一种新型狂犬病疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型狂犬病疫苗及其制备方法。本发明人基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组的疫苗载体，构建了一种新型狂犬病疫苗载体。本发明还提供了以所述的疫苗载体制备的可高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
【专利说明】一种新型狂犬病疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种新型狂犬病疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]狂犬病是由狂犬病毒引发的以侵犯中枢神经系统为特征的致死性人畜共患传染病。狂犬病在全球每年导致5万多人死亡，给生命健康和社会经济造成巨大影响。狂犬病毒是单股负链RNA病毒，属于弹状病毒科弹状病毒属，外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜。狂犬病毒外膜上的糖蛋白(Gp)抗原是病毒表面棘突的成分，有凝集细胞的能力，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有嗜神经性；糖蛋白能诱导机体产生中和抗体并诱导细胞免疫，中和抗体对于病毒感染具有完全保护作用。按世界卫生组织(WHO)的要求，人或动物血清狂犬病毒中和抗体的效价高于0.5IU/ml被认为达到有效保护水平(Nishizono A等，Evaluation of an improved rapid neutralizing antibody detection test(RAPINA)for qualitative and semiquantitative detection of rabies neutralizing antibodyin humans and dogs.Vaccine.2012;30 (26):3891-6)。
[0003]病犬是狂犬病主要的传染源，其次是猫、猪及狐狸等各种野生或家养动物。狂犬病毒主要的传播方式是经咬伤传播或病犬唾液经损伤的粘膜或皮肤而入侵。另有报道证实狂犬病毒可通过气溶胶散布传播，动物通过吸入途径使狂犬病毒进入嗅神经末梢从而迅速到达中枢神经系统。因此犬等与人类密切接触是导致人狂犬病发病率居高不下的重要因素。接种狂犬病疫苗是预防和控制狂犬病发生的有效途径，目前广泛采用的原代细胞培养疫苗和传代细胞精制纯化疫苗由于生产成本昂贵，给药次数较多，以及需要联合佐剂等诸多限制因素，不便应用于狂犬病毒储存宿主的免疫接种。因此，在我国，制备质优、价廉、方便、易接种的狂犬病疫苗对于预防控制动物狂犬病十分重要。有效控制狂犬病毒的传染源、切断其传播途径有赖于新一代基因工程疫苗的发展。
[0004]腺病毒载体在疫苗研究以及基因治疗方面的应用已取得一定成果，如重组腺病毒AdHu5表达p53( “今又生”)已在肿瘤基因治疗方面发挥重要作用。在病毒防治的研究中，利用腺病毒载体表达外源基因制备重组基因工程疫苗以及通过结合RNA干扰技术来阻碍病毒依赖宿主的生活周期等均有广泛报道。腺病毒作为载体应用于疫苗的开发具有以下优点:①感染的宿主范围广，能感染分裂和非分裂细胞，导入细胞的效率较高。②遗传背景清楚，致病性低，不整合到染色体中，不会导致插入突变。③外源基因表达水平高，可以容纳约8-10kb的外源基因，能同时表达多个基因。④增殖速度快，易培养，可以产生较高的病毒滴度，适用多种途径免疫。⑤免疫原性强，能够协同外源蛋白引起强烈的特异性细胞免疫和体液免疫。基于上述优点，腺病毒是一种大有潜力值得试验和推广的疫苗载体，在新型基因工程疫苗研究中越来越显示出良好的应用前景。
[0005]由于常用的人血清型腺病毒如AdHu5、AdHu2等普遍感染人，因此人群中60_80%的个体存在相应的中和抗体，将削弱以AdHu5、AdHu2等为载体的疫苗的免疫效果。为克服这个问题，开发稀有人血清型或来自其它动物来源的腺病毒为疫苗或基因治疗载体是有必要的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种狂犬病疫苗及其制备方法。
[0007]在本发明的第一方面，提供一种狂犬病疫苗载体，所述表达载体包括:复制缺陷型重组腺病毒载体，以及连接于该载体酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I之间的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的编码序列；
[0008]其中，所述的复制缺陷型重组腺病毒载体包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中，El的大部份编码序列由连接序列(Linker)替换；所述的连接序列中设置酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I。
