大熊猫白细胞介素7基因il-7免疫佐剂的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种大熊猫白细胞介素7基因IL-7免疫佐剂的构建方法，包括以下步骤：从大熊猫外周血中分离出淋巴细胞，通过刀豆蛋白A(ConA)刺激培养后，首次PCR扩增得到大熊猫白细胞介素7基因，并克隆到真核表达载体pCI-neo，构建了真核表达质粒pCI-IL-7，其表达的IL-7作为疫苗佐剂能显著增强乙型脑炎病毒(JEV)核酸疫苗诱导的免疫应答，特别是体液免疫应答，能提高乙型脑炎病毒疫苗以及其他常规疫苗的免疫效果，控制疾病的发生与流行，保护大熊猫的健康。
【专利说明】大熊猫白细胞介素7基因IL-7免疫佐剂的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及的是一种大熊猫白细胞介素7(IL-7)基因IL-7免疫佐剂的构建方法。
【背景技术】
[0002]IL-7又名前B细胞生长因子、淋巴细胞生成素，是骨髓基质细胞和胸腺基质细胞产生的细胞因子，能促进淋巴细胞早期增值和分化和诱导巨噬细胞增值。在动物的脾脏、胸腺、骨髓和肾脏中都能检测到IL-7。
[0003]IL-7是B细胞生长和极早期B细胞生存、分化、增殖因子。IL_7也能在某些因素(如:辐射或免疫抑制剂)所致的应激加快B细胞的恢复。IL-7能诱导不成熟的T细胞增殖和分化，诱导胸腺细胞中⑶4+、⑶8+、⑶3+、⑶2+、SCA-1+的细胞优势扩增。IL-7也能引起外周⑶4+或⑶8+T细胞增殖，其中⑶45R0+的记忆T细胞增殖更明显。IL-7还能诱导外周T细胞分泌IL-2，表达IL-2受体(IL-2R)和转铁蛋白受体，促进细胞分泌白细胞介素(L1-4)和粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)。
[0004]IL-7不仅对T、B淋巴细胞内环境的稳定性起重要作用，同时也对其他细胞谱系(如抗原递呈细胞)的生存和分化起重要作用。L1-7还对巨噬细胞起作用，作用包括:直接诱导巨噬细胞表达IL-18和巨噬细胞炎症蛋白1β ;诱导巨噬细胞产生IL-6、IL-1a、IL-1 β和TNF-a ;增强单核细胞在体外溶解靶细胞的能力。
[0005]IL-7的生物学活性决定了它的很多用途。IL-7可作为疫苗免疫佐剂，促进B细胞生长和分化，诱导不成熟的T细胞增殖和分化，增强疫苗对机体的刺激效应，提高保护力。IL-7还可作为免疫调节剂，诱导TNF- a及TNF- β分泌，抑制IL-4及IL-10合成，从而调节Thl/Th2 平衡。
[0006]IL-7在抗肿瘤免疫治疗有潜在的价值。目前虽未见体外直接应用IL-7抑制肿瘤细胞增殖的报道，但IL-7体内应用则有一定的抗肿瘤活性。还有研究证明中国HIV/AIDS患者IL-7水平的升高，加速了艾滋病疾病进展，血浆IL-7含量可作为判断HIV疾病进展的一个标志。
[0007]随着基因克隆技术和生物信息学软件使用的成熟和完善，基因克隆不再是难题。通过IL-7基因的克隆及高效表达，得到大量纯化重组IL-7已经很容易成为现实，这将一步推动对IL-7生物活性的研究。目前对淋巴细胞生成的最初阶段尚知之甚少，可以通过对多种动物IL-7基因进行克隆和比较分析，加深对其的认识。细胞因子作为一种新型的免疫佐剂，将会为动物疾病的免疫预防和免疫治疗提供广阔的应用前景。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的 不足提供一种大熊猫白细胞介素7基因IL-7免疫佐剂的构建方法。
[0009]本发明的技术方案如下:[0010]一种大熊猫白细胞介素7基因IL-7免疫佐剂的构建方法，包括以下步骤:
[0011] Al IL-7基因的PCR克隆
[0012]All IL-7基因的引物设计及合成
[0013]根据NCBI上公布的预测的熊猫IL-7基因序列，通过在线信号肽预测软件找出分析出其信号肽，设计一对引物，扩增成熟的IL-7基因；
[0014]11:GAATTCACCATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGACG ；
