抗鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物及制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组禽流感病毒株。该重组禽流感病毒株是通过遗传重组方法，将流感病毒株和禽流感病毒株进行重组构建而得，对鸡及鸡胚无致病力，比野毒株更安全，可有效避免因灭活不完全造成的散度危险。本发明还涉及一种含有该重组禽流感病毒株的抗鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感的疫苗组合物。该疫苗组合物不仅可预防鸡新城疫、传染性支气管炎，对我国目前流行的大多数H9N2亚型禽流感病毒较好的交叉免疫性。因此，该疫苗组合物比目前商品化疫苗在H9N2亚型禽流感方面具有广泛的交叉保护性。
【专利说明】抗鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物及制备
【技术领域】
[0001]本发明属于畜牧类生物制药【技术领域】，涉及一种重组禽流感病毒株，特别是涉及一种重组禽流感病毒株以及含有该毒株的抗鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物。
【背景技术】
[0002]禽流感(Al)是由正粘病毒科A型流感病毒引起禽类及其他鸟类的一种感染和/或疾病综合征，感染后的舍饲禽(包括家禽)可表现出临诊症状、呼吸系统疾病、产蛋量下降、致死率很高的急性出血性疾病，也可表现为亚临诊症状、轻的呼吸系统感染到无症状带毒等多种流行形式。其中H9N2亚型禽流感，我国自1994年首次报道从鸡群中分离到H9N2亚型禽流感病毒以来，该亚型禽流感病毒已在我国广泛分布和流行，并且在家禽中不断变化。目前H9N2亚型禽流感是持续危害我国及世界养禽业发展的重要禽类传染病之一。我国目前主要流行的H9N2禽流感病毒属于h9.4.2分支，h9.4.2分可分为六个亚分支，其中流行范围较广的为第I亚分支在华东、华北、西北和西南地区流行，其次为第IV亚分支在华中地区流行。
[0003]目前，对于家禽H9N2亚型禽流感感染的预防主要是使用H9N2亚型禽流感病毒制备的全病毒油乳剂灭活疫苗。我国有多种不同厂家研制和生产H9N2亚型禽流感灭活疫苗，在我国大范围应用。疫苗的广泛使用使H9亚型禽流感的流行得到了有效控制，但禽群感染仍时有发生，甚至出现在免疫鸡群，特别是近年来呈现逐渐增多的趋势。目前商品化的H9亚型禽流感灭活疫苗或H9亚型禽流感相关联苗，均为油乳剂灭活疫苗。由于禽流感存在高度变异，因此，目前商品化疫苗免疫后对H9亚型禽流感的保护效果较差。同时，目前的商品化疫苗所使用的H9亚型疫苗抗原大多为灭活的野毒，即全病毒抗原，存在因灭活不完全而造成散毒危险。
[0004]因此，目前存在的问题是需要提供一株新的疫苗株，并基于该疫苗株研制新型H9亚型禽流感疫苗或H9亚型禽流感相关联苗，免疫后对H9亚型禽流感的保护效果较好，且不存在因灭活不完全造成散毒危险，以用于预防H9亚型禽流感及H9亚型禽流感相关疾病。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种重组禽流感病毒(RAIV)株。该重组禽流感病毒株是通过遗传重组方法，将流感病毒株和禽流感病毒株进行重组构建而得，对鸡及鸡胚无致病力，比野毒株更安全，可有效避免因灭活不完全造成的散度危险。
[0006]本发明还提供了该重组禽流感病毒株在制备防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗中的应用。
[0007] 本发明还进一步提供了一种含有该重组禽流感病毒株的抗新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感的疫苗组合物，该组合物不仅可预防新城疫、传染性支气管炎，对我国目前流行的大多数H9N2亚型禽流感病毒较好的交叉免疫性。因此，比目前商品化疫苗在H9N2亚型禽流感方面具有广泛的交叉保护性。
[0008]为此，本发明提供了一种重组禽流感病毒株，其具有禽流感病毒(AIV)的2个表面基因以及流感病毒(IV)的6个内部基因。
[0009]本发明中，所述禽流感病毒的2个表面基因分别为HA基因和NA基因。所述流感病毒的6个内部基因分别为PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因。
[0010]根据本发明，所述禽流感病毒可以为禽流感(H9N2亚型)病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007 (H9N2)株、禽流感(H9N2 亚型)病毒 A/Chicken/Shanghai/F/98 (H9N2)株、禽流感(H9N2亚型)病毒A/Chicken/Hunan/S933/2008 (H9N2)株、禽流感病毒为禽流感病毒(H9亚型)SZ株。
[0011]在一个优选实施例中，所述禽流感病毒为禽流感病毒(H9亚型)SZ株(Avianinfluenza virus (H9subtype) strain SZ),其保藏编号为:CCTCC NO:V201240,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC);地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号,武汉大学；保藏日期:2012年9月16日。
[0012]本发明中所述用语“禽流感(H9N2亚型)病毒”亦称为H9N2亚型禽流感病毒。
[0013]本发明中所述用语“禽流感病毒(H9亚型)SZ株(Avian influenzavirus (H9subtype) strain SZ)”亦称为禽流感病毒H9亚型SZ株或H9亚型禽流感病毒SZ株。
