一种自噬抑制剂与拉帕替尼组合物及其用途

一种自噬抑制剂与拉帕替尼组合物及其用途
【专利摘要】本发明属医药【技术领域】，涉及一种自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物及其用途；该药物组合物包含细胞自噬抑制剂和拉帕替尼；其中，所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA、渥曼青霉素、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素A1、NH4Cl、氯喹和羟基氯喹中的一种或多种。所述药物组合物，可通过抑制拉帕替尼诱导的肿瘤细胞的自噬、抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对拉帕替尼治疗的拮抗作用，显著增强拉帕替尼对肿瘤的治疗效果。本发明的药物组合物可增强拉帕替尼对肿瘤的杀伤作用，增强拉帕替尼的疗效，可用于治疗恶性肿瘤。
【专利说明】一种自噬抑制剂与拉帕替尼组合物及其用途

【技术领域】
[0001]本发明属医药【技术领域】，涉及新的治疗肿瘤的药物组合物；具体涉及一种自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物及其用途；该药物组合物用于治疗肿瘤。

【背景技术】
[0002]近年来，随着肿瘤分子靶向治疗的快速发展，分子靶向治疗药物层出不穷；通常分子靶向治疗药物按照药物分子大小可分为大分子单克隆抗体(单抗)和小分子化合物两类；其中，单克隆抗体通过识别受体的胞外可辨区，与生长因子竞争结合受体，抑制信号传导系统的激活，从而抑制癌细胞的增殖和扩散；但其经常会使患者产生耐药性，由FDA批准的人源性单克隆抗体赫赛汀Trastuzumab (Herceptin)和紫杉醇类药物的合用已经成为治疗乳腺癌的金标准。所述赫赛汀同时也可与其他药物合用来增加药效，降低癌症的复发；虽然赫赛汀有很好的治疗效果，但临床实践显示，有患者在连续一年用药后会产生耐药性[Baselga J, Swain SM.Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 anddiscovering ERBB3.Nat Rev Cancer 2009; 9: 463-475.]。有研究指出，由于小分子化合物不会引起免疫反应，且可对其结构进行直接修饰或结构改造，其可直接透过细胞膜而直接作用于表皮生长因子受体的胞内激酶而直接对其所控制的细胞信号通路进行抑制；所述小分子靶向化合物可分为分裂激酶功能域受体酪氨酸激酶亚群抑制剂、表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族抑制剂、多靶点激酶抑制剂以及双靶向酪氨酸激酶抑制剂。
[0003]现有技术公开了拉帕替尼(lapatinib, Tykerb)属喹唑啉胺类化合物,是口服的小分子EGFR (ErbB-1)/HER-2 (ErbB-2)双受体酪氨酸激酶抑制剂，其化学名:二对苯基磺酸拉帕替尼单水合物(lapatinib ditosyla temonohydrate)。拉帕替尼于2007年5月由美国FDA批准与卡培他滨联合治疗HER2过度表达的乳腺癌，同时也能联合葸环类、紫杉醇、曲妥珠单抗(Trastuzumab)等药物来治疗晚期或转移性乳腺癌患者。拉帕替尼同时还能被用于治疗对曲妥珠单抗产生耐药性的HER2阳性阳性细胞，如SKBR3细胞并诱导其发生细胞凋亡。除了乳腺癌，研究还发现，拉帕替尼同样对HER2过表达的胃癌也有治疗效果[Rusnak Dff, Lackey K, Affleck K, et al.The effects of the novel, reversibleepidermal growth factor receptor/ErbB-2 tyrosine kinase inhibitor, GW2016, onthe growth of human normal and tumor-derived cell lines in vitro and in viv0.Mol Cancer Ther.2001; 1: 85-94.]。拉帕替尼通过抑制细胞内的EGFR和HER2的ATP位点阻止肿瘤细胞磷酸化和激活，阻断EGFR和HER2受体的下游信号通路，主要包括了 PI3K/AKT, Ras/MEKK/JNK, Ras/Raf-1/MAPK以及Ras/Rac/Rho通路。上述通路的抑制直接导致月中瘤生长收到抑制，同时促进肿瘤细胞的凋亡[Gilmer TM, Cable L, Alligood K, et al.1mpact of common epidermal growth factor receptor and HER2 variants on receptoractivity and inhibit1n by lapatinib.Cancer Res.2008; 68: 571-579.]。