[0015]12: GTCGACTTAATGCTCTTTAGAGCCCCTC ；
[0016]A12大熊猫外周血淋巴细胞RNA的提取；
[0017]A121外周血淋巴细胞的分离和培养；
[0018]通过下列方法进行刺激培养，增加细胞因子的转录翻译:
[0019](I)采大熊猫静脉血2ml加入肝素抗凝管；
[0020](2)轻轻摇动抗凝管，使血液与抗凝剂混匀，5min后加入2ml Hank’ s液，手动轻轻摇匀；
[0021](3)用毛细吸管吸取稀释后的抗凝血，全部沿管壁缓慢加至另一含4ml淋巴细胞分离液的试管液面上，注意保持两种液体界面清晰；
[0022](4)将试管平衡后置水平式离心机，40C，2000rpm离心IOmin ；
[0023](5)用毛细吸管仔细吸取血浆与分离液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内；
[0024](6)加入Hank’s液5ml,手动旋转试管使液体混匀，2000rpm离心IOmin,弃上清；
[0025](7)用 5ml Hank，s 重悬，2000rpm 离心 IOmin,弃上清；
[0026](8)用5ml含10%血清的1640营养液重悬淋巴细胞后转移至细胞瓶中，置370C CO2培养箱培养，半小时后加入刀豆蛋白conA，使其终浓度为7ug/ml ；
[0027](9)置37 °C CO2培养箱悬浮培养72小时；
[0028]A122 RNA 的提取；
[0029]A13 IL-7基因的扩增；
[0030]A2 pMD-1L-7 质粒的构建；
[0031]A21连接和转化；
[0032]取pMD19-T载体和回收的IL_7的cDNA，于16°C连接过夜，然后将连接产物转化到DH5a ；
[0033]A22pMD-1L-7重组质粒的鉴定；
[0034]将酶切鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测列，将测序正确的质粒命名为pMD-1L-7 ；
[0035]A3 pC1-1L-7真核表达质粒的构建；
[0036]A31 IL-7基因的酶切回收；
[0037]用EcoR I和Sal I对pMD_IL_7进行双酶切；酶切产物经I %的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的基因；
[0038]A32 pC1-neo载体的酶切回收
[0039]用EcoR I和SaL I对pC1-neo进行双酶切；酶切产物通过I %琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收5400bp左右的载体基因；
[0040]A33连接与转化[0041]取酶切回收的pC1-neo载体片段和酶切回收的IL-7目的基因，于16°C连接过夜，然后通过热激法转化到DH5 α ；
[0042]Α34重组质粒的鉴定
[0043]将转化好的菌扩大培养后，小量提取质粒，用EcoR I和Sal I对重组质粒进行双酶切鉴定；用1%的琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下观察电泳图；将酶切鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pC1-1L-7。
[0044]本发明从大熊猫外周血中分离出淋巴细胞，通过刀豆蛋白A(ConA)刺激培养后，首次PCR扩增得到大熊猫白细胞介素7基因，并克隆到真核表达载体pC1-neo，构建了真核表达质粒PC1-1L-7，其表达的IL-7作为疫苗佐剂能显著增强乙型脑炎病毒(JEV)核酸疫苗诱导的免疫应答，特别是体液免疫应答，能提高乙型脑炎病毒疫苗以及其他常规疫苗的免疫效果，控制疾病的发生与流行，保护大熊猫的健康。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1为IL-7基因的扩增；1:IL-7扩增产物，M:DL2000 ；
[0046]图2 为 pMD-1L-7 的酶切鉴定；1:pMD-1L_7 酶切产物，M:DL2000 ；