[0014]同样,本发明中所述用语“重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株(Avian influenzavirus (H9 subtype) strain SZ)”亦称为重组禽流感病毒H9亚型SZ-1株或重组H9亚型禽流感病毒SZ-1株。
[0015]本发明中所述用语“禽流感毒(H9亚型)YZG4株”亦称为禽流感病毒(H9亚型)YZG4株(Avian influenza virus (H9 subtype) strain YZG4)或禽流感病毒 H9 亚型 YZG4 株或H9亚型禽流感病毒YZG4株，用于本发明中的攻毒保护试验。
[0016]禽流感毒(H9亚型)YZG4株(Avian influenza virus (H9 subtype) strain YZG4),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，其保藏编号为:CCTCC NO:V201227，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC);地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号，武汉大学；保藏日期:2012年6月14日。
[0017]根据本发明，所述流感病毒可以为流感病毒A/Harbin/LM/2009 (HlNl)株、流感病毒A/Taiwan/126/2009 (HlNl)株及流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株。优选所述流感病毒为流感病毒 A/PR/8/34 (HlNl)株。
[0018]本发明中，所述重组禽流感病毒株为重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株。所述重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株是通过遗传重组方法，将流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)和H9N2亚型禽流感流行株禽流感病毒(H9亚型)SZ株进行重组获得，并通过PCR和血清学方法对获得的重组病毒进行了鉴定。
[0019]具体地说，本发明中所述重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株是利用禽流感病毒(H9亚型)SZ株、流感病毒为流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株和人工自然重组技术构建的构建2:6
重组病毒株。
[0020]本发明中所述用语“构建2:6重组病毒株”是指采用人工自然重组技术将禽流感病毒的2个表面基因和流感病毒的6个内部基因进行重组构建的重组禽流感病毒株。具体地说，是指采用人工自然重组技术将禽流感病毒的2个表面基因，如HA基因和NA基因，以及流感病毒的6个内部基因，如PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因进行重组构建的重组禽流感病毒株。
[0021]本发明所提供的重组禽流感病毒株，具有与HA和NA基因供体毒株禽流感病毒(H9亚型)SZ株一致的抗原性，不仅能够完全抵御同源毒株的攻击，而且意外地发现对我国目前流行的H9N2禽流感病毒异源毒株的攻击也可产生较好的免疫保护，具有广泛的交叉保护性。本发明所提供的重组禽流感病毒株的6个内部基因来自供体株流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株，意外地发现具有比流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株更优异的鸡胚高滴度生长特性，而且出人意料地，还发现本发明人工重组的重组禽流感病毒株对鸡及鸡胚完全无致病力，比野毒株更安全，可有效避免因灭活不完全造成的散毒危险。简而言之，该重组禽流感病毒株对我国目前流行的H9N2禽流感病毒具有广泛的交叉免疫性、高滴度鸡胚适应性、对鸡及鸡胚无致病力。
[0022]本发明中所述用语“鸡新城疫(NewCastledisease, ND)”,是指由副粘病毒引起的高度接触性传染病，又称为新城疫(ND)。
[0023]本发明中所述用语“鸡新城疫病毒(NDV)”，亦称为新城疫病毒(NDV)，属于副粘病毒科，副粘病毒属，核酸为单链RNA。
[0024]同样，本发明中所述用语“鸡新城疫病毒(NDV)株”，亦称为新城疫病毒(NDV)株。
[0025]本发明中所述用语“鸡传染性支气管炎Infect1usbronchitis, IB”,是指由鸡传染性支气管炎病毒(IBV )引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病毒性疾病，又称为传染性支气管炎(IB)。
[0026]本发明中所述用语“鸡传染性支气管炎病毒(IBV)”，亦称为传染性支气管炎病毒(IBV),是一种冠状病毒，有多个血清型，而且新的毒株不断出现。
[0027]同样，本发明中所述用语“鸡传染性支气管炎病毒(IBV)株”，亦称为传染性支气管炎病毒(IBV)株。
[0028]本发明还提供了根据本发明所述的重组禽流感病毒株在制备防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗中的应用。
[0029]本发明还进一步提供了一种含有本发明所述的重组禽流感病毒株的抗新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物，其中，还包括鸡新城疫病毒(NDV)株和传染性支气管炎病毒(IBV)株。
[0030]根据本发明，所述新城疫病毒株为鸡新城疫病毒(NDV) LaSota株。所述传染性支气管炎病毒株为传染性支气管炎病毒(IBV) M41株。所述重组禽流感病毒株为重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株。