[0009]在一个优选例中，所述的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的编码序列如SEQ ID NO:1所
示ο
[0010]在另一优选例中，所述的连接序列如SEQ ID N0:3所示。
[0011]在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0012]在另一优选例中，所述的复制缺陷型重组腺病毒载体制备方法为:
[0013]将黑猩猩型腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中El的大部份编码序列；
[0014]所述的4个片段分别是:
[0015]黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第1-6025位；
[0016]黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第6026-17279位；
[0017]黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第17280-34196位；和
[0018]黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第34197-36519位。
[0019]在另一优选例中，各片段的氨基酸位点计算基于GenBank登录号AC_000011的核苷酸序列。
[0020]在另一优选例中，利用Nde I和SnaB I两个酶切位点切除腺病毒El的大部份编码序列，大小约为3.5kb，将其替换为含有内切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。
[0021]在另一优选例中，所述的骨架载体是PNEB193载体。
[0022]在本发明的另一方面，提供一种制备狂犬病疫苗的方法，所述方法包括:
[0023](I)提供所述的狂犬病疫苗载体；
[0024](2)将(I)的狂犬病疫苗载体转染病毒生产细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的狂犬病疫苗。
[0025]在本发明的另一方面，提供一种狂犬病疫苗，所述疫苗由上面所述的方法制备获得。
[0026]在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中含有所述的狂犬病疫苗。
[0027]在本发明的另一方面，提供一种用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括:前面所述的狂犬病疫苗载体。
[0028]在一个优选例中，所述试剂盒还包括:病毒生产细胞。
[0029]在另一优选例中，所述的病毒生产细胞是HEK293细胞。[0030]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1、新型狂犬病疫苗载体构建策略。
[0032]图2、pUC57-0/Gp载体和腺病毒穿梭载体pAdshuttle_CMV/Gp酶切鉴定。
[0033]A、酶切鉴定。l、lKb DNA marker ;2、Nhe I 和 Xba I 双酶切鉴定 pUC57_0/Gp 载体；
3、Nhe I和Xba I双酶切鉴定pshuttle-CMV载体。
[0034]B、Nhe I 和 Xba I 双酶切鉴定 pAdshuttle-CMV/Gp 载体；I: IKb DNA laddermarker ;2,3、反向克隆；4、正确克隆。
[0035]C、Nhe I 和 EcoR I 双酶切鉴定 pAdshuttle-CMV/Gp 载体。
[0036]图3、重组腺病毒载体pAdC68_Gp和重组病毒基因组酶切鉴定。
[0037]1、IKb DNA ladder marker ；
[0038]2，3，4、Bgl II，BamH I 和 Xho I 酶切 pAdC68_Gp 重组腺病毒基因组。
[0039]5、IKb DNA ladder marker ；
[0040]6，7，8、Bgl II，BamH I 和 Xho I 酶切重组腺病毒质粒 DNA pAdC68_Gp。
[0041]图4、重组腺病毒感染滴度的检测。
[0042]A、重组腺病毒 pAdC68-Gp 以 IO8 和 101Qvps 感染 HEK293 细胞(B卩 293A) (24h)。
[0043]B、重组腺病毒 pAdC68_Gp 以 IO8 和 101Qvps 感染 Huh7 细胞(24h)。
[0044]图5、重组腺病毒遗传稳定性的检测。
[0045]A、重组腺病毒AdC68_Gp基因组第5代和第15代的酶切鉴定。
[0046]1、IKb DNA ladder marker?
[0047]2，3，4、Bgl II，BamH I和Xho I酶切第5代重组腺病毒基因组。
[0048]5、IKb DNA ladder marker?