[0004]然而，在临床治疗中，除要考虑药物的治疗效果外，更重要的还需考虑药物的安全性。有患者在服用了拉帕替尼后会产生一定的耐受性，临床结果同时也显示拉帕替尼引起常见的皮疹、恶心、呕吐、疲劳和腹泻等副作用；当患者对拉帕替尼的药效产生耐药后，力口大用药量将进一步加剧其产生的毒副作用，有研究发现拉帕替尼所引起的副作用与拉帕替尼的服用剂量呈线性相关[Burris HA, 3rd, Hurwitz HI, Dees EC, et al.Phase Isafety, pharmacokinetics, and clinical activity study of lapatinib (GW572016),a reversible dual inhibitor of epidermal growth factor receptor tyrosinekinases, in heavily pretreated patients with metastatic carcinomas.J ClinOncol.2005; 23: 5305-5313.]。
[0005]细胞自卩遼(autophagy)又称II 型程序性死亡(type II programmed cell death),是真核生物体内常见的“自我消化”(cellular degradat1n)的现象；其能分解细胞内受损或多余的细胞器和蛋白产生核苷酸，氨基酸等小分子物质供细胞合成新的蛋白质，并能维持细胞内微环境的稳定。近年来，随着分子生物学及基因技术的发展和对细胞自噬的深入认识，发现其与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切。根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自卩遼可分为三种方式:大自卩遼(macroautophagy)、小自曬(microautophagy)和分子伴侣介导的自卩遼(chaperone-mediated autophagy, CMA)；所述的大自曬(以下简称自曬)与肿瘤发展及治疗关系最为密切[Sridhar S，BotbolY, Macian F，et al.Autophagy and disease: always two sides to a problem.JPathol.2012;226(2):255-73.]。自噬是胞浆大分子物质和细胞器在双层膜包囊泡中大量降解的生物学过程，该过程大致能分为4个阶段:(I)在饥饿、缺氧、药物干扰等某些因素的刺激下，自噬泡的双层膜结构开始逐渐形成并包围在被降解物的周围；(2)自噬泡完全成型并将要被降解的物质完全隔离于细胞质；(3)自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体；(4)自噬溶酶体最终被溶酶体中的水解酶溶解，降解产物可在细胞内再循环利用° [Martinez-Borra J, Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.AdvExp Med B1l.2012; 738:169-84.] 0自噬能使细胞对外部环境改变及各种刺激产生应激反应。细胞在生长条件下能发生较低水平的自噬，称基础自噬；然而，一旦受到外界的刺激，如饥饿、缺氧、高温、高细胞密度或是生长因子剥夺等，细胞自噬的水平将会迅速上调；如在营养物质缺乏的情况下，细胞自噬能分解体内坏死细胞器产生氨基酸等供细胞合成新的蛋白质，维持细胞的存活[①Piacentini M, D’Eletto M, Falasca L, et al.Transglutaminase 2 at the crossroads between cell death and survival.AdvEnzymol Relat Areas Mol B1l.2011;78:197-246 ;② Cook KL, Shajahan AN, ClarkeR.Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.Expert Rev AnticancerTher.2011; 11 (8): 1283-94.Wirawan E, Vanden Berghe T, Lippens S, et al.Autophagy: for better or for worse.Cell Res.2012;22 (I):43-61.]。