[0047]图3为pC1-1L-7的双酶切鉴定；1:pC1-1L_7酶切产物，M:DL2000 ；
[0048]图4为小鼠JEV抗体的标准曲线；
[0049]图5为小鼠IL-4抗体的标准曲线；
[0050]图6为小鼠IFN- Y抗体的标准曲线；
【具体实施方式】
[0051]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0052]1.1 pC1-1L-7免疫佐剂的构建
[0053]1.1.1 IL-7 基因的 PCR 克隆
[0054]1.1.1.1 IL-7基因的引物设计及合成
[0055]根据NCBI上公布的预测的熊猫IL-7基因序列(序列编号为ΧΜ_002924920.I)，通过在线信号肽预测软件找出分析出其信号肽，设计一对引物，扩增成熟的IL-7基因。
[0056]11:GAATTCACCATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGACG (划线部分是 EcoR I 酶切位点，加粗部分是Kozak序列)
[0057]12:GTCGACTTAATGCTCTTTAGAGCCCCTC (划线部分是 Sal I 酶切位点)
[0058]引物送由宝生物工程(大连)有限公司合成，预计扩增片段约400bp。
[0059]1.1.1.2大熊猫外周血淋巴细胞RNA的提取
[0060]1.1.1.2.1外周血淋巴细胞的分离和培养
[0061]细胞因子在正常外周血的淋巴细胞中分泌量很少，即mRNA的含量较低，故通过下列方法进行刺激培养，增加细胞因子的转录翻译:
[0062](I)采大熊猫静脉血2ml加入肝素抗凝管；
[0063](2)轻轻摇动抗凝管，使血液与抗凝剂混匀(若出现凝集则不能继续实验)，5min后加入2ml Hank’ s液,手动轻轻摇匀；
[0064](3)用毛细吸管吸取稀释后的抗凝血，全部沿管壁缓慢加至另一含4ml淋巴细胞分离液的试管液面上，注意保持两种液体界面清晰；
[0065](4)将试管平衡后置水平式离心机，40C，2000rpm离心IOmin ；
[0066](5)用毛细吸管仔细吸取血浆与分离液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内；
[0067](6)加入Hank’s液5ml,手动旋转试管使液体混匀，2000rpm离心IOmin,弃上清；
[0068](7)用 5ml Hank，s 重悬，2000rpm 离心 IOmin,弃上清； [0069](8)用5ml含10%血清的1640营养液重悬淋巴细胞后转移至细胞瓶中，置370C CO2培养箱培养，半小时后加入刀豆蛋白(conA)，使其终浓度为7ug/ml ；
[0070](9)置37°C CO2培养箱悬浮培养72小时。
[0071]1.1.1.2.2 RNA 的提取
[0072]吹打混匀悬浮培养的细胞瓶中的液体，将其全部吸入灭菌的离心管中，2000rpm离心IOmin后用适当的无RNA酶水重悬，取200 μ L至EP管中后加入200 μ L裂解液，摇晃混匀，静置约IOmin ;加入350 μ L Blue Buffer，轻轻翻转混匀3-4次，70°C水浴2min, 12000转，4摄氏度离心IOmin ;将裂解液上清转移至新的EP管中；加入200 μ L95%乙醇颠倒混匀后，全部吸取到吸附柱中，静置lmin，12000rpm，4°C离心Imin ;加入600 μ L洗涤液，12000转，4摄氏度离心Imin ;按说明书配制DNA酶I,每个吸附柱中加入50 μ L配制好的DNA酶I，室温作用20min ;加入200 μ L终止液，12000转，4摄氏度离心Imin ;加入600 μ L洗涤液，12000转，4摄氏度离心Imin ;加入250 μ L洗涤液，12000转，4摄氏度离心Imin ;倒去收集管中液体后空载离心2min ;加入100 μ L无核酸酶水后静置几分钟后12000转，4摄氏度离心Imin即得到mRNA模板。以上操作均应在超净工作台中无风条件下进行。
[0073]1.1.1.3 IL-7 基因的扩增
[0074]1.1.1.3.1 mRNA 的反转录