[0049]6，7，8、Bgl II，BamH I和Xho I酶切第15代重组腺病毒基因组。
[0050]B、第15代重组腺病毒pAdC68-Gp以101Qvps分别感染HEK293和Huh7细胞(24h)。
[0051]图6、血清中狂犬病毒中和抗体效价检测。左:重组腺病毒AdC68_Gp免疫组小鼠中和抗体效价；右:腺病毒空载体AdC68-印t免疫小鼠中和抗体效价。
【具体实施方式】
[0052]本发明人经过深入的研究，通过改进构建方法，基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组的疫苗载体，构建了一种新型狂犬病疫苗载体。所述的疫苗载体可应用于制备可高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
[0053]为解决现有技术的问题，本发明人选择稀有血清型或其他种属来源的腺病毒作为疫苗载体，由于人群一般不存在针对黑猩猩型腺病毒的中和抗体，以黑猩猩型腺病毒为疫苗载体可获得较好的免疫效果。因此，本发明人构建了黑猩猩型腺病毒AdC68为复制缺陷型重组表达载体，经检验该载体具有良好的免疫原性和遗传稳定性。在该AdC68载体的基础上，本发明人进一步制备了新型狂犬病疫苗。该新型疫苗免疫小鼠后，能有效地诱导针对狂犬病毒的中和抗体，对病毒感染产生强大的抵抗力。[0054]因此，本发明提供了一种腺病毒表达载体，所述表达载体包括:复制缺陷型重组腺病毒载体，以及连接于该载体酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I之间的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的编码序列；其中，所述的复制缺陷型重组腺病毒载体包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中，El的大部份编码序列由连接序列(Linker)替换；所述的连接序列中设置酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I。
[0055]针对腺病毒AdC68基因组，本发明人经过细致的序列比对，最终确定了应用酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I作为外源基因的插入位点，从而不会导致在腺病毒表达载体的其它位置造成剪切。
[0056]由于腺病毒的基因组比较大，大约有36kb，使直接克隆重组腺病毒载体成为技术瓶颈。因此，本发明人开发了能通过酶切连接的快速方法直接构建基于黑猩猩型腺病毒AdC68作为疫苗载体，即充分利用腺病毒基因组中存在的某些酶切位点。根据对腺病毒AdC68整个基因组序列的分析，将其分成KE，AK，XA和PX四个片段，然后通过酶切连接的方法再逐步克隆到PNEB193的载体中，最终获得一个复制缺陷型的腺病毒克隆。其中在腺病毒AdC68的PX部分，利用Nde I和SnaB I两个酶切位点删除了与腺病毒复制相关的El部分，大小约为3.5kb，将其替换为含有归位内切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。此方法构建的复制缺陷型腺病毒AdC68经过线性化能够在HEK293细胞中成功包装并扩增出遗传稳定的重组腺病毒。KE，AK, XA和PX四个片段之间可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。
[0057]所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子(如CMV)上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
[0058]本发明还提供了密码子优化的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的编码序列，如SEQ IDNO:1所示，其能够实现高效的表达。
[0059]本发明还提供了一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括:将黑猩猩型腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中El编码序列；所述的连接序列中，设置酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I。
[0060]本发明还提供了一种制备狂犬病疫苗的方法，所述方法包括:提供所述的狂犬病疫苗载体；将该表达载体转染病毒生产细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的狂犬病疫苗。
[0061]获得所述腺病毒表达载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度(TCID5tl)的测定可以根据本领域常规方法进行。因此，本发明还提供了一种狂犬病疫苗，所述疫苗由本发明所述的方法制备获得。
[0062]基于本发明的新改进，本发明还提供了一种用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括所述的狂犬病疫苗载体。
[0063]所述的试剂盒还可包括病毒生产细胞，如HEK293细胞。此外，所述的试剂盒中还可包括说明疫苗制备方法的使用说明书。
