抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用，所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1：5～10：1的摩尔比组成，所述短肽抑制剂选自β-淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物；所述佐剂选自含氮杂环化合物及其衍生物，所述复合物通过将短肽抑制剂与佐剂按1：5～10：1的摩尔比，溶解到缓冲液中制备混合溶液，使短肽抑制剂的终浓度为10-100μM，再孵育制得；所述复合物用于制备抑制淀粉样多肽对细胞毒害作用的药物或用于制备治疗和/或预防与淀粉样多肽有关的疾病的药物。本发明在分子水平上揭示分子与淀粉样多肽的相互作用，为研究药物分子与淀粉样多肽相互作用机理，提供了有效方法。
【专利说明】抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用
[0001]本申请要求2012年7月16号提交的名称为“抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用”，申请号为201210246344.1的发明专利申请的优先权。
【技术领域】
[0002]本发明属于生物医学【技术领域】。本发明一般地涉及一种复合物，尤其涉及一种抑制淀粉样多肽聚集的复合物。本发明还涉及所述抑制淀粉样多肽聚集的复合物的制备方法和应用。通过本发明的抑制淀粉样多肽聚集的复合物，可以大大提高对淀粉样多肽的聚集和毒性的抑制效果。
【背景技术】
[0003]淀粉样多肽的错误折叠和异常组装行为与人类很多退行性疾病的发病机制密切相关，如阿尔茨海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿氏症(HD)、前额颞退行病变(FTLD)、脊索侧索硬化症(ALS)、II型糖尿病、牛海绵状脑病(BSE)、克罗伊茨费尔特-雅各布氏病(CJD)等以及某些癌症等。作为全球人口第一大国和老龄化社会的现状，退行性疾病造成严重的社会和家庭负担，成为我国必须面对的重大社会问题。以AD为例，它最重要的病理学特征之一为神经细胞外淀粉样物质沉积形成斑块,其主要组成成分β淀粉样蛋白(amyloid protein, A β ),是由跨膜的淀粉样前体蛋白(APP)经β和Y分泌酶水解产生的含有39-42个氨基酸残基的多肽。研究结果表明，淀粉样多肽通过聚集形成的寡聚体、原纤维、纤维都对神经细胞有毒害。通过进一步的研究，人们了解到位于Αβ 42中11-25 这段疏水区域是Αβ聚集的核心片段，尤其Αβ 16-20:KLVFF五肽片段尤为关键，不仅关系到Αβ的纤维化，而且可以识别Αβ相应区域，与Αβ发生特异性相互作用。(可参考Klein, ff.L.等人，Neurochemistry International2002, 41, 345; Lambert, Μ.P.; Klein, ff.L.等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof Americal998, 95, 6448.; Selkoe, D.J., Nature2003, 426, 900.；Tjernberg, L.0.等人，Journal of Biological Chemistryl996, 271(15), 8545-8548.)
[0004]由此可知，如果以KLVFF等五肽序列为核心片段，设计一系列短肽类抑制剂，会有效的干扰Αβ -Αβ之间的相互作用，从而影响其聚集过程和神经毒性。目前的研究主要是利用有机合成的方法合成多肽抑制剂:(I)改变多肽序列，如在KLVFF的末端连接某些寡聚氨基酸成为KLVFF —寡聚氨基酸嵌段分子，可以增大KLVFF抑制A β聚集的能力，更有效地降低Αβ的神经毒性；(2)形成多聚体衍生物，如通过合成的方法连接成为树枝状多聚体，也可以有效与Αβ结合，抑制原纤维向纤维转化，并且促进聚集体的解聚；(3)末端增加有机配体，如在多肽的末端或者其他位置连接有效的有机小分子官能团，来增加多肽片段与A β的作用强度和对Aβ聚集以及神经毒性的抑制效果，也是效果显著的分子设计手段。(可参考 Chafekar, S.Μ.等人，ChemBiochem2007, 8 (15)，1857-1864.；Findeis,M.A.等人，Biochemistryl999, 38 (21)，6791-6800.；Gibson, T.J.等人，Biochemistry2005, 44 (24)，8898-89
07.)由于涉及认知评价的模式动物评价过程复杂，对于淀粉样多肽的聚集和毒性抑制多采用细胞筛选的方法[可参考 T.L.Lowe，等人，〃Structure-function relationships forinhibitors of beta-amyloid toxicity containing the recognition sequence KLVFFj"Biochemistry，40 (2001)，7882-89 ;Μ.M.Pallitto，等人"Recognition sequence designfor peptidyl modulators of beta-amyloid aggregation and toxicity, "Biochemistry, 38(1999)，3570-78.；T.Takahashi and H.Miharaj"Peptide and Protein MimeticsInhibiting Amyloid beta-Peptide Aggregation, "Acc.Chem.Res.，41 (2008)，1309-18.]。
[0005]上述报道的几种抑制淀粉样多肽毒性的方法，均从合成短肽类抑制剂的角度来实现对淀粉样多肽的聚集调控和神经毒性抑制的效果，目前尚未有利用非共价键作用制备短肽类抑制剂的方法。
【发明内容】
[0006]有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。
[0007]除非另外说明，本文中的“抑制剂”指的是可以抑制淀粉样多肽的聚集和/或毒性的短肽。
[0008]除非另外说明，本文中的“短肽”指的是可以抑制淀粉样多肽的聚集和/或毒性的多肽片段。
[0009]除非另外说明，本文中的“佐剂”或“佐剂分子”指的是可以和抑制剂或者短肽相互作用，调节淀粉样多肽聚集行为和毒性的吡啶类和多酚类化合物。
[0010]除非另外说明，本文中的“抑制剂-佐剂复合物”指的是由短肽与吡啶类和多酚类化合物通过非共价相互作用形成的组装单元或者复合物，它可以抑制淀粉样多肽聚集和
/或毒性。
[0011]除非另外说明，本文中的“淀粉样多肽”指的是淀粉样多肽以及淀粉样多肽的片段。
[0012]除非另外说明，在本文中，“ μ Μ”是指“ μ mol/L”，“mM”是指“mmol/L”。
[0013]除非另外说明，本文中的“复合物”是指由两种或两种以上的不同物质所形成的结合体。例如，所述不同物质可通过相互结合，相互缔合或相互络合而形成结合体，如缀合物或络合物等。
[0014]除非另外说明，本文中的“(:1-1^”是指“4’-氯-2，2’:6’，2”_三吡啶”，“EGCG”是指“(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯”。
[0015]针对现有技术的不足，本发明期望提供一种抑制淀粉样多肽毒性的新思路和新方法。因此，本文的一个目的是利用佐剂跟抑制剂形成的复合物及其在制备用于抑制淀粉样多肽对细胞毒害作用的药物中的用途。本文的另一个目的是提供该复合物在制备用于抑制淀粉样多肽对细胞毒害作用的抑制剂中的用途。本发明的又一个目的是提供该复合物在制备治疗和/或预防与淀粉样变有关的疾病药物中的用途。