[0075]用上一步骤中所得mRNA为模板，加入反转录试剂，按表1所示。将PCR管放入PCR仪，经37°C反转录15min ;85。C灭活5s。
[0076]表1反转录体系
[0077]
【权利要求】
1.一种大熊猫白细胞介素7基因IL-7免疫佐剂的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: Al IL-7基因的PCR克隆 All IL-7基因的引物设计及合成 根据NCBI上公布的预测的熊猫IL-7基因序列，通过在线信号肽预测软件找出分析出其信号肽，设计一对引物，扩增成熟的IL-7基因；
11:GAATTCACCATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGACG ；
12:GTCGACTTAATGCTCTTTAGAGCCCCTC ； A12大熊猫外周血淋巴细胞RNA的提取； A121外周血淋巴细胞的分离和培养； 通过下列方法进行刺激培养，增加细胞因子的转录翻译: (1)采大熊猫静脉血2ml加入肝素抗凝管；(2)轻轻摇动抗凝管，使血液与抗凝剂混匀，5min后加入2mlHank’s液，手动轻轻摇匀； (3)用毛细吸管吸取稀 释后的抗凝血，全部沿管壁缓慢加至另一含4ml淋巴细胞分离液的试管液面上，注意保持两种液体界面清晰； (4)将试管平衡后置水平式离心机，4°C，2000rpm离心IOmin； (5)用毛细吸管仔细吸取血浆与分离液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内；(6)加入Hank’s液5ml,手动旋转试管使液体混匀，2000rpm离心IOmin,弃上清； (7)用5ml Hank，s 重悬，2000rpm 离心 IOmin,弃上清； (8)用5ml含10%血清的1640营养液重悬淋巴细胞后转移至细胞瓶中，置37°CCO2培养箱培养，半小时后加入刀豆蛋白conA,使其终浓度为7ug/ml ； (9)置370C CO2培养箱悬浮培养72小时； A122 RNA的提取； A13 IL-7基因的扩增； A2 pMD-1L-7质粒的构建； A21连接和转化； 取PMD19-T载体和回收的IL-7的cDNA，于16 °C连接过夜，然后将连接产物转化到DH5a ； A22 pMD-1L-7重组质粒的鉴定； 将酶切鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测列，将测序正确的质粒命名为pMD-1L-7 ； A3 pC1-1L-7真核表达质粒的构建； A31 IL-7基因的酶切回收； 用EcoR I和Sal I对pMD_IL_7进行双酶切；酶切产物经I %的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的基因； A32 pC1-neo载体的酶切回收 用EcoR I和Sal I对pC1-neo进行双酶切；酶切产物通过I %琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收5400bp左右的载体基因；A33连接与转化 取酶切回收的pC1-neo载体片段和酶切回收的IL-7目的基因，于16°C连接过夜，然后通过热激法转化到DH5a ； A34重组质粒的鉴定 将转化好的菌扩大培养后，小量提取质粒，用EcoR I和Sal I对重组质粒进行双酶切鉴定；用1%的琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下观察电泳图；将酶切鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限 公司测序，将测序正确的质粒命名为pC1-1L-7。
【文档编号】A61P31/14GK103589746SQ201310362836
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年8月16日 优先权日:2013年8月16日
【发明者】李德生, 朱玲, 张和民, 王承东, 古锋, 刘骁 申请人:四川卧龙国家级自然保护区管理局, 四川农业大学