[0031]在本发明的一个实施例中，在所述疫苗组合物中，NDV LaSota株灭活浓缩液含量为10%~31.05% (体积)。优选在所述疫苗组合物中，NDV LaSota株灭活浓缩液含量为10%~20% (体积)。更为优选地，在所述疫苗组合物中，NDV LaSota株灭活浓缩液含量为10.35% (体积)。
[0032]在本发明的另一个实施例中，在所述疫苗组合物中，IBV M41株灭活浓缩液含量为10%~31.05%(体积)。优选在所述疫苗组合物中，IBV M41株灭活浓缩液含量为10%~20%(体积)。更为优选地，在所述疫苗组合物中，IBV M41株灭活浓缩液含量为10.35% (体积)。
[0033]在本发明又一实施例中，在所述疫苗组合物中，重组禽流感病毒(RAIV) (H9亚型)SZ-1株灭活浓缩液含量为10%~31.05% (体积)。优选在所述疫苗组合物中，重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株灭活浓缩液含量为10%~20% (体积)。更为优选地，在所述疫苗组合物中，重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株灭活浓缩液含量为10.35% (体积)。
[0034]本发明还进一步提供了一种根据本发明上文所述的疫苗组合物的制备方法，其包括:
[0035]步骤A:制备生产用毒种:分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株毒种稀释后，再分别接种于SPF鸡胚，孵育，分别收获NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的生产用毒种；
[0036]步骤B:制备制苗用病毒液:分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株生产用毒种稀释后，再分别接种易感鸡胚，孵育，收获制苗用病毒液；
[0037]步骤C:制苗用病毒液的浓缩、灭活:分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株制苗用病毒液进行浓缩、灭活，分别获得NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的灭活浓缩液；
[0038]步骤D:制备疫苗组合物:将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的灭活浓缩液与吐温-80混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相进行混合乳化，制成疫苗组合物。
[0039]根据本发明方法，在步骤C中，所述浓缩、灭活是将NDV LaSota株、IBV M41株与重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的制苗用病毒液分别进行浓缩后，再用终浓度为0.05%~0.30% (体积)甲醛溶液，在35~37°C条件下，灭活12~20小时。上述灭活过程优选在浓缩后，采用0.20% (体积)甲醛溶液，在37°C条件下，灭活16小时。
[0040]本发明中所用术语“灭活浓缩液”，是指已灭活的浓缩病毒液或浓缩抗原。
[0041]在本发明的一个实施例中，在步骤A之前还包括构建重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的步骤。
[0042]本发明所提供的抗鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)疫苗组合物优选为一种三联灭活疫苗，可预防对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、H9亚型禽流感，尤其对我国目前流行的H9N2禽流感病毒具有广泛的交叉免疫性。
[0043]本发明所提供的重组禽流感病毒株HA效价与野毒相比，可提高2倍左右，以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。本发明所提供的重组禽流感病毒株，对鸡及鸡胚无致病力，比野毒株更安全，可有效避免因灭活不完全造成的散毒危险。
[0044]进一步来说，利用本发明的人工重组的重组禽流感病毒株作为疫苗株构建的抗鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)疫苗组合物，不仅可预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎，对我国目前流行的H9N2亚型禽流感病毒较好的交叉免疫性。因此，比目前商品化疫苗在H9N2亚型禽流感方面具有广泛的交叉保护性。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1是实施例2中重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的RT-PCR扩增；
[0046]图1中附图标记的含义如下:1~8泳道:重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株利用PR8的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物；M:DNA Marker2000 ; 10~17泳道:重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株利用禽流感病毒(H9亚型)SZ株的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物。
