一种重组大熊猫il-2免疫佐剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法，本发明的重组大熊猫IL-2免疫佐剂一种效果显著且又提取简便，且能直接应用于生产及临床应用的重组大熊猫IL-2(gpIL-2)免疫佐剂，提高犬瘟热疫苗以及其他常规疫苗的免疫效果，控制疾病的发生与流行，保护大熊猫的健康。犬瘟热素有“毁灭性传染病”之称，已成为威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病，严重影响了大熊猫的健康发展。本发明重组大熊猫IL-2(gpIL-2)免疫佐剂能显著增强犬瘟热疫苗免疫效果，对犬瘟热的防治具有重要意义。
【专利说明】一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及的是一种重组大熊猫IL-2(gpIL-2)免疫佐剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]大熊猫被誉为中国的“国宝”，是世界级珍稀野生动物，然而它却濒临灭绝，除了人为原因对大熊猫栖息地的破坏以外，疾病死亡成为当前大熊猫种群濒危的关键原因之一。在大熊猫所患的40多种疾病中，犬瘟热是威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病。疫苗免疫目前是预防控制CDV的主要措施，但当前使用的疫苗并不十分理想，存在免疫效率低与安全性差两大难题。因此，在安全剂量疫苗接种下提高大熊猫机体的免疫力，成为当今疫苗开发研究的焦点。细胞因子是由免疫效应细胞和其他相关细胞产生，具有多种生物学活性，在免疫应答的产生和调节中具有重要作用。
[0003]白细胞介素2(IL_2)是白细胞介素家族中的重要成员，其被作为免疫佐剂增强疫苗免疫效果的报道屡见不鲜。
[0004]IL-2是T细胞生长因子，它最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖(从GO期进入S期)和分化。T细胞受多种刺激后能分泌IL-2，IL-2又作用于T细胞自身，诱导自身增殖、分化和发挥功能，这种作用称为“自分泌作用”。IL-2能增强T细胞的杀伤活性，在体外与IL-4、IL-5和IL-6 —起共同诱导细胞毒性T细胞(TC)的产生，并使其活性大大增强，延长其生长期；在体内IL-2也能增强抗原诱导的TC活性，甚至可以辅助抗原和半抗原直接在裸鼠体内诱导产生TC。由IL-2诱导产生的TC输入体内后可产生明显抗肿瘤作用。
[0005]IL-2能诱导自然杀伤 细胞(NK细胞)增殖，增强NK细胞的活性，诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)，并刺激它们产生细胞因子。NK细胞表面有IL-2R链，IL-2刺激NK细胞活化和增殖，并能促进NK细胞分泌IFN- Y，增加其表达IL-2R亚基等。高浓度的IL-2在体外还能诱导NK细胞来源、T细胞来源的LAK细胞增殖并促进其活性。
[0006]IL-2对B细胞的生长及分化均有一定的促进作用。能促使B细胞表达高亲和力的IL-2R，其中α链由B细胞促分裂原诱导表达，而β链由IL_4或IL_6诱导表达。IL-2除了支持B细胞生长外，还能促进免疫球蛋白(IgM/IgG)的分泌，诱导J链合成从而加速IgM向着分泌IgG2转换。IL-2能增强激活(感染、自身免疫病、肿瘤等)B细胞以及白血病细胞所产生的IL-2受体(IL-2R)的表达，并刺激其增殖和免疫球蛋白的生成:此外，IL-2还能刺激少突状神经胶质细胞产生髓碱性蛋白，对该种细胞的增殖则呈双向性调节。
[0007]在人和动物的细胞因子中，IL-2是最先搞清楚分子结构、受体组成和生物学功能的细胞因子，IL-2研究一直居于细胞因子的最前沿，其应用也是研究得最广泛的。在动物医学上，重组IL-2已在一些动物疾病的免疫预防、免疫治疗和构建新一代基因工程苗等方面显示出广阔的应用前景。
[0008]IL-2因能增强机体的免疫水平，提高机体的抗病能力，因而用于细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的免疫治疗。此外，IL-2还可影响药物的代谢，使药物的代谢时间延长，作用时间增加，从而提高药物疗效。是第一个为美国食品药物管理局(FDA)认可用于治疗癌症的细胞因子药物。张光勤用IL-2结合抗生素等药物治疗山羊痘病与链球菌混合感染，结果表明重组白细胞介素2是治疗山羊痘与链球菌混合感染的有效药物，可显著提高山羊痘与链球菌混合感染的治愈率，并缩短其疗程。秦翠丽等通过用白细胞介素-2对40例大肠杆菌病兔的治疗试验，治愈38只，死亡2只，治愈率为95%，表明白细胞介素-2对兔大肠杆菌病有显著疗效。李祥瑞将重组IL-2用于猪链球菌病的治疗，取得了很好的效果。在寄生虫方面,Lillehoj等报道,在E.1meriatenella或E.acervulina感染鸡的前一天或感染后的第一天，用ConA活化鸡淋巴细胞产生的细胞因子处理鸡，可以明显降低球虫感染鸡卵囊的排出量。
【发明内容】
[0009]本发明旨在提供一种效果显著且又提取简便，且能直接应用于生产及临床应用的重组大熊猫IL-2(gpIL-2)免疫佐剂，提高犬瘟热疫苗以及其他常规疫苗的免疫效果，控制疾病的发生与流行，保护大熊猫的健康。
[0010]本发明的技术方案如下:
[0011]一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤:
[0012]Al、大熊猫IL-2全基因克隆；
[0013]All大熊猫外周血淋巴细胞体外培养；