[0064]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 [0065]1、材料和方法
[0066]1.1质粒及菌株
[0067]穿梭载体pShuttle-CMV 购自 Clontech Laboratories, Inc。
[0068]野生型腺病毒AdC68 (GenBank 登录号 AC_000011)购于 ATCC。
[0069]pNEBl93 质粒购自 New England Biolabs。
[0070]携带有优化密码子的目的基因Gp (ERA株)的重组质粒PUC57_0/Gp由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0071]感受态菌株Stbl2 购自 Invitrogen。
[0072]腺病毒包装细胞系HEK293 (293A)细胞购自ATCC。
[0073]El缺失的复制缺陷型腺病毒载体pAdC68 (pAdC68-El_deleted)构建方法如下:
[0074](I)质粒 PNEBl93-KE 的构建
[0075]根据pNEB193载体上的多克隆位点和腺病毒AdC68基因组的序列，设计扩增KE片段的引物(表1)，PCR扩增目的产物KE片段。PCR扩增体系总体积为50uL，反应循环参数为:95°C预变性 5min ;94°C变性 Imin ;退火温度 57°C 30s ;72°C延伸 2.2min。EcoR I 和 KpnI双酶切PCR扩增的KE片段，琼脂糖凝胶纯化KE片段，连接至经相同酶切的PNEB193载体，转化入DH5 α感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切和测序鉴定得到ρΝΕΒ193-ΚΕ。
[0076]表1、PCR引物序列
[0077]
扩增片段_引物序歹!J_
KE F: CGGAATTCCCTTAATTAACCATCATCAATAATAT (SEQ ID NO: 5)
R: CACCACCTCCCGGTACCACA (SEQ ID NO: 6)
PX F: GGG1TTAAACCCTTAATTAACCATCTTCAATA.ATATACCTCAAAC(SEQ ID NO: 7)
R: CCGGAATTCCCGTTTCTAGAAACTGACAACCYSEQ ID NO: 8)
Linker F: AGCTACGTAGTTCCGCGCACATTTCCCCGAA(SEQ ID NO: 9)
_R: CGACATATGCGCGCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO: 10)_
[0078]下划线标示限制性内切酶位点。
[0079](2)质粒 ρΝΕΒ193_ΚΕ_ΑΚ 的构建
[0080]Asc I和Kpn I双酶切AdC68基因组，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收AK片段，连接至经相同酶切的PNEB193-KE载体，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切鉴定得到 pNEB193-KE-AK。
[0081](3)质粒 ρΝΕΒ193_ΚΕ-ΑΚ_ΧΑ 的构建
[0082]Xba I和Asc I双酶切AdC68基因组，由于Asc I在腺病毒AdC68存在三个酶切位点，对Asc I进行部分酶切，置于37°C酶切AdC68基因组10s，低熔点凝胶回收酶切的最大的XA片段，连接至经相同酶切的pNEB193-KE-AK载体，酶切鉴定得到pNEB193_KE-AK_XA。
[0083](4)质粒 pNEB193-PX 的构建[0084]根据PNEB193载体上的多克隆位点和腺病毒基因组的序列，设计扩增PX片段的引物(表1)，PCR扩增目的产物PX片段。PCR扩增体系总体积为50uL，反应循环参数为:95°C预变性5min ;94°C变性Imin ;退火温度55°C Imin ;72°C延伸6min。Pme I和Xba I双酶切PCR扩增回收的PX片段，琼脂糖凝胶回收目的产物PX片段，连接至经相同酶切的PNEB193载体，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，其中靠近腺病毒AdC68左端ITR的区域经测序鉴定。Xba I酶切腺病毒AdC68基因组，低熔点琼脂糖凝胶回收获得AdC68中的Xba1-Xba I部分，并替换连接至经Xba I酶切的pNEB193_PX载体中，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，酶切鉴定得到PNEB193-PX。
[0085](5)删除pNEB193-PX质粒中AdC68基因组中El部分
[0086]EcoR I和Mfe I双酶切pShuttle_CMV质粒，依据同尾酶的性质将空载体连接，转化入DH5a感受态细胞中得到pShuttle-EM的质粒。根据pShuttle_EM质粒的序列设计扩增Linker的引物(表1)，PCR扩增Linker产物，PCR扩增体系总体积为50uL，反应循环参数为:95°C预变性5min ;94°C变性Imin ;退火温度55°C Imin ;72°C延伸lmin。SnaB I和Nde I双酶切PCR扩增的Linker片段,琼脂糖凝胶回收Linker产物,连接至经相同酶切的PNEB193-PX载体(通过对AdC68基因组序列分析，利用SnaB I和Nde I两个酶切位点能将其El部分序列删除)，转化入DH5 α感受态细胞，挑取阳性克隆，经酶切鉴定得到pNEB193-PX-Linker。