[0047]图2是实施例3中重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株和野生型禽流感病毒(H9亚型)SZ株在最佳培养温度37°C测定的生长曲线。
[0048]mmm
[0049]禽流感病毒(H9亚型)SZ 株(Avian influenza virus (H9 subtype) strain SZ),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC ；地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2012年9月16日，保藏编号:CCTCC NO:V201240o
[0050]禽流感毒(H9亚型)YZG4株(Avian influenza virus (H9 subtype) strain YZG4),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC ；地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2012年6月14日，保藏编号:CCTCC NO:V201227o
【具体实施方式】
[0051]本发明是以下技术方案来实现的，首先是通过遗传重组方法，将流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株和禽流感病毒(H9亚型)SZ株进行重组，构建重组禽流感病毒株，并通过PCR和血清学方法对获得的重组病毒进行鉴定，获得重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株。
[0052]然后，应用所获得的重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株来制备防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗。
[0053]在一个具体的技术方案中，将重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株与NDV LaSota株、IBV M41株三病毒株作为抗原制备抗鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感疫苗组合物，其包括以下具体实施步骤:
[0054]步骤B:制备生产用毒种:分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株毒种稀释后，再分别接种于SPF鸡胚，孵育，分别收获NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的生产用毒种；
[0055]步骤C:制备制苗用病毒液:分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株生产用毒种稀释后，再分别接种易感鸡胚，孵育，收获制苗用病毒液；
[0056]步骤D:制苗用病毒液的浓缩、灭活:分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株制苗用病毒液浓缩3倍，然后用终浓度为0.05%~0.30%(体积)甲醛溶液，35~37°C，灭活12~20小时，分别获得NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的灭活浓缩液；
[0057]步骤E:制备疫苗组合物:将NDV LaSota株灭活浓缩液10%~31.05% (体积)、IBVM41株灭活浓缩液10%~31.05% (体积)和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的灭活浓缩液10%~31.05% (体积)与吐温_80，4% (体积)混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相按照1:2的比例进行混合乳化，制成疫苗组合物。
[0058]在一个优选实施方式中，在步骤E中，将NDV LaSota株灭活浓缩液10% (体积)、IBV M41株灭活浓缩液10% (体积)和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的灭活浓缩液10%(体积)与吐温_80，4% (体积)混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相按照1:2的比例进行混合乳化，制成疫苗组合物。
[0059]在另一个优选实施方式中，在步骤E中，将NDV LaSota株灭活浓缩液20% (体积)、IBV M41株灭活浓缩液20% (体积)和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的灭活浓缩液20%(体积)与吐温_80，4% (体积)混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相按照1:2的比例进行混合乳化，制成疫苗组合物。
[0060]在又一优选实施方式中，在步骤E中，将NDV LaSota株灭活浓缩液10.35%(体积)、IBV M41株灭活浓缩液10.35% (体积)和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的灭活浓缩液10.35% (体积)与吐温-80，4% (体积)混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相按照1:2的比例进行混合乳化，制成疫苗组合物。
[0061]为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0062]实施例