[0016]针对上述目的，本发明的技术方案如下: [0017]一方面，本发明提供一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比组成，优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成，进一步优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~1:1的摩尔比组成，更优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:1的摩尔比组成；
[0018]所述短肽抑制剂选自β -淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物，优选地，该短肽抑制剂的序列含有下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF ;
[0019]所述佐剂选自吡啶类和多酚类化合物。
[0020] 优选地，所述短肽抑制剂为Aβ 16-20和/或Αβ 17-21，所述Aβ 16-20的序列为下述SEQ ID Ν0:1所示的氨基酸序列:KLVFF，所述Αβ 17-21的序列为下述SEQ ID Ν0:2所示的氨基酸序列:LVFFA。
[0021]更优选地，所述短肽抑制剂为A β 16-20。
[0022]优选地，所述吡啶化合物选自4，4’ -联吡啶、1,2-二(4-吡啶基)乙烯、三联吡啶和4’ -氯-2，2’:6’，2”-三吡啶中的一种或多种，更优选地，所述吡啶化合物为4’ -氯-2，2’:6’，2”-三吡啶，即 Cl-Ter。
[0023]优选地，所述多酚类化合物及其衍生物可选自(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇、花青素、姜黄素和紫杉叶素中的一种或多种。更优选地，所述多酚类化合物及其衍生物可为(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯，即EGCG。
[0024]另一方面，本发明提供一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物的制备方法，所述方法包括将短肽抑制剂与佐剂按1:5~10:1的摩尔比，溶解到缓冲液中制备混合溶液，使短肽抑制剂的终浓度为10-100 μ Μ，再将混合溶液于室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物，优选地，所述短肽抑制剂的浓度为50 μ M溶液，即得。
[0025]优选地，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~5:1，更优选地，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~1:1，再优选地，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:1。
[0026]优选地,所述缓冲液为ρΗ6.8-7.5的磷酸盐缓冲液，更优选地，所述缓冲液为ΡΗ7.4的磷酸盐缓冲液。
[0027]优选地，所述混合溶液于室温孵育0.5-3小时，优选I小时。
[0028]再一方面，本发明提供一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物在制备用于抑制淀粉样多肽聚集或对细胞毒害作用的药物中的应用。
[0029]又一方面，本发明提供一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物在制备用于治疗和/或预防与淀粉样多肽有关的疾病的药物中的应用。
[0030]优选地，所述淀粉样多肽为阿尔茨海默氏病相关的β -淀粉样多肽(Αβ )、2型糖尿病相关的胰淀素(Amylin)、亨廷顿氏病相关的多聚谷氨酰胺(PolyQ)、帕金森氏病相关的核突触蛋白(-Synuclein)、牛海绵状脑病和克罗伊茨费尔特-雅各布氏病相关的朊病毒(Prion)0
[0031]优选地，所述淀粉样多肽为淀粉样多肽Αβ，更优选地，所述淀粉样多肽Αβ选自β-淀粉样多肽Aβ 1-42 (Αβ 42)、β-淀粉样多肽Aβ 1-40 (Αβ 1-40)、β -淀粉样多肽 A β 1-28 (Α β 28)、β -淀粉样多肽 A β 33-42 (A β 33-42)、β -淀粉样多肽 A β 10-20(Αβ 10-20)及其片段中的一种或多种，所述β-淀粉样多肽Αβ 1-42的序列为SEQ ID NO:3(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)所示的氨基酸序列，所述 β -淀粉样多肽 Αβ 1-40 的序列为 SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)，所述β -淀粉样多肽A β 1-28的序列为SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK)，所述 β -淀粉样多肽 A β 33-42 的序列为 SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列(GLMVGGVVIA)，所述β -淀粉样多肽A β 10-20的序列为SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列(YEVHHQKLVFF);最优选地，所述淀粉样多肽为β _淀粉样多肽A β 1-42(Αβ 1-42)。
[0032]再一方面，本发明提供一种抑制淀粉样多肽的聚集或神经毒性的方法，包括以下步骤:
[0033]步骤Α:制备淀粉样多肽溶液，淀粉样多肽与短肽抑制剂的混合溶液、淀粉样多肽与佐剂的混合溶液，及淀粉样多肽与本发明所述的复合物的混合溶液，再将其于室温孵育；
[0034]步骤B:将孵育后的步骤A的溶液，利用原子力显微技术分别观察短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响。[0035]步骤C:将孵育后的步骤A的溶液，利用荧光光谱技术(或连续光谱多功能酶标仪)分别测试短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果。
[0036]步骤D:将孵育后的步骤A的溶液，利用细胞毒性测试实验分别检测短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果。
[0037]优选地，所述步骤A具体包括以下步骤:
[0038]步骤A.1:将淀粉样多肽溶解于缓冲液中，制成淀粉样多肽溶液，优选地，将淀粉样多肽溶解到PH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，进一步优选地，将淀粉样多肽溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中；
[0039]步骤A.2:将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂，溶解于缓冲液中，制得短肽抑制剂和淀粉样多肽混合溶液及佐剂和淀粉样多肽混合溶液，优选地，将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂或佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，于37°C孵育1_3天，进一步优选地，，更优选地，将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，于37°C孵育2天；
[0040]步骤A.3:将短肽抑制剂和佐剂，溶解于缓冲液中，制得混合溶液，使短肽抑制剂的浓度为10-125 μ M，优选10-100 μ Μ，再于室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂 -佐剂复合物溶液，优选地，使短肽抑制剂的浓度为50 μ M或125 μ Μ，更优选地，将淀粉样多肽溶解于ΡΗ=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，于室温孵育0.5-3小时，进一步优选地，将短肽抑制剂和佐剂溶解于ρΗ=7.4的磷酸缓冲液中，于室温孵育I小时；