[0014]无菌条件下采取健康大熊猫抗凝血2ml，置于EDTA_Na2真空管中，然后往里加入等量D-Hanks液稀释；缓慢加入4ml淋巴细胞分离液于稀释后的大熊猫外周血中，2000r/min离心20min ;小心将白细胞移于另一试管,加等量RPMI1640液,2000r/min离心15min,去上清，沉淀物再加入4mlRPM11640液，洗涤2次，去`上清；沉淀淋巴细胞用含10 μ g/mL ConA, 10%小牛血清、100 μ g/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素的RPMI1640液悬浮，取10 μ L细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5 X IO6个/mL，分装于细胞培养瓶中，CO2培养箱中37°C培养24h ；
[0015]A12 总 RNA 提取；
[0016]A13cDNA 的合成；
[0017]以上步抽提的总RNA为模板,按照Prime Script? RT reagent kit反转录试剂盒的操作步骤进行反转录；
[0018]A14引物的设计与合成；
[0019]根据GenBank中已报道的大熊猫IL_2cDNA序列,运用引物设计软件01igo6.0设
计两对扩增IL-2全基因的引物，具体序列如下表所示:
[0020]
引物名称引物序列
Pl GAATTCATGTACAAAATGCAACTCT
[0021]
IL-2 P2 GTCGACTTAAGTCAGTGTTGAGAAGAT[0022]A15目的基因的PCR扩增；
[0023]以大熊猫基因组cDNA为模板，以IL-2P1/P2为引物进行PCR扩增；反应条件为:95°C预变性5min ;95°C变性40s，58°C退火40s，72°C复性50s，该步骤进行30个循环；72°C延伸IOmin ;于10°C保存；
[0024]A16目的基因PCR产物的TA克隆；
[0025]A161目的片段的回收；
[0026]A162目的片段与克隆载体连接；
[0027]将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接，16°C连接过夜；
[0028]A163DH5 α感受态细胞的制备；
[0029]Α164连接产物的转化；
[0030]Α17重组质粒的初步鉴定；
[0031]Α2、大熊猫白介素2的原核表达、多克隆抗体的制备；
[0032]Α21引物设计与合成；
[0033]根据大熊猫IL-2基因测序结果，运用01igo7.0设计一对引物:IL_2P1/P2 ;扩增编码IL-2成熟肽的cDNA碱基序列；
[0034]
【权利要求】
1.一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: Al、大熊猫IL-2全基因克隆； All大熊猫外周血淋巴细胞体外培养； 无菌条件下采取健康大熊猫抗凝血2ml，置于EDTA-Na2真空管中，然后往里加入等量D-Hanks液稀释；缓慢加入4ml淋巴细胞分离液于稀释后的大熊猫外周血中，2000r/min离心20min ;小心将白细胞移于另一试管，加等量RPMI1640液,2000r/min离心15min,去上清，沉淀物再加入4mlRPM11640液，洗涤2次，去上清；沉淀淋巴细胞用含10 μ g/mL ConA,10 %小牛血清、100 μ g/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素的RPMI1640液悬浮，取10 μ L细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5X IO6个/mL，分装于细胞培养瓶中，CO2培养箱中37°C培养24h ； A12总RNA提取； A13cDNA的合成； 以上步抽提的总RNA为模板,按照Prime Script? RT reagent kit反转录试剂盒的操作步骤进行反转录； A14引物的设计与合成； 根据GenBank中已报道的大熊猫IL_2cDNA序列，运用引物设计软件01igo6.0设计两对扩增IL-2全基因的引物，具体序列如下表所示: 引物名称引物序列
Pl GAATTC ATGTACAA AATGCAACTCT
IL-2 P2 GTCGACTTA AGTCAGTGTTGAGAAGAT A15目的基因的PCR扩增； 以大熊猫基因组cDNA为模板，以IL-2P1/P2为引物进行PCR扩增；反应条件为:95°C预变性5min ;95°C变性40s，58°C退火40s，72°C复性50s，该步骤进行30个循环；72°C延伸IOmin ;于 10°C 保存； A16目的基因PCR产物的TA克隆； A161目的片段的回收； A162目的片段与克隆载体连接； 将上步回收的产物与PMD18-T Simple Vector进行连接，16°C连接过夜； A163DH5 α感受态细胞的制备； Α164连接产物的转化； Α17重组质粒的初步鉴定； Α2、大熊猫白介素2的原核表达、多克隆抗体的制备； Α21引物设计与合成； 根据大熊猫IL-2基因测序结果，运用01igo7.0设计一对引物:IL-2P1/P2 ;扩增编码IL-2成熟肽的cDNA碱基序列；
【文档编号】A61K39/39GK103509815SQ201310362812
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月16日 优先权日:2013年8月16日
【发明者】李德生, 朱玲, 张和民, 王承东, 易悦, 刘骁 申请人:四川卧龙国家级自然保护区管理局, 四川农业大学