[0006]研究发现，自噬能降解折叠错误的蛋白质、损伤的细胞器等，延缓机体衰老的发生。所述集体衰老相关疾病一神经退行性疾病可被归类为蛋白构象错误疾病，通常是由于大量折叠错误的蛋白质在细胞内堆积从而引发细胞毒性而造成的。研究表明，大量衰老性疾病，如神经退行性疾病和恶性肿瘤都与细胞自噬密切相关[①Martinez-Borra J, Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012; 738:169-84.-’② Caballero B, Coto-Montes A.An insight into the role ofautophagy in cell responses in the aging and neurodegenerative brain.HistolHistopathol.2012;27 (3):263-75.!③ Mendelsohn AR, Larrick Jff.Rapamycin asan antiaging therapeutic: targeting mammalian target of rapamycin to treatHutchinson-Gilford progeria and neurodegenerative diseases.Rejuvenat1n Res.2011; 14(4):437-41.]。
[0007]细胞自噬在生物体的发育和分化过程中起了重要作用。据报道，自噬基因缺失或者突变的线虫生长发育缺陷、衰老加速并缩短寿命；且自噬也参与果蝇变态的发生。自噬在哺乳动物成年个体组织器官发育和分化中也起了重要作用[Mizushima N, Komatsu Μ.Autophagy: renovat1n of cells and tissues.Cell.2011;147 (4):728-41.]。
[0008]此外，作为程序性细胞死亡的一种，细胞自噬能通过多种途径直接或是间接导致细胞死亡° [Denton D, Nicolson S，Kumar S.Cell death by autophagy: facts andapparent artefacts.Cell Death Differ.2012; 19 (I): 87-95.]。细胞在一些特定的条件下，由于一系列因素的影响导致了各类基因突变从而导致的细胞各类遗传性状及功能改变；该类改变可能将具有正常功能和特性的细胞转变为具有分裂迅速、抗凋亡等恶性特征的细胞即癌细胞。有研究表明，肿瘤的发生与发展和自噬的关系极为密切。
[0009]通常由于细胞自噬有利于细胞的存活，因此无论在正常细胞或是肿瘤细胞中，自噬都普遍被保留下来，并在一般情况下都维持着基础自噬。但是，自噬究竟是抑制还是促进肿瘤细胞的发生发展目前尚无定论；自噬初期可作为肿瘤发生的一种抑制因素，一些已知的肿瘤抑制因子，如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，并对自噬的抑制可使蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同，但在癌变之后其自噬能力均减弱。自噬缺乏可引起自噬底物p62积聚，通过NF-k B信号途径引起肿瘤形成[Trocoli A, Djavaher1-Mergny M.Thecomplex interplay between autophagy and NF-κ B signaling pathways in cancercells.Am J Cancer Res.2011; I (5):629-49.];然而,在肿瘤生长到一定程度时，尤其是当肿瘤内还没有形成足够的血管为其扩增提供营养时，肿瘤细胞也可通过自噬来克服营养缺乏和低氧的环境得以生存。研究还显示，在缺乏血清或氨基酸的情况下约3 h，HeLa细胞中的自噬部分从4%上升到37%，结果表明，在营养缺乏等条件下自噬也是肿瘤细胞的一种自我保护的机制[Baldwin AS.Regulat1n of cell death and autophagy by IKK andNF-κ B: critical mechanisms in immune funct1n and cancer.Tmmunol Rev.2012;246(1):327-45.]。