[0041]步骤Α.4:将步骤Α.3得到的抑制剂-佐剂复合物溶液与步骤Α.1制得的淀粉样多肽溶液混合，然后将所得混合物溶解到缓冲液中，使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂部分与淀粉样多肽的浓度均为10-125 μ Μ，优选10-100 μ M的溶液，得到复合物与淀粉样多肽的混合溶液，再将其孵育，优选地，使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂部分与淀粉样多肽的浓度均为50 μ M溶液，或者使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂的浓度为125 μ Μ、淀粉样多肽的浓度为62.5 μ Μ,更优选地，所述缓冲液为ρΗ=6.8-7.5的磷酸缓冲液，还优选地，所述混合溶液于37°C共同孵育1-3天，进一步优选地，所述混合溶液于37°C共同孵育2天。
[0042]优选地，在步骤A.1中，当利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响时，所述淀粉样多肽溶液的浓度为10-100 μ Μ,更优选地，所述淀粉样多肽溶液的浓度为50 μ M ;或
[0043]当利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，所述淀粉样多肽溶液的浓度为1-5 μ Μ，更优选地，所述淀粉样多肽溶液的浓度为2.5μ M ;或利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果，所述淀粉样多肽溶液的浓度为10-125 μ Μ，更优选地，所述淀粉样多肽溶液的浓度为62.5 μ Μ。
[0044]当利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果时，所述淀粉样多肽溶液的浓度为50-500 μ Μ,优选地，所述淀粉样多肽溶液的浓度为300 μ M0
[0045]优选地，在步骤A.2中，当利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响时，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中；或
[0046]当利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂和所述抑制剂-佐剂复合物按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中，优选地，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂和所述抑制剂-佐剂复合物按2.5 μ M: 2.5 μ M的摩尔比溶解于缓冲液中，即将所述淀粉样多肽(2.5 μ Μ)分别与短肽抑制剂(2.5 μ Μ)、佐剂(2.5 μ Μ)和所述抑制剂-佐剂复合物(2.5 μ Μ)混合溶解于缓冲液中；当利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按1:2的摩尔比溶解于缓冲液中，优选地，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按62.5 μ Μ: 125 μ M的摩尔比溶解于缓冲液中；即当利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂和所述抑制剂-佐剂复合物按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中，优选地，所述淀粉样多肽(62.5 μ Μ)分别与短肽抑制剂(125 μ Μ)、佐剂(125 μ Μ)和所述抑制剂-佐剂复合物(125 μ Μ)混合溶解于缓冲液中。
[0047]当利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果时，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按5:1~I:1的摩尔比溶解于缓冲液中，优选地，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按300 μ Μ: 30 μ Μ、300 μ Μ:60 μ Μ、300 μ Μ: 150 μ Μ、300 μ Μ: 300 μ M 的摩尔比溶解于缓冲液中。所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按10 μ Μ: 20 μ M的摩尔比溶解于缓冲液中。
[0048]优选地，在步骤Α.3中，将短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比，溶解到缓冲液中，制得混合溶液，室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物溶液，优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成，最优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:1的摩尔比组成。
[0049]优选地，在步骤B中，还包括将步骤A.1、Α.2、Α.3、Α.4得到的混合溶液分别滴加到云母、硅片等平整基底上，然后空气干燥后，在固/气界面获得各自的原子力显微镜图像的步骤。
[0050]优选地，在步骤C中，利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，还包括制备荧光染料分子溶液，再将步骤Α.1、A.2、A.3、A.4得到的中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后放入标准的石英池中，在荧光光谱仪中进行测试的步骤。利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，也包括制备荧光染料分子溶液，并将步骤A.UA.2、A.3、A.4中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后接种到酶标板中，在连续光谱多功能酶标仪中进行荧光强度测试的步骤。[0051]优选地，在步骤C中，还包括将步骤A.UA.2、A.3、A.4得到的混合溶液分别取5 μ L加入培养好的神经肿瘤细胞中，孵育后，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率，通过存活率判断淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度的步骤。
[0052]优选地，所述淀粉样多肽溶液的最终浓度为5-20 μ Μ,在淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液中及淀粉样多肽和佐剂的混合溶液中，所述短肽抑制剂和佐剂的最终浓度均为I μ Μ, 2 μ Μ, 5 μ Μ, 10 μ Μ, 20 μ M ;在淀粉样多肽和抑制剂_佐剂复合物的混合溶液中，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为 I μ Μ:1 μ Μ，2 μ Μ: 2 μ Μ，5 μ Μ: 5 μ Μ，10 μ Μ: 10 μ Μ，I μ Μ: 10 μΜ, I μ Μ: 10 μ Μ, 10 μ Μ: 5 μ Μ, 20 μ Μ: 20 μ Mo
[0053]更优选地，所述淀粉样多肽溶液的最终浓度为10 μ Μ，进一步优选地，孵育1-3天，还优选地，孵育2天。
[0054]以下是本发明的详细描述:
