，活性指多肽或其部分与全长(完整)蛋白相关的功能活性或多种活性。功能活性包括但不限于生物学活性、催化或酶促活性、抗原性(结合或与多肽竞争结合至抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力和特异性结合至多肽的受体或配体的能力。如本文所用，透明质酸酶活性指酶促催化切割透明质酸的能力。用于透明质酸酶的美国药典(USP)XXII测定通过测量较高分子量的透明质酸或乙酰透明质酸的量来间接测定透明质酸酶活性，将酶切(enzyme)后剩余的(HA)底物与HA在37° C 下反应 30min (USP XXI1-NF XVII (1990) 644-645United States PharmacopeiaConvention, Inc, Rockville, MD)。在测定中可以使用参考标准溶液以确定任何透明质酸酶的相对活性单位。确定透明质酸酶的透明质酸酶活性的体外测定为本领域已知并且本文所述，所述透明质酸酶例如PH20， 包括可溶性PH20和esPH20。示例性测定包括如下所述的微浊度测定(参见例如实施例12)，其通过检测未切割的透明质酸与血清白蛋白结合时形成的不溶性沉淀物来间接测量透明质酸酶对透明质酸的切割。例如，可以使用参考标准以产生标准曲线来确定测试的透明质酸酶的活性单位。如本文所用，在中性条件下是有活性的(neutral active)指PH20多肽在中性pH下酶促催化透明质酸的切割的能力。与非C端截短或N-部分糖基化的相应在中性条件下是有活性的PH20的透明质酸酶活性相比，本文提供的在中性条件下是有活性的C端截短或N-部分糖基化的 PH20 具有或具有约 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、300%、400%、500%、1000% 或更多的活性。如本文所用，GP1-锚附着信号序列是在ER腔内指导预形成的GP1-锚添加到多肽的C端氨基酸序列。GP1-锚附着信号序列存在于GP1-锚定的多肽的前体多肽中，如GP1-锚定的PH20多肽。C端GP1-锚附着信号序列通常含有8-20个氨基酸的主要疏水区域，其前面为紧接位点或GP1-锚附着位点下游的8-12个氨基酸的亲水间隔区域。GP1-锚附着信号序列可以利用本领域众所周知的方法来鉴定。这些方法包括但不限于计算机方法和算法(参见，例如 Udenfriend et al.(1995)Methods Enzymol.250:571-582, Eisenhaberet al., (1999) J.Biol.Chem.292:741-758,Kronegg and Buloz, (1999)，"Detection/prediction of GPI cleavage site(GP1-anchor)in a protein (DGPI)"，例如网站129.194.185.165/dgpi/, Fankhauser et al., (2005)Bioinformatics21:1846-1852,Omaetxebarria et al., (2007)Proteomics7:1951-1960,Pierleoni et al., (2008)BMC Bioinformatics9:392),包括在诸如ExPASy蛋白质组学工具站点(例如万维网站点expasy.ch/tools/)的生物信息网站上容易获得的方法和算法。如本文所用，双岩藻糖基化的多肽指具有两个岩藻糖残基的多肽，所述岩藻糖残基一个具有aI, 3-键而另一个具有a 1，6-键,连接至相同的核心N-乙酰葡糖胺部分,所述N-乙酰葡糖胺部分连接至多肽链中的天冬酰胺残基。双岩藻糖基化的多肽一般在昆虫细胞中产生。如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以为单链或双链。当提到探针或引物时，单链分子为预期的，所述探针或引物任选地被标记，例如用诸如荧光或放射性标记的可检测标记来标记。这样的分子通常具有使其靶标在统计学上独特的长度或者具有用于检测或吸出文库的低拷贝数(通常少于5，一般少于3)。一般探针或引物含有至少14、16或30个连续的核苷酸，其序列与所关注的基因互补或相同。探针和引物的长度可以为10、20、30、50、100或更多个核酸。如本文所用，肽指长度大于或等于2个氨基酸，并且长度少于或等于40个氨基酸的多肽。如本文所用，在各种本文提供的氨基酸序列中出现的氨基酸根据它们已知的三字母或单字母的缩写(表I)来鉴定。在各种核酸片段中出现的核苷酸用本领域常用的标准单字母名称来命名。如本文所用，“氨基酸”为含有氨基和羧酸的有机化合物。多肽含有两个或更多个氨基酸。为了本文的目的，氨 基酸包括20种天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即a-碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，“氨基酸残基”指通过多肽在其肽键处的化学消化(水解)而形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基推定为“L”异构形式。命名为“D”异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，只要多肽保留期望的功能特性。NH2指多肽的氨基端存在的游离氨基。C00H指多肽的羧基端存在的游离羧基。根据J.Biol.Chem.,243:3557-3559(1968)中所述的标准多肽命名，并且采用37C.F.R.§ § 1.821-1.822，氨基酸残基的缩写在表I中示出。表1-对应表