[0010]目前，抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞自噬所体现的作用大致可概括为两种:大部分情况下是对肿瘤细胞的保护，某些情况下也能对肿瘤细胞进行杀伤。有研究发现，化疗药物5-FU以及单克隆抗体药物曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)均能显著地诱导细胞自噬，且抑制由这3种药物产生的细胞自噬能显著增加肿瘤细胞对治疗的敏感性，[① Vazquez-Martin A, Oliveras-Ferraros C，Menendez JA.AutophagyFacilitates the Development of Breast Cancer Resistance to the Ant1-HER2Monoclonal Antibody Trastuzumab.PLoS One.2009; 4(7): e6251.!② Li J, Hou N,Faried A, Tsutsumi S, et al.1nhibit1n of Autophagy by 3-MA Enhances the Effectof 5-FU-1nduced Apoptosis in Colon Cancer Cells.Ann Surg Oncol.2009; 16(3):761 - 771。[0011 ] 迄今为止，尚未发现有关拉帕替尼诱导肿瘤细胞自噬以及细胞自噬抑制剂与拉帕替尼制成复方药物、组合物进行联合给药或是序贯给药的报道。


【发明内容】

[0012]本发明的目的是提供一种新型的药物组合物，具体涉及一种自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物；该药物组合物包含一种或多种细胞自噬抑制剂，其自身无明显细胞毒性但能通过抑制细胞自噬来增强拉帕替尼的疗效，从而降低拉帕替尼在治疗肿瘤时的用量，减少其潜在的副作用和降低治疗成本。
[0013]本发明基于目前主要用于肿瘤治疗的化疗药物大多会产生耐药性及对患者有较强的副作用；其中，虽然拉帕替尼的抗肿瘤作用得到了广泛的论证，但其体内亲和力较低，起效剂量较大，存在一些潜在的毒副作用；因此，本发明提供一种自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物；该药物组合物可加强拉帕替尼活性从而降低其用量和毒副作用；该药物组合物可通过使用一种或者几种自噬抑制剂与拉帕替尼制成复方药物或是组合物，进行联合给药或是序贯给药，加强拉帕替尼的抗肿瘤疗效。
[0014]本发明还基于细胞自噬与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切，本发明的自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物中，细胞自噬抑制剂在拉帕替尼对HER2高表达的乳腺癌的治疗过程中对拉帕替尼有抵抗作用，且使用细胞自噬抑制剂能加强拉帕替尼对肺癌、脑瘤、乳腺癌、胃癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤的疗效，尤其是乳腺癌和胃癌。
[0015]具体而言，本发明的自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物，其特征在于，包含细胞自噬抑制剂和拉帕替尼；
所述的细胞自卩遼抑制剂选自3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin Al)、NH4C1、氯喹(Chloroquine)和轻基氯喹(hydroxychloroquine)中的一种或多种；优选为 3-MA (3-Methyladenine)、氯喹(Chloroquine)和轻基氯喹(hydroxychloroquine)中的一种或多种；
本发明中，所述的细胞自噬抑制剂与拉帕替尼组成药物组合物、复方药物或序贯使用(序贯使用能增强拉帕替尼治疗恶性肿瘤的疗效)，用于治疗恶性肿瘤；
本发明中，所述的肿瘤包括但不限于乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和骨髓瘤，尤其是乳腺癌和胃癌，其中最优为HER2过度表达或者发生其它病变的乳腺癌和胃癌；
本发明中，所述的自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物，可通过抑制拉帕替尼诱导的肿瘤细胞的自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对拉帕替尼治疗的拮抗作用，从而显著增强拉帕替尼对肿瘤的治疗效果；
本发明所述的药物组合物中，进一步选自下述的形式进行配制，包括:固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体、纳米微球等。
[0016]本发明进行了细胞实验，实验结果显示，所述药物组合物中的拉帕替尼能显著诱导乳腺癌SKBR3和胃癌N87细胞发生细胞自噬，而细胞自噬则会部分抵消拉帕替尼的抗肿瘤效果；自噬在拉帕替尼杀伤肿瘤细胞的过程中起保护作用，抑制自噬能使拉帕替尼作用细胞的活力降低，增加凋亡，促进细胞周期阻滞；通过使用自噬抑制剂抑制细胞自噬能增加乳腺癌SKBR3和胃癌N87细胞对拉帕替尼的敏感性，从而增强拉帕替尼的疗效； 本发明中，采用一种或多种自噬抑制剂与拉帕替尼制成复方药物、药物组合物或联合给药或序贯给药，用于治疗恶性肿瘤，可增强拉帕替尼对肿瘤的杀伤作用，增强拉帕替尼的疗效。