[0055]为了获得本发明的技术方法，本发明进行了以下几个方面的探索和研究:
[0056]I)将短肽抑制剂进行组装，获得短肽组装体的扫描隧道显微镜图像；
[0057]所述组装体的制备方法包括如下步骤:
[0058]al.将所述短肽抑制剂制成溶液；
[0059]bl.将步骤al得到的溶液滴加到导电性基底，例如石墨，金、银、铜、钼等金属基底以及硅等半导体基底表面，以形成组装体。
[0060]除去溶剂后，在固/气界面获得短肽抑制剂组装体的扫描隧道显微镜图像。
[0061]2)将短肽抑制剂和佐剂进行共组装，以获得抑制剂-佐剂复合物的扫描隧道显微镜图像；
[0062]所述抑制剂-佐剂复合物的制备方法包括如下步骤:
[0063]a2.将所述短肽抑制剂与佐剂充分混合，形成混合液；
[0064]b2.将步骤a2得到的混合液滴加到导电性基底，例如石墨，金、银、铜、钼等金属基底以及硅等半导体基底表面，以形成抑制剂-佐剂复合物。
[0065]除去溶剂后，在固/气界面获得抑制剂-佐剂复合物的扫描隧道显微镜图像。
[0066]在制备短肽抑制剂组装体、抑制剂-佐剂复合物中，采用超声来充分混合；所述导电性基底为石墨，优选为新解理的闻定向热解石墨。闻定向热解石墨具有原子级平整的表面，而且在很多环境中都很稳定，适于扫描隧道显微镜表征。
[0067]此外，在制备短肽抑制剂组装体和抑制剂-佐剂复合物中，还包括除去基底表面残留液的步骤，可以采用吹惰性气体(例如氮气)的方式来除去所述基底表面的残留液。
[0068]3)将淀粉样多肽溶解到磷酸缓冲液中，与抑制剂-佐剂复合物在37°C共同孵育2天，利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集形貌的影响。
[0069]短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集形貌的影响的表征包括如下步骤:
[0070]a3.将淀粉样多肽溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中，制成50 μ M溶液；
[0071]b3.将短肽抑制剂与淀粉样多肽按摩尔比为1:1的比例，溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中制备混合溶液，各自的浓度为50 μ M溶液，在37°C共同孵育2天；
[0072]c3.将佐剂与淀粉样多肽按摩尔比为1:1的比例，溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中制备混合溶液，各自的浓度为50 μ M溶液，在37°C共同孵育2天；
[0073]d3.将短肽抑制剂与佐剂按不同的摩尔比，溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中制备混合溶液，室温孵育I小时以形成抑制剂-佐剂复合物，保持短肽抑制剂的浓度为50μΜ溶液；
[0074]e3.将步骤d3得到的抑制剂-佐剂复合物溶液与淀粉样多肽溶液混合，溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中，其中短肽抑制剂和淀粉样多肽的浓度均为50 μ M溶液，混合溶液在37°C共同孵育2天；
[0075]f3.将步骤a3、b3、c3和e3得到的混合溶液分别滴加到云母、硅片等平整基底上，然后空气干燥后，在固/气界面获得各自的原子力显微镜图像。
[0076]在制备短肽抑制剂组装体、抑制剂-佐剂复合物中，采用超声来充分混合；所述平整基底为云母、硅片、石墨等，优选为新解理的云母。云母具有原子级平整的表面，而且在很多环境中都很稳定，并且表面亲水性好，适于生物样品的原子力显微镜表征。
[0077]4)利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物在磷酸缓冲液中对淀粉样多肽聚集行为的调 控效果。
[0078]所述荧光光谱所需样品的制备方法包括如下步骤:
[0079]a4.将淀粉样多肽制成2.5 μ M溶液；
[0080]b4.将淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液制成2.5 μ M: 2.5 μ M溶液；
[0081]c4.将淀粉样多肽和佐剂的混合溶液制成2.5 μ M: 2.5 μ M溶液；
[0082]d4.将短肽抑制剂与佐剂按不同的摩尔比，溶解到磷酸缓冲液中制备混合溶液，室温孵育I小时以形成抑制剂-佐剂复合物，保持短肽抑制剂的浓度为50 μ M溶液；
[0083]e4.制备淀粉样多肽和抑制剂-佐剂复合物的混合溶液，短肽抑制剂和淀粉样多肽的最终浓度均为2.5 μ M溶液；
[0084]f4.将荧光染料分子制成ImM溶液；
[0085]g4.将步骤a4、b4、c4、e4中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后放入标准的石英池中，在荧光光谱仪中进行测试。测试选取特定激发波长和发射波长，通过测试发射波长处其荧光强度反映溶液中淀粉样多肽的聚集程度，从而验证多肽抑制剂、佐齐?、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集的调控。
[0086]所述荧光光谱仪为PerkinElmer LS55 ;所述石英池光路长度为Icm ;所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长分别为450nm和482 nm ;使用时间驱动模式，光谱的带宽设置为lnm，狭缝宽度为2.5nm。荧光的强度值为15s的时间内所测得的荧光强度的平均值。
[0087]所述连续光谱多功能酶标仪测试ThT荧光强度所需样品的制备方法包括如下步骤:
[0088]a4.将淀粉样多肽制成62.5 μ M溶液；[0089]b4.将淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液制成125 μ Μ: 125 μ M溶液；
[0090]c4.将淀粉样多肽和佐剂的混合溶液制成62.5μΜ:125μΜ溶液；
[0091]d4.将短肽抑制剂与佐剂按不同的摩尔比，溶解到磷酸缓冲液中制备混合溶液，室温孵育I小时以形成抑制剂-佐剂复合物，保持短肽抑制剂的浓度为125 μ M溶液；
[0092]e4.制备淀粉样多肽和抑制剂-佐剂复合物的混合溶液，短肽抑制剂和淀粉样多肽的最终浓度均为125 μ M溶液；
[0093]f4.将ThT荧光染料分子制成ImM溶液；
[0094] g4.将步骤a4、b4、c4、e4中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合使得ThT荧光染料分子的终浓度为20 μ Μ，之后将混合液接种到酶标板中，每组样品三个平行样，利用连续光谱多功能酶标仪进行荧光强度的测试。测试选取特定激发波长和发射波长，通过测试发射波长处其荧光强度反映溶液中淀粉样多肽的聚集程度，从而验证多肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集的调控。
[0095]所述连续光谱多功能酶标仪为Tecan infinite M200 ;所述酶标板为Corning黑色低吸附量96孔酶标板；所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长分别为450nm和482nm，增益值为100 ;所述实验条件为室温。每间隔10min_60min测试一次，荧光的强度值为所测三个平行样的平均值。
[0096]5)利用细胞毒性测试实验检测多肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果。
[0097]所述淀粉样多肽细胞毒性测试的样品制备方法包括如下步骤:
[0098]a5.将所述淀粉样多肽分别制成300 μ M的溶液；
[0099]b5.将所述短肽抑制剂制成30 μ M，60 μ Μ, 150 μ Μ, 300 μ Μ, 600 μ M的溶液；