[0087]Linker的序列插入在AdC68基因组第459-3011位之间，替换El的大部份序列。Linker 的序列如 SEQ ID N0:3。
[0088](6)复制缺陷型腺病毒pAdC68质粒构建
[0089]Xba I和Pme I双酶切pNEB193-PX_Linker质粒DNA，并利用琼脂糖凝胶回收PX-Linker片段，连接至经相同酶切的低熔点琼脂糖凝胶回收的pNEB193_KE-AK_XA载体，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切鉴定得到pAdC68-El-deleted。
[0090]复制缺陷型重组腺病毒载体pAdC68-El-deleted的核苷酸序列如SEQ ID N0:2。
[0091]1.2实验动物
[0092]6-8周龄雌性ICR小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
[0093]1.3主要试剂
[0094]T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司。Bgl II ,BamH 1、Nhe I,Pac I等限制性内切酶购自NEB公司。Lipofectamine2000DNA 转染试剂购自 Invitrogen。
[0095]1.4目的基因的获得
[0096]根据GenBank中狂犬病毒ERA株中Gp编码区的核酸序列，合成经密码子优化后的Gp基因(SEQ ID NO:1)，并在已优化密码子的目的基因的5’端依次接入EcoR I和Nhe I酶切位点，3’端接入Xba I酶切位点(图1)，通过EcoR I和Xba I双酶切将优化后的Gp基因克隆到商品化载体PUC57载体，获重组质粒PUC57-0/Gp。
[0097]1.5重组腺病毒穿梭载体的获得[0098]将PUC57_0/Gp质粒经Nhe I和Xba I双酶切后形成带有粘性末端的目的基因，同时将腺病毒穿梭载体pshuttle-CMV经Nhe I和Xba I双酶切得到线性化的载体，使用T4DNA连接酶对上述产物的粘端进行连接。按常规方法将连接产物转化，在含卡那霉素抗性的琼脂平板上筛选，在LB培养基中37 °C过夜培养，提取质粒DNA。采用酶切、PCR等方法进行鉴定，得到阳性重组质粒，命名为pAdshuttle-CMV/Gp。
[0099]1.6获得重组腺病毒质粒
[0100]质粒pshuttle-CMV/Gp经过P1-Sce I和1-Ceu I双酶切后形成带有粘性末端的目的基因，同时将腺病毒载体pAdC68-El-deleted经过P1-Sce I和1-Ceu I双酶切得到线形化的载体。利用低熔点琼脂糖胶分离目的片段，将含有目的片段和载体的凝胶65°C孵育5分钟，待完全溶解后使用T4DNA连接酶对上述产物的粘端进行连接。在感受态菌Stbl2中按常规方法将连接产物转化，取适量的转化产物涂至含氨苄抗性的琼脂平板上，于30°C培养24h，挑选氨苄抗性克隆，小量提取质粒DNA，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析，并分别进行Bgl I1、BamH 1、Xho I酶切图谱分析。将所得的重组腺病毒质粒菌液扩大培养(I:1000)获得大量高质量的质粒DNA。获得含狂犬病毒基因的重组腺病毒载体命名为pAdC68-Gp。
[0101]1.7制备重组腺病毒
[0102]用限制性内切酶Pac I线性化重组腺病毒质粒pAdC68_Gp，应用脂质体转染的方法将质粒转入HEK293细胞(6孔板)中，37°C孵育6-8天，出现明显的噬斑。待细胞变圆、悬浮后收集细胞，反复冻融三次后取病毒上清感染HEK293细胞(75ml细胞培养瓶)。重复以上步骤直至收集适量病毒(约20-40个150ml细胞培养瓶)，利用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒，测定OD值，加入终浓度为10%的甘油存于-80°C。提取病毒基因组DNA (病毒含量IO12Vps),并进行Bgl I1、BamH 1、Nhe I酶切图谱分析。利用CMV promoter通用引物检测目的片段的核酸序列。纯化后的病毒在HEK293细胞中连续传15代，验证重组载体的遗传稳定性。
[0103]1.8免疫原性分析
[0104]取一定滴度的重组腺病毒经肌注免疫ICR小鼠，3周后检测血清中中和抗体的浓度，中和抗体滴度由武汉生物制品研究所测定。
[0105]实验组:10只ICR小鼠注射IOiciVps重组腺病毒AdC68_Gp ;对照组:10只ICR小鼠注射10lclvps腺病毒空载体AdC68_ept。
[0106]2、实施例
[0107]实施例1、狂犬病毒Gp编码区的克隆
[0108]琼脂糖凝胶电泳显示酶切PUC57-0/Gp与预期大小(bp)相符，如图2 ;由于Nhe I和Xba I为同尾酶,在筛选重组穿梭质粒pAdshuttle-CMV/gp时可能出现反向克隆,首先应用Nhe I和Xba I双酶切鉴定阳性克隆，再利用pAdshuttle-CMV/gp目的片段以外区域的单酶切位点EcoR I再次鉴定，酶切重组腺病毒穿梭载体pAdshuttle-CMV/Gp，结果与预期一致。测序结果表明，得到的核酸序列与目的片段优化密码子后的核酸序列相同。
[0109] 实施例2、重组腺病毒的鉴定