【专利附图】

【附图说明】
[0017]图1显示了拉帕替尼抑制SKBR3和N87细胞增殖，其中，
A:拉帕替尼抑制SKBR3增殖；
B:拉帕替尼抑制N87增殖。
[0018]图2显示了拉帕替尼诱导乳腺癌SKBR3细胞、胃癌N87细胞发生细胞自噬，其中， A:加药组细胞中发出的荧光为明显的点状，而DMSO对照组的荧光却呈弥散状，无明显的点状出现；
B:与对照组相比，给予拉帕替尼的SKBR3和N87细胞的LC3 II的表达水平增强。
[0019]图3显示了抑制自噬能增强拉帕替尼诱导的SKBR3和N87细胞死亡，其中，
A:拉帕替尼能显著降低SKBR3细胞的细胞活力，与拉帕替尼单独使用组相比，拉帕替尼与自噬抑制剂3-MA或CQ联合应用组的SKBR3细胞的细胞活力有显著性下降；
B:拉帕替尼能显著降低N87细胞的细胞活力，与拉帕替尼单独使用组相比，拉帕替尼与自噬抑制剂3-MA或CQ联合应用组的N87细胞的细胞活力有显著性下降。
[0020]图4显示了细胞自噬在拉帕替尼所诱导的细胞凋亡过程中的作用，其中，* P <0.05，#P < 0.01，
A:拉帕替尼能抑制SKBR3细胞中HER2受体蛋白的磷酸化；
B:与单用拉帕替尼的对照组相比，拉帕替尼与20 μ M CQ或者2 mM 3-MA联用后，均显著增加cleaved_Caspase3的表达；
C:SKBR3的凋亡率从45.50%上升至72.48%，N87细胞的凋亡率从27.30%升至42.66%ο
[0021]图5显示了细胞自噬在拉帕替尼所诱导的细胞周期阻滞过程中的作用。

【具体实施方式】
[0022]实施例1:配制自噬抑制剂药物
(1)配制氯喹:取适量氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用0.1 μ M的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验用PRM1-1640培养基稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；
(2)配制氯化铵:取适量氯化铵溶于水配成0.4mol/L的储存液，用0.1 μ M的滤器过滤除菌后保存于4°C ;体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬；
(3)配制羟基氯喹:取适量羟基氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用0.1 μ M的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；
(4)配制3-MA:取适量3-MA干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1 μ M的滤器过滤除菌后保存于_20°C ;体外实验时稀释50-200倍用于抑制细胞自噬；
(5)配制LY294002:取适量LY294002干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1 μ M的滤器过滤除菌后保存于-20°C ;体外实验时稀释50-100倍用于抑制细胞自噬；
(6)配制巴伐洛霉素Al:取适量巴伐洛霉素Al干粉配制成0.5 μ g/mL的储存液，用0.1 μ M的滤器过滤除菌后保存于-20°c，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自噬；
(7)自噬抑制剂与拉帕替尼联合应用于体内或体外抗肿瘤时，自噬抑制剂3-MA的使用浓度范围为0-1 mol/L,自噬抑制剂CQ的使用浓度范围为0-50 mol/L，羟基氯喹的使用浓度范围为0-50 mol/L, LY294002的使用浓度范围为Ο-lmol/L，巴伐洛霉素Al的使用浓度范围为 0-10mol/L。
[0023]实施例2:细胞培养
乳腺癌SKBR3细胞和胃癌N87细胞使用含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的PRM1-1640培养基培养；细胞生长至对数生长期时，将细胞消化后以l*105cellS/mL的浓度转入细胞培养板内培养，培养12 h后各组细胞分别给予相应浓度的拉帕替尼；联合给药时，给药前I h加入20 μ M CQ或者2 mM 3-MA抑制SKBR3和N87细胞的细胞自噬；连续培养24 h、48 h或72 h后进行下一步处理。
[0024]实施例3:拉帕替尼能抑制SKBR3和N87细胞的增殖