权利要求
1.一种延长的可溶性PH20透明质酸酶(esPH20)，其选自:多肽，其由 SEQ ID NO: 107 的氨基酸 36-491、36-492、36-493、36-495、36-496、36_497、36-498、36-499或36-500所示的氨基酸序列组成；或者多肽，其在 SEQ ID NO: 107 的氨基酸 36-491、36-492、36-493、36-495、36-496、36_497、36-498,36-499或36-500所示的氨基酸序列中含有氨基酸取代，由此所述氨基酸取代的多肽由与 SEQ ID NO: 107 的氨基酸 36-491、36-492、36-493、36-495、36-496、36-497、36_498、36-499或36-500所示的相应氨基酸序列具有至少85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列相同性的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的esPH20，其是N-糖基化的、N-部分糖基化的或去糖基化的。
3.如权利要求2所述的esPH20，其中所述N-部分糖基化的多肽包含至少一个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少3个天冬酰胺(N)残基的每一个。
4.如权利要求3所述的esPH20，其中所述3个天冬酰胺残基为SEQID NO: 107的氨基酸残基235、368和393或对应SEQ ID NO: 107的氨基酸残基235、368和393的残基。
5.如权利要求1-4中任一项所述的esPH20，其由SEQID NO: 107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-495、36-496、36-497、36-498、36-499 或 36-500 所示的氨基酸序列组成。
6.如权利要求1-5中任一项所述的esPH20，其被选自唾液酸化、白蛋白化、法尼基化、羧基化、羟基化和磷酸化的修饰作用修饰。
7.如权利要 求1-6中任一项所述的esPH20，其被聚合物修饰。
8.如权利要求7所述的esPH20，其中所述聚合物为葡聚糖或PEG。
9.如权利要求1-6中任一项所述的esPH20，其中所述多肽被修饰以在人中具有与未修饰的多肽相比降低的免疫原性。
10.如权利要求9所述的esPH20，其中一级序列被改变以消除促成抗原性的表位。
11.如权利要求1-6中任一项所述的esPH20，其中所述多肽通过在不双岩藻糖基化所述多肽的宿主细胞中表达来产生。
12.如权利要求1-11中任一项所述的esPH20，其是基本上纯化的或分离的。
13.一种截短的PH20透明质酸酶，其由SEQ ID NO: 107的氨基酸36_469、36_470、36-471、36-475、36-476、36-484、36-486、36-487、36-488 或 36-489 所示的氨基酸序列组成；或者在 SEQ ID NO: 107 的氨基酸 36-469、36-470、36-471、36-475、36-476、36-484、36_486、36-487,36-488或36-489所示的氨基酸序列中含有氨基酸取代，由此所述氨基酸取代的PH20 透明质酸酶由与 SEQ ID NO: 107 的氨基酸 36-469、36-470、36-471、36-475、36_476、36-484,36-486,36-487,36-488 或 36-489 所示的氨基酸序列具有至少 85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列相同性的氨基酸序列组成。
14.如权利要求13所述的PH20，其是N-糖基化的、N-部分糖基化的或去糖基化的。
15.如权利要求13所述的PH20，其被选自唾液酸化、白蛋白化、法尼基化、羧基化、羟基化和磷酸化的修饰作用修饰。
16.如权利要求13所述的PH20，其被聚合物修饰。
17.如权利要求16所述的PH20，其中所述聚合物为葡聚糖或PEG。
18.如权利要求13所述的PH20，其中所述多肽通过在不双岩藻糖基化所述多肽的宿主细胞中表达来产生。
19.如权利要求13-18中任一项所述的PH20，其是基本上纯化的或分离的。
20.一种缀合物，其包含权利要求1-19中任一项所述的esPH20或PH20。
21.如权利要求20所述的缀合物，其中所述esPH20或PH20缀合至选自多聚化结构域、毒素、可检测标记或药物的部分。
22.如权利要求21所述的缀合物，其中所述esPH20或PH20缀合至Fe结构域。
23.如权利要求20所述的缀合物，其中所述esPH20或PH20缀合至聚合物。
24.如权利要求23所述的缀合物，其中所述聚合物为葡聚糖或PEG。