[0100]c5.将所述佐剂制成 30 μ Μ，60 μ Μ，150 μ Μ，300 μ Μ，600 μ M 的溶液；
[0101]d5.将短肽抑制剂与佐剂按不同的摩尔比，溶解到磷酸缓冲液中制成 30 μ M: 30 μ M, 60 μ M: 60 μ M, 150 μ M: 150 μ M, 300 μ M: 300 μ M, 300 μ M: 30 μ M,300μΜ:60μΜ，300μΜ:150μΜ，600μΜ:600μΜ的混合溶液，室温孵育I小时以形成抑制剂_佐剂复合物；
[0102]e5.将步骤a5中所述的淀粉样多肽溶液取5 μ L加入到培养好的神经肿瘤细胞中，淀粉样多肽溶液的最终浓度为10 μ M ;经过48小时的孵育后，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率，通过存活率判断淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度。
[0103]f5.将步骤a5中所述的淀粉样多肽和步骤b5中不同浓度的短肽抑制剂的溶液各取5 μ L加入到培养好的神经肿瘤细胞中，淀粉样多肽溶液的最终浓度为10 μ Μ,短肽抑制剂的最终浓度为I μ Μ，2 μ Μ，5 μ Μ，10 μ Μ，20 μ M ;经过48小时的孵育后，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率，通过存活率判断淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度。
[0104]g5.将步骤a5中所述的淀粉样多肽和步骤e5中所述不同浓度的佐剂的溶液各取5 μ L加入到培养好的神经肿瘤细胞中，佐剂溶液的最终浓度为I μ Μ，2 μ Μ，5 μ Μ，10 μ Μ，20 μ Μ,淀粉样多肽的最终浓度为10 μ M ;经过48小时的孵育后，利用步骤C5中的方法测定短肽抑制剂对淀粉样多肽神经毒性的抑制效果。[0105]h5.将步骤a5中所述的淀粉样多肽和步骤d5中所述不同摩尔比的抑制剂-佐剂复合物溶液各取5 μ L加入到培养好的神经肿瘤细胞中，佐剂溶液的最终浓度和短肽抑制剂的最终浓度为 I μ Μ:1 μ Μ，2 μ Μ: 2 μ Μ，5 μ Μ: 5 μ Μ，10 μ Μ: 10 μ Μ，I μ Μ: 10 μ Μ，I μ Μ: 10 μ Μ, 5 μ Μ: 10 μ Μ, 20 μ M:20 μ Μ,淀粉样多肽的最终浓度为10 μ Μ。经过48小时的孵育后，利用步骤e5中的方法测定短肽抑制剂对淀粉样多肽神经毒性的抑制效果。
[0106]优选地，所述淀粉样多肽为β -淀粉样多肽。
[0107]优选地，所述β -淀粉样多肽为β -淀粉样多肽A β 1-42CA β 1-42)、β -淀粉样多肽 Αβ 10-20 (Αβ 10-20)、β-淀粉样多肽 Aβ 33-42 (Αβ 33-42)、β -淀粉样多肽 Aβ 1-28(Αβ 1-28)或β-淀粉样多肽Aβ 1-40 (Αβ 1-40)，所述β-淀粉样多肽Aβ 1-42的序列为SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述β-淀粉样多肽A β 1-40的序列为SEQ ID Ν0:4所示的氨基酸序列，所 述β-淀粉样多肽A β 1-28的序列为SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，所述淀粉样多肽Aβ 33-42的序列为SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列，所述β-淀粉样多肽Αβ 10-20的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0108]优选地，淀粉样多肽为β -淀粉样多肽1-42 (Αβ 1-42)。
[0109]优选地，所述短肽抑制剂可以选自β -淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段及其突变体和衍生物。
[0110]优选地，所述短肽抑制剂的序列含有下述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列:KLVFF。
[0111]优选地，所述短肽抑制剂为β -淀粉样多肽A β 16-20 (Α β 16-20)和/或β -淀粉样多肽Αβ 17-21 (Αβ 17-21)，所述Αβ 16-20的序列为下述SEQ ID Ν0:1所示的氨基酸序列:KLVFF,所述Αβ 17-21的序列为下述SEQ ID NO: 2所不的氛基酸序列:LVFFA。
[0112]进一步优选地，所述短肽抑制剂为A β 16-20。
[0113]优选地，所述佐剂选自吡啶类和多酚类化合物。
[0114]所述吡啶为4，4’ -联吡啶、1，2- 二(4-吡啶基)乙烯，三联吡啶、4’ -氯-2，2’:6’，2”_三吡啶；进一步优选地，为4’ -氯-2，2’:6’，2”-三吡啶，所述多酚类化合物及其衍生物可为(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇、花青素、姜黄素和紫杉叶素；进一步优选地，所述多酚类佐剂为(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯。
[0115]所述的神经肿瘤细胞为SH-SY5Y细胞，作为神经细胞的模型体系；根据淀粉样多肽的不同，可以选择相应的细胞系验证其毒性抑制效果。
[0116]综上所述，本发明的目的在于发展一种抑制淀粉样多肽毒性的新方法，通过加入佐剂在分子水平上调控短肽抑制剂的组装结构，形成全新的抑制剂-佐剂复合物，从而抑制淀粉样多肽的组装、聚集和毒性。
[0117]本发明的一个实施方案利用扫描隧道显微技术在分子水平上观察抑制剂-佐剂复合物的组装结构，利用原子力显微技术测试抑制剂-佐剂复合物对于淀粉样多肽聚集体形貌的改变，利用荧光技术测试淀粉样多肽对淀粉样多肽分子聚集行为的调控效果，利用细胞毒性测试技术检测淀粉样多肽对淀粉样多肽神经毒性的抑制。具体包括如下步骤:
[0118]步骤1:制备短肽抑制剂的溶液，超声30秒钟；
[0119]步骤2:在短肽抑制剂的溶液中，加入佐剂，使其充分混合，形成抑制剂-佐剂复合物；
[0120]步骤3:混合之后，将短肽抑制剂溶液、抑制剂-佐剂复合物的溶液各取15微升分别滴在两块新解理的高定向热解石墨表面，静置5分钟；
[0121]步骤4:用高纯氮气把残留在石墨表面的溶液吹走；
[0122]步骤5:用扫描隧道显微镜来进行观测，分别观察短肽抑制剂的组装结构和抑制剂-佐剂复合物的组装结构，通过观察分析，在单分子水平上确认抑制剂-佐剂复合物的形成。
[0123]步骤6:用原子力显微镜来进行观测，分别观察淀粉样多肽的聚集体形貌和短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体形貌的影响，通过观察分析，确认短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集抑制效果。
[0124]步骤7:用荧光技术检测50 μ M和62.5 μ M淀粉样多肽在溶液中的聚集行为，以及相同浓度短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽加入后对淀粉样多肽聚集的影响。
[0125]步骤8:用神经细胞毒性测试方法检测淀粉样多肽的神经细胞毒性以及短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽神经毒性的抑制。
[0126]本发明利用扫描隧道显微技术在分子水平上观察到了佐剂对短肽抑制剂组装结构的调控，确认了抑制剂-佐剂复合物的形成。在分子水平上提供了佐剂与短肽抑制剂相互作用的位点。