将适当浓度的SKBR3和N87细胞种在96孔培养板内，加入拉帕替尼使拉帕替尼的终浓度为0-1.6 μ M，培养48 h，向每孔加入10 μ LMTT液，在培养箱内放置4 h,之后用DMSO溶液溶解，570nm下测量光密度值(0.D.)，结果如图1的A、B所示，拉帕替尼对SKBR3和N87细胞有良好的药效并且拉帕替尼对SKBR3和N87细胞的杀伤作用具有良好的剂量依赖性。
[0025]实施例4:拉帕替尼能诱导乳腺癌SKBR3细胞、胃癌N87细胞发生细胞自噬乳腺癌SKBR3细胞、胃癌N87细胞用LC3-EGFP质粒转染后，再用0.1 μ M拉帕替尼处理48 h，随后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光斑点，结果如图2A所示，加药组细胞中发出的荧光为明显的点状，而DMSO对照组的荧光却呈弥散状，无明显的点状出现。
[0026]将收集到的SKBR3和N87细胞用PBS洗I次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20 μ g进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭I h，分别加入LC3 II和β-actin抗体，于4°C孵育12 h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5 h，用ECL显色液显色；SKBR3和N87细胞经过拉帕替尼处理不同时间或不同浓度处理后，通过WesternBlot的检测，结果如图2B所示，与对照组相比，给予拉帕替尼的SKBR3和N87细胞的LC3 II的表达水平增强。
[0027]实施例5:抑制自噬能增强拉帕替尼诱导的SKBR3和N87细胞死亡
SKBR3和N87细胞分别给予0.1 μ M的拉帕替尼，并在给药前I h加入2mmol/L的3-MA和20 μ mol/L的CQ抑制细胞自噬；连续培养48 h后经过MTT法测定各组的细胞活力，结果如图3A、B所示，拉帕替尼能显著降低SKBR3和N87细胞的细胞活力，与拉帕替尼单独使用组相比，拉帕替尼与自噬抑制剂3-MA或CQ联合应用组的SKBR3和N87细胞的细胞活力有显著性下降；表明自噬抑制剂和拉帕替尼的联合给药能更有效地抑制SKBR3和N87细胞的生长，且只加抑制剂3-MA和CQ组的细胞活力与对照组相比，无显著差异；抑制剂本身对细胞无明显细胞毒性，自噬抑制剂和拉帕替尼的联合给药所降低的SKBR3和N87细胞的细胞活性并非是抑制剂和药物的协同作用所致，而是因抑制自噬后增加SKBR3和N87细胞对拉帕替尼的药物敏感性；结果表明，抑制自噬能增加拉帕替尼对SKBR3和N87细胞的杀伤作用。
[0028]实施例6:细胞自噬在拉帕替尼所诱导的细胞凋亡过程中的作用
(I)拉帕替尼和自噬抑制剂联用对凋亡相关蛋白表达水平的影响
选对数生长期的细胞，以10X 15个细胞/孔的密度接种于细胞6孔板内培养过夜，待细胞贴壁充分后，加入0.ΙμΜ的拉帕替尼(SKBR3细胞)再继续培养48 h ;然后采用RIPA裂解液裂解细胞并提取细胞全蛋白组，然后进行Western-blot。
[0029]结果如图4A所示，拉帕替尼能抑制SKBR3细胞中HER2受体蛋白的磷酸化；拉帕替尼促进PARP的剪切，且呈明显的量效关系；拉帕替尼下调抑凋亡基因Bcl-2表达，且呈明显的量效关系；随拉帕替尼浓度增加，SKBR3细胞中LC3-1I的表达量增多；
(2)拉帕替尼和自曬抑制剂联用对Caspase-3表达水平的影响
与单用拉帕替尼的对照组相比，拉帕替尼与20 μ M CQ或者2 mM 3-MA联用后，均显著增加cleaved-Caspasd的表达(如图4B所示)，表明使用自噬抑制剂CQ或是3-MA抑制细胞自噬能增强拉帕替尼诱导的SKBR3和N87细胞的凋亡；
(3)流式细胞法检测结果
①DMSO对照组中，SKBR3和N87细胞的凋亡较少；②加入0.1 μΜ的拉帕替尼后，SKBR3的凋亡率为45.50%,而Ν87细胞的凋亡率也为27.30% 0.1 μ M拉帕替尼与20μ M的CQ联用后，与单用拉帕替尼相比，SKBR3的凋亡率上升了将近一倍，为87.61%，Ν87细胞的凋亡率也为从原先的27.30%上升到了 52.26% ;④加入2 mM的3-MA后，SKBR3和N87细胞的凋亡率分别为12.05%和12.90% ;⑤加入0.1 μ M的拉帕替尼的同时再加入2mM的3-MA后，SKBR3的凋亡率从原先的45.50%上升至72.48%，N87细胞的凋亡率也为从原先的27.30%上升到了 42.66% (如图4C所示)；
实验结果表明，抑制细胞自噬能增强拉帕替尼诱导乳腺癌SKBR3和胃癌N87细胞犯人凋亡。
[0030]实施例7:细胞自噬在拉帕替尼所诱导的细胞周期阻滞过程中的作用