[0063]实施例1:禽流感病毒(H9亚型)SZ株的分离与鉴定与免疫原性分析
[0064]1.样品
[0065]由普莱柯生物工程股份有限公司进行分离和鉴定。
[0066]2.病毒分离
[0067]将从山东采集的鸡拭子样品，3000rpm离心5分钟后，按0.2ml/胚的剂量，无菌操作以尿囊腔途径接种10日龄SPF(无特定病原体,Specefic pathogen Free, SPF)鸡胚。置37°C继续孵育。每日照蛋，弃去24小时内死亡的鸡胚，检测孵育48~72小时死亡及72小时存活的所有鸡胚。
[0068]3.病毒鉴定
[0069](I)红细胞凝集实验
[0070]按照常规方法测定收获的鸡胚液的HA效价，HA效价为1:256。
[0071](2)病毒亚型鉴定
[0072]将该毒株分别与禽流感H1-H16的16种血凝素(H)分型血清进行HI试验，与N1-N9的9种神经氨酸酶(N)分型血清进行NI试验，进行病毒的H和N亚型的鉴定。鉴定结果见表1，该毒株为H9N2亚型禽流感病毒。
[0073]表1毒株亚型鉴定结果
【权利要求】
1.一种重组禽流感病毒株，其含有禽流感病毒的2个表面基因以及流感病毒的6个内部基因。
2.根据权利要求1所述的重组禽流感病毒株，其特征在于: 所述禽流感病毒的2个表面基因分别为HA基因和NA基因； 所述流感病毒的6个内部基因分别为PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因。
3.根据权利要求1或2所述的重组禽流感病毒株，其特征在于:所述禽流感病毒为禽流感病毒(H9亚型)SZ株，其保藏编号为:CCTCC NO:V201240 ； 所述流感病毒为流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株； 所述重组禽流感病毒株为重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株。
4.根据权利要求1到3中任意一项所述的重组禽流感病毒株在制备防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗中的应用。
5.一种含有权利要求1到3中任意一项所述的重组禽流感病毒株的抗鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物，其特征在于，还包括鸡新城疫病毒株和传染性支气管炎病毒株。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于: 所述鸡新城疫病毒株为鸡新城疫病毒LaSota株； 所述传染性支气管炎病毒株为传染性支气管炎病毒M41株； 所述重组禽流感病毒株为重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株。
7.根据权利要求5或6所述疫苗组合物，其特征在于:在所述疫苗组合物中，鸡新城疫病毒LaSota株灭活浓缩液的含量为10%~31.05% (体积)；传染性支气管炎病毒M41株灭活浓缩液的含量为10%~31.05% (体积);重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株灭活浓缩液的含量为10%~31.05% (体积)。
8.根据权利要求7所述疫苗组合物，其特征在于:在所述疫苗组合物中，鸡新城疫病毒LaSota株灭活浓缩液的含量为10%~20% (体积);传染性支气管炎病毒M41株灭活浓缩液的含量为10%~20% (体积);重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株灭活浓缩液的含量为10%~20% (体积)。
9.根据权利要求8所述疫苗组合物，其特征在于:在所述疫苗组合物中，鸡新城疫病毒LaSota株灭活浓缩液的含量为10.35% (体积)；传染性支气管炎病毒M41株灭活浓缩液的含量为10.35% (体积);重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株灭活浓缩液的含量为10.35% (体积)。
10.根据权利要求5到9中任意一项所述的疫苗组合物的制备方法，其包括: 步骤A:制备生产用毒种:分别将鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株毒种稀释后，再分别接种于SPF鸡胚，孵育，分别收获鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的生产用毒种； 步骤B:制备制苗用病毒液:分别将鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株生产用毒种稀释后，再分别接种易感鸡胚，孵育，收获制苗用病毒液；步骤C:制苗用病毒液的浓缩、灭活:分别将鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株制苗用病毒液进行浓缩、灭活，分别获得鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的灭活浓缩液； 步骤D:制备疫苗组合物:将鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒(H9亚型)SZ-1株的灭活浓缩液与吐温-80混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂 酸铝制成的油相进行混合乳化，制成疫苗组合物。
【文档编号】A61P31/14GK104164408SQ201310181203
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2013年5月15日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司