[0127]本发明利用原子力显微技术在纳米尺度水平观察到了短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体形貌的调控。可以使人们直观地观察到短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集调控效果，特别是清楚地观察到抑制剂-佐剂复合物在抑制淀粉样多肽的聚集方面的良好效果。
[0128]本发明利用荧光光谱技术揭示了短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽分子聚集行为的调控效果。
[0129]本发明提出了一种利用非共价键相互作用制备淀粉样多肽聚集的抑制剂的新方法，并发现了一类新的高效抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物。
[0130]本发明可以在分子水平上揭示分子与淀粉样多肽的相互作用，为研究药物分子与淀粉样多肽相互作用机理，提供了有效方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0131]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0132]图1是短肽抑制剂A β 16-20组装体的扫描隧道显微镜图像和A β 16_20组装结构图；
[0133]图2是短肽抑制剂A β 16-20与佐剂4’ -氯_2，2’:6’，2”-三吡啶形成共组装结构的扫描隧道显微镜图像，图中a-d分别表示短肽抑制剂与佐剂的摩尔比分别为5:1，1:1，1:1，1:5的显微镜图像；
[0134]图3是短肽抑制剂Αβ 16-20、佐剂4’ -氯-2，2’:6’，2”-三吡啶及不同摩尔比的抑制剂-佐剂复合物的1H核磁共振(NMR)谱图，其中，图3a为短肽抑制剂的1H核磁共振(NMR)谱图，图3b为佐剂的1H核磁共振(NMR)谱图，图3c为短肽抑制剂和佐剂的摩尔浓度为5:1时形成的抑制剂-佐剂复合物的1H核磁共振(NMR)谱图，图3d为短肽抑制剂和佐剂的摩尔浓度为1:1时形成的抑制剂-佐剂复合物的1H核磁共振(NMR)谱图，图3e为短肽抑制剂和佐剂的摩尔浓度为1:5时形成的抑制剂-佐剂复合物的1H核磁共振(NMR)谱图；
[0135]图4是佐剂、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽A β 1-42聚集体形貌调控的原子力显微镜图像；其中，图4a为淀粉样多肽A β 1-42聚集体的原子力显微镜图像；图4b为淀粉样多肽A β 1-42与短肽抑制剂A β 16-20形成的共组装体的原子力显微镜图像；图4c为淀粉样多肽A β 1-42与佐剂4’ -氯-2，2’:6’，2” -三吡啶形成的组装体的原子力显微镜图像；图4(1为淀粉样多肽Αβ 1-42与摩尔比为1:1的抑制剂-佐剂复合物调形成的共组装体的原子力显微镜图像，图中的I μ m表示X和Y坐标轴的比例尺，30nm表示Z坐标轴的比例尺；
[0136]图5是佐剂、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂复合物在溶液中对淀粉样多肽聚集调控的硫磺素(ThT)荧光结果；其中，图5a为淀粉样多肽Αβ 1-42自聚集、短肽抑制剂Αβ 16-20(KLVFF)抑制淀粉样多肽A β 1-42的聚集、佐剂4，-氯-2，2，:6，，2”-三吡啶(Cl-Ter)加速淀粉样多肽Αβ 1-42聚集的ThT荧光结果，图中的方块构成的曲线为淀粉样多肽Αβ 1-42自聚集的结果，三角构成的曲线为短肽抑制剂A β 16-20 (KLVFF)抑制淀粉样多肽A β 1-42的聚集，圆点构成的曲线为佐剂4’ -氯-2，2’:6’，2”-三吡啶(Cl-Ter)加速淀粉样多肽Αβ 1-42 聚集的 ThT 荧光结果 ^5b-f 分别为 Αβ 1-42:Αβ 16-20:4，_ 氯-2，2，:6，，2，，-三吡啶的摩尔比为5:5:1、5:5:2.5,5:5:5,5:5:10,5:5:25时，抑制剂-佐剂复合物抑制淀粉样多肽A β 1-42聚集的荧光结果，图中的方块构成的曲线为淀粉样多肽A β 1-42自聚集的结果，星形构成的曲线为抑制剂-佐剂复合物抑制淀粉样多肽A β 1-42聚集的荧光结果；图6是淀粉样多肽的神经细胞毒性以及短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽神经毒性的抑制的细胞毒性测试实验；其中，图6&为141，241，5411和10 μ M不同浓度的短肽抑制剂A β 16-20的神经细胞毒性测试结果;图6b为I μ Μ，2 μ Μ，5 μ M和10 μ M不同浓度的佐剂4’ -氯-2，2’:6’，2”-三吡啶的的神经细胞毒性测试结果；图6c为不同摩尔比(10 μ M:1 μ M、 10 μ M: 2 μ M、10 μ M: 5 μ M、10 μ M: 10 μ M)的短肽抑制剂 A β 16-20 与佐剂4’ -氯-2，2’:6’，2”-三吡啶形成的抑制剂-佐剂复合物的神经细胞毒性测试结果；图6d为淀粉样多肽A β 1-42的浓度保持在10 μ M不变，不同浓度的短肽抑制剂A β 16-20对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果(Α β 1-42/Α β 16-20:10 μ Μ:1 μ Μ、10 μ Μ: 2 μ Μ、10 μ Μ: 5 μ Μ、10 μ Μ: 10 μ Μ)以及摩尔比为1:1的抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果(Αβ l-42/Αβ 16-20/4，-氯-2，2，:6’，2”-三吡啶:10 μ Μ:1 μ Μ:1 μ Μ、10 μ Μ: 2 μ Μ: 2 μ Μ、10 μ Μ: 5 μ Μ: 5 μ Μ、10 μ Μ: 10 μ Μ: 10 μ M);e 为淀粉样多肽A β 1~42 的浓度保持在10 μ M不变，不同浓度的短肽抑制剂A β 16-20对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果(Αβ l-42/Αβ 16-20:10 μ Μ:1 μ Μ、10 μ Μ: 2 μ Μ、10 μ Μ: 5 μ Μ、10 μ Μ: 10 μ Μ);不同摩尔比的抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果，其中短肽抑制剂A β 16-20与淀粉样多肽A β 1-42的摩尔比保持1:1 (八3 1-42/^3 16-20/4，-氯-2，2，:6’，2”_三批 P定:10μΜ:10μΜ:1μΜ、10μΜ:10μΜ:2μΜ、10μΜ:10μΜ:5μΜ、10μΜ:10μΜ:10μΜ)。
[0137]图7为利用ThT荧光光谱技术在连续光谱多功能酶标仪中测试佐剂EGCG、短肽抑制剂、抑制剂-EGCG复合物在溶液中对淀粉样多肽聚集调控的硫磺素(ThT)荧光结果；具体的，图7为Αβ 1-42:Αβ 16-20 =EGCG的摩尔比为1:2:2时，抑制剂-EGCG复合物抑制淀粉样多肽Αβ 1-42聚集的荧光结果，图中的方块构成的曲线为淀粉样多肽Αβ 1-42自聚集的ThT荧光强度结果，圆点构成的曲线为短肽抑制剂A β 16-20抑制淀粉样多肽A β 1-42聚集的ThT荧光强度结果，三角形构成的曲线为EGCG抑制淀粉样多肽A β 1-42聚集的ThT荧光强度结果；星形构成的曲线为抑制剂-EGCG复合物抑制淀粉样多肽A β 1-42聚集的荧光强度结果；
[0138]图8 为 10 μ M 淀粉样多肽 Αβ 1-42,20 μ M 短肽抑制剂 Αβ 16-20,20 μ MEGCG,20 μ M的抑制剂-EGCG复合物的神经细胞毒性测试结果，以及20 μ M的短肽抑制剂、20 μ M的EGCG、20 μ M的抑制剂-EGCG复合物对10 μ M淀粉样多肽A β 1-42神经毒性的抑制效果(Αβ l-42/Αβ 16-20/EGCG: 10 μ Μ:20 μ Μ:20 μ Μ)。
【具体实施方式】
[0139]除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