①对照组54.27%的SKBR3细胞处于Gl期，31.67%的细胞处于分裂期加入了 0.1μ M的拉帕替尼后，72.60% SKBR3细胞的细胞周期处于Gl期(P < 0.05)，而处在细胞分裂期的细胞比例降低至16.63% ;③加入20 μ M的CQ后，有55.00% SKBR3细胞的细胞周期处于细胞间期中的Gl期(P < 0.05)，处在细胞分裂期的细胞比例为28.00%，通过t检验统计检测出其与DMSO处理组相比无显著性差异；④加入0.1 μ M的拉帕替尼的同时，再加入20 μ M的CQ，发现有81.13%SKBR3细胞的细胞周期处于间期中的Gl期，而处在细胞分裂期细胞的比例下降到6.53%，通过t检验统计检测出其与拉帕替尼单独处理组相比有显著性的差异(P < 0.05);⑤加入2 mM的3-MA后，发现大约有57.87% SKBR3细胞的细胞周期处于细胞间期中的Gl期，处在细胞分裂期的细胞比例为30.43%，通过t检验统计检测出其与DMSO对照组相比无显著性的差异(P > 0.05);⑥加入0.1 μΜ的拉帕替尼的同时再加入2 mM的3-MA后，结果显示，大约有78.43% SKBR3细胞的细胞周期处于细胞间期中的Gl期，而处在细胞分裂期的细胞比例下降到6.64%，通过t检验统计检测出其与拉帕替尼单独处理组相比有显著性的差异(P < 0.05)(如图5所示)；
结果表明，拉帕替尼与自噬抑制剂联用对胃癌N87细胞周期的影响和乳腺癌SKBR3的影响类似；自噬抑制剂CQ或3-MA抑制细胞自噬能增强拉帕替尼所诱导的SKBR3和N87细胞周期的阻滞现象。
[0031]实施例8:配制自噬抑制剂和拉帕替尼药物组合物 (O氯喹和拉帕替尼药物组合物的配制
主药拉帕替尼250g ，自噬抑制剂氯喹200g，淀粉为填充剂，兼做内加崩解剂40g，10%淀粉浆为黏合剂24g，外加崩解剂干淀粉23g ，硬脂酸镁为润滑剂3g，制成1000片，每片含拉帕替尼0.25g ；
(2)巴伐洛霉素Al和拉帕替尼药物组合物的配制
拉帕替尼250g ，巴伐洛霉素Al 180g ，淀粉40g，10%淀粉浆25g ，外加崩解剂干淀粉20g，润滑剂硬脂酸镁4g，制成1000片，每片含拉帕替尼0.25g。
【权利要求】
1.一种自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物，其特征在于，包含细胞自噬抑制剂和拉帕替尼； 所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA、渥曼青霉素、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素Al、NH4C1、氯喹和羟基氯喹中的一种或多种。
2.按权利要求1所述的自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA、氯喹和羟基氯喹中的一种或多种。
3.按权利要求1所述的自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂与拉帕替尼制成复方药物。
4.按权利要求3所述的自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物，其特征在于，所述复方药物制成:固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体或纳米微球剂型。
5.按权利要求3所述的自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物，其特征在于，所述的复方药物中，自噬抑制剂与拉帕替尼序贯使用。
6.权利要求1所述的自噬抑制剂与拉帕替尼药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
8.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自HER2过度表达或者发生其它病变的乳腺癌或胃癌。
9.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的自噬抑制剂抑制拉帕替尼诱导的肿瘤细胞的自噬、抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对拉帕替尼治疗的拮抗作用。
【文档编号】A61K33/02GK104324035SQ201310310119
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年7月23日 优先权日:2013年7月23日
【发明者】鞠佃文, 王晓丹, 王子玉, 曾贤, 李玉彬, 范佳君, 王绍飞 申请人:复旦大学