[0110]P1-Sce I 和 1-Ceu I 双酶切 pAdshuttle-CMV/gp 和 pAdC68，用 T4DNA 连接酶对上述产物进行连接。挑选氨苄抗性的克隆后，酶切鉴定质粒pAdC68-Gp，如图3，与预期大小一致。测序结果表明，得到的核酸序列与目的片段优化密码子后的核酸序列相同。
[0111]大量制备重组腺病毒质粒DNA，将Pac I酶切后的重组质粒转染HEK293细胞。6-8天后出现明显的细胞病变。病变初期细胞中出现噬斑，逐渐变大，后期呈拉网状态，最终细胞全部漂浮。将已感染病毒的20瓶150ml的细胞收集起来，反复冻融的混合物用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒，测定重组腺病毒OD值为8.9X 1012vpS/ml。提取病毒基因组，酶切鉴定，片段大小与预期一致。
[0112]实施例3、重组腺病毒感染滴度的测定及遗传稳定性分析
[0113]用不同数量的病毒感染HEK293细胞和肝癌细胞系Huh7，如图4。感染24h后，在HEK293细胞中出现噬斑(病毒量为IO8Vps);而感染后的Huh7细胞(病毒量为108vps)与对照组无明显差别，当病毒量达到IOltVps, Huh7细胞中也出现噬斑。将纯化后的病毒在HEK293细胞中连续传15代，小量收集病毒并且纯化，酶切分别鉴定第5代和第15代病毒的基因组，结果证明重组病毒没有突变，并保持原代病毒的感染能力，如图5。
[0114]实施例4、血清中中和抗体滴度的测定
[0115]将重组腺病毒载体AdC68_Gp免疫ICR小鼠，3周后测定血清中的中和抗体效价，如图6。免疫组小鼠血清中中和抗体效价(平均值38.3IU/ml)明显高于对照组，该重组黑猩猩型腺病毒AdC68-Gp能够有效地诱导高效价中和抗体。
[0116]综上，本发明人已经完成新型重组狂犬病疫苗载体的构建、遗传稳定性的检测以及免疫原性的监测，结果表明新型基于腺病毒载体AdC68的狂犬病疫苗在小鼠体内能诱导出高滴度的特异性中和抗体，远超出WHO指定的保护性效果的标准。
[0117]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种狂犬病疫苗载体，其特征在于，所述表达载体包括:复制缺陷型重组腺病毒载体，以及连接于该载体酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I之间的狂犬病毒糖蛋白抗原的编码序列； 其中，所述的复制缺陷型重组腺病毒载体包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中，El的大部份编码序列由连接序列替换；所述的连接序列中设置酶切位点1-CeuI 和 P1-Sce I。
2.如权利要求1所述的狂犬病疫苗载体，其特征在于，所述的狂犬病毒糖蛋白抗原的编码序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的狂犬病疫苗载体，其特征在于，所述的连接序列如SEQID NO: 3所示。
4.如权利要求1所述的狂犬病疫苗载体，其特征在于，所述的腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
5.如权利要求1所述的狂犬病疫苗载体，其特征在于，所述的复制缺陷型重组腺病毒载体制备方法为: 将黑猩猩型腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中El的大部份编码序列； 所述的4个片段分别是: 黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第1-6025位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第6026-17279位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第17280-34196位；和 黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第34197-36519位。
6.一种制备狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供权利要求1-5任一项所述的狂犬病疫苗载体； (2)将(I)的狂犬病疫苗载体转染病毒生产细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的狂犬病疫苗。
7.—种狂犬病疫苗，其特征在于，所述疫苗由权利要求6所述的方法制备获得。
8.一种药盒，其特征在于，所述的药盒中含有权利要求7所述的狂犬病疫苗。
9.一种用于制备疫苗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: 权利要求1-5任一项所述的狂犬病疫苗载体。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括:病毒生产细胞。
【文档编号】A61K39/205GK103468743SQ201310362921
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】周东明, 迟喻丹, 邓飞, 蓝柯 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所, 成都远睿生物技术有限公司