[0140]实施例1基于扫描探针显微镜来观察短肽抑制剂的组装结构以及佐剂I对短肽抑制剂组装结构的调控
[0141]1、所使用物质的化学结构
[0142]短肽抑制剂(Αβ 16-20 (SEQ ID NO:1 )，上海科肽生物技术有限公司，纯度为98%)和佐剂 I (4，-chloro-2, 2’: 6，，2，，-terpyridine, Acros),如下式所不:
[0143]
【权利要求】
1.一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物，所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比组成，优选地，所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成，进一步优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~1:1的摩尔比组成，更优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:1的摩尔比组成； 所述短肽抑制剂选自β -淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物；优选地，所述短肽抑制剂的序列含有下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF ; 所述佐剂选自吡啶类和多酚类化合物。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述短肽抑制剂为Aβ16-20和/或Αβ 17-21，所述Αβ 16-20的序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF，所述Αβ 17-21的序列为下述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列=LVFFA ;优选地，所述短肽抑制剂为 Αβ 16-20。
3.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述多酚类化合物及其衍生物可选自(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇、花青素、姜黄素和紫杉叶素中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述吡啶类化合物为4，4’-联吡啶、1,2-二(4-吡啶基)乙烯、三联吡啶或4’-氯-2，2’:6’，2”_三吡啶。
5.根据权利要求3或4所述的复合物，其特征在于，所述吡啶类化合物为4’ -氯-2，2’:6’，2”_ 三吡啶； 所述多酚类化合物为(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物的制备方法，所述方法包括将短肽抑制剂与佐剂按1:5~10:1的摩尔比溶解到缓冲液中制备混合溶液，使短肽抑制剂的终浓度为10-100 μ Μ,再将混合溶液孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物，优选地，使短肽抑制剂的终浓度为50 μ Μ,即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~5:1，优选地，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~1:1，更优选地，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:1 ;再优选地，所述缓冲液为ΡΗ6.8-7.5的磷酸盐缓冲液，更优选地，所述缓冲液为ΡΗ7.4的磷酸盐缓冲液；进一步优选地，所述混合溶液于室温孵育0.5-3小时，优选I小时。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物在制备用于抑制淀粉样多肽聚集或对细胞毒害作用的药物中的应用。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物在制备用于治疗和/或预防与淀粉样多肽有关的疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述淀粉样多肽为阿尔茨海默氏病相关的β_淀粉样多肽、2型糖尿病相关的胰淀素、亨廷顿氏病相关的多聚谷氨酰胺、帕金森氏病相关的核突触蛋白、牛海绵状脑病和克罗伊茨费尔特-雅各布氏病相关的朊病毒； 优选地，所述淀粉样多肽为淀粉样多肽Αβ，更优选地，所述β-淀粉样多肽Αβ为β-淀粉样多肽A β 1-42、β-淀粉样多肽A β 1-40、β-淀粉样多肽A β 1-28、β -淀粉样多妝A β 33-42、β -淀粉样多妝A β 10-20及其片段，所述β ~淀粉样多妝A β 1-42的序列为SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述β-淀粉样多肽A β 1-40的序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述β -淀粉样多肽Αβ 1-28的序列为SEQ ID Ν0:5所示的氨基酸序列，所述β -淀粉样多肽A β 33-42的序列为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列，所述β -淀粉样多肽A β 10-20的序列为SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列；还优选地，所述淀粉样多肽为淀粉样多肽A β 1-42。
11.一种抑制淀粉样多肽的聚集或神经毒性的方法，包括以下步骤: 步骤A:制备淀粉样多肽溶液，淀粉样多肽与短肽抑制剂的混合溶液、淀粉样多肽与佐剂的混合溶液，及淀粉样多肽与权利要求1至5中任一项所述的复合物的混合溶液，再将其于室温孵育； 步骤B:将孵育后的步骤A的溶液，利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响。 步骤C:将孵育后的步骤A的溶液，利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果。 步骤D:将孵育后的步骤A的溶液，利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤A具体包括以下步骤: 步骤Α.1:将淀粉样多肽溶解于缓冲液中，制成淀粉样多肽溶液，优选地，所述缓冲液为ρΗ=6.8-7.5的磷酸缓冲液,进一步优选地,所述磷酸缓冲液的pH为7.4 ; 步骤A.2:将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂或佐剂，溶解于缓冲液中，制得短肽抑制剂和淀粉样多肽混合溶液及佐剂和淀粉样多肽混合溶液，优选地，将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，于37°C孵育1_3天，更优选地，将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，于37°C孵育2天； 步骤A.3:将短肽抑制剂和佐剂，溶解于缓冲液中，制得混合溶液，使短肽抑制剂的终浓度为10-125 μ Μ,优选10-100 μ M的溶液，再室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂 -佐剂复合物溶液，优选地，使短肽抑制剂的终浓度分别为50 μ M或125 μ Μ，更优选地，将短肽抑制剂和佐剂溶解于ρΗ=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，于室温孵育0.5-3小时，进一步优选地，将短肽抑制剂和佐剂溶解于ρΗ=7.4的磷酸缓冲液中，于室温孵育I小时； 步骤Α.4:将步骤Α.3得到的复合物溶液与步骤Α.1制得的淀粉样多肽溶液混合，然后将所得混合物溶解到缓冲液中，使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂部分与淀粉样多肽的浓度均为10-125 μ Μ,优选10-100 μ M的溶液，再将其孵育，优选地，使抑制剂_佐剂复合物中的短肽抑制剂部分与淀粉样多肽的浓度均为50 μ M溶液，或者使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂的浓度为125 μ Μ、淀粉样多肽的浓度为62.5 μ Μ，更优选地，所述缓冲液为ρΗ=6.8-7.5的磷酸缓冲液，得到抑制剂-佐剂复合物与淀粉样多肽的混合溶液，还优选地，所述混合溶液于37°C共同孵育1-3天，进一步优选地，所述混合溶液于37°C共同孵育2天。