25.如权利要求20-24中任一项所述的缀合物，其中所述缀合的部分直接或通过接头连接至所述esPH20或PH20的C端或N端。
26.—种编码权利要求1-19中任一项所述的esPH20或PH20的核酸分子，其中所述核酸分子不编码全长PH20，但编码截短的PH20或编码esPH20。
27.—种表达载体,其包含由核苷酸序列组成的多核苷酸,所述核苷酸序列编码权利要求1-19中任一项所述的PH20或esPH20，并且每个核苷酸序列包含终止密码子或者终止密码子紧接在其后，可操作地插入所述载体以用于权利要求1_5、9、10、13和14中任一项所述的PH20或esPH20的表达。
28.—种载体,其包含权利要求26所述的核酸。
29.—种细胞，其包 含权利要求28所述的载体。
30.如权利要求29所述的细胞，其为CHO细胞。
31.一种细胞，其包含权利要求26所述的核酸分子。
32.如权利要求31所述的细胞，其为CHO细胞。
33.一种组合物，其包含权利要求1-19中任一项所述的esPH20或PH20多肽。
34.一种组合物，其包含多种权利要求1-19中任一项所述的esPH20或PH20多肽。
35.如权利要求33所述的组合物，其中所述esPH20或PH20多肽从CHO细胞分泌。
36.如权利要求33所述的组合物，其为药物组合物。
37.如权利要求36所述的组合物，其包含额外的治疗剂。
38.如权利要求37所述的组合物，其中所述治疗剂与所述组合物一起配制或配制在单独的组合物中。
39.如权利要求37所述的组合物，其中所述治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀变形虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、和抗关节炎齐U、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断齐U、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀细菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断齐U、心血管药剂、避孕剂、减充血剂、利尿剂、抑制剂、诊断剂、电解质剂、催眠剂、激素剂、升血糖剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂、眼科剂、拟副交感神经剂、心力加强剂、镇静剂、拟交感神经剂、安定剂、泌尿剂、阴道剂、杀病毒剂、维生素剂、非类固醇抗炎剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多肽、蛋白、核酸、药物、有机分子或睡眠诱导剂。
40.如权利要求37所述的组合物，其中所述治疗剂选自抗体、免疫球蛋白、二膦酸盐、细胞因子、化疗剂和胰岛素。
41.如权利要求40所述的组合物，其中所述胰岛素为速效胰岛素，并且所述二膦酸盐为唑来膦酸。
42.权利要求1-19中任一项所述的esPH20或PH20或者权利要求33-41中任一项所述的组合物在制备用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况的药物中的用途。
43.一种药物组合物，其包含用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况的权利要求1-19中任一项所述的多肽。
44.如权利要求33-41中任一项所述的药物组合物，其用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况。
45.权利要求33-41中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖积累、治疗心血管病症、治疗眼病症、治疗肺疾病、增加化疗剂对实体瘤的渗透、治疗皮下脂肪团、治疗增殖性病症、或者增加药物和其他治疗剂的生物利用度。
46.如权利要求45所述的用途，其中所述增殖性病症为良性前列腺增生。
47.权利要求33-41中任一项所述的药物组合物，其用于治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖积累、治疗心血管病症、治疗眼病症、治疗肺疾病、增加化疗剂对实体瘤的渗透、治疗皮下脂肪团、治疗增殖性病症、或者增加药物和其他治疗剂的生物利用度。
48.如权利要求47所述的药物组合物，其中所述增殖性病症为良性前列腺增生。
49.PH20透明质酸酶在制备用于治疗良性前列腺增生的药物中的用途。
50.—种药物组合物，其包含用于治疗良性前列腺增生的PH20透明质酸酶。
全文摘要
本发明提供了包括延长的可溶性PH20多肽在内的可溶性PH20多肽及其用途。本发明还提供了其他C端截短的PH20多肽和部分去糖基化的PH20多肽以及它们的用途。
文档编号A61P17/00GK103205407SQ20131010616
公开日2013年7月17日 申请日期2009年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者G·卫, K·帕内尔塞尔万, G·I·弗罗斯特, L·布克班德 申请人:哈洛齐梅公司