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，在步骤A.1中，当利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响时，所述淀粉样多肽溶液的浓度为10-100 μ M，优选地，所述淀粉样多肽溶液的浓度为.50 μ M ;或利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果，所述淀粉样多肽溶液的浓度为10-125 μ Μ，更优选地，所述淀粉样多肽溶液的浓度为62.5 μ M ;当利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，所述淀粉样多肽溶液的浓度为1-5 μ Μ，优选地，所述淀粉样多肽溶液的浓度为2.5μΜ ;或 当利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果时，所述淀粉样多肽溶液的浓度为50-500 μ Μ,优选地，所述淀粉样多肽溶液的浓度为300 μ Mo
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤Α.2中，当利用原子力显微技术观察短肽抑制剂和佐剂对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响时，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中；或 当利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂和佐剂对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中，优选地， 所述淀粉样多肽(2.5 μ Μ)分别与短肽抑制剂(2.5 μ Μ)、佐剂(2.5 μ Μ)和所述抑制剂-佐剂复合物(2.5 μ Μ)混合溶解于缓冲液中；或当利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物按1:2的摩尔比溶解于缓冲液中，优选地，所述淀粉样多肽(62.5 μ Μ)分别与短肽抑制剂(125 μ Μ)、佐剂(125 μ Μ)和所述抑制剂-佐剂复合物(125 μ Μ)混合溶解于缓冲液中； 当利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂和佐剂对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果时，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按5:1~1:1的摩尔比溶解于缓冲液中，优选地，所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按300 μ M: 30 μ Μ、300 μ M: 60 μ Μ、300 μ Μ: 150 μ Μ、300 μ Μ: 300 μ M的摩尔比溶解于缓冲液中；所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按10 μ Μ: 20 μ M的摩尔比溶解于缓冲液中。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤Α.3中，将短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比，溶解到缓冲液中，制得混合溶液，室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物溶液，优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成，最优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按I:1的摩尔比组成。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤B中，还包括将步骤Α.1、Α.2、Α.3、Α.4得到的混合溶液分别滴加到云母、硅片等平整基底上，然后空气干燥后，在固/气界面获得各自的原子力显微镜图像的步骤。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤C中，还包括制备荧光染料分子溶液，再将步骤A.UA.2、Α.3、Α.4得到的中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后放入标准的石英池中，在荧光光谱仪中进行测试的步骤，优选地，在利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，使用该步骤；或 利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时，也包括制备荧光染料分子溶液，并将步骤Α.1、Α.2、Α.3、Α.4中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后接种到酶标板中，在连续光谱多功能酶标仪中进行荧光强度测试的步骤。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤C中，还包括将步骤A.UA.2、A.3、A.4得到的混合溶液分别取5 μ L加入培养好的神经肿瘤细胞中，孵育后，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率，通过存活率判断淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度的步骤； 优选地，所述淀粉样多肽溶液的最终浓度均为5-20 μ Μ，在淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液中及淀粉样多肽和佐剂的混合溶液中，所述短肽抑制剂和佐剂的最终浓度均为I μ Μ，2 μ Μ，5 μ Μ，10 μ Μ，20 μ M ;在淀粉样多肽和抑制剂_佐剂复合物的混合溶液中，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为I μ Μ:1 μ Μ，2 μ Μ: 2 μ Μ，5 μ Μ: 5 μ Μ，10 μ Μ: 10 μ Μ，I μ Μ: 10 μ Μ，I μ Μ: 10 μ Μ，10 μ Μ: 5 μ Μ，20 μ Μ: 20 μ M ;更优选地，所述淀粉样多肽溶液的最终浓度为10 μ Μ，进一步优 选地，孵育1-3天，还优选地，孵育2天。
【文档编号】A61K31/353GK103536897SQ201310297821
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年7月15日 优先权日:2012年7月16日
【发明者】杨延莲, 牛琳, 王琛, 刘磊, 赵琼, 徐萌 申请人:国家纳米科学中心