一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料及其制备方法，该植入材料为表面修饰有壳聚糖、甲氨蝶呤、肝素钠、多聚赖氨酸和多巴胺的医用纯钛片。本发明利用多巴胺作为桥梁将多聚赖氨酸和肝素钠颗料结合到金属钛表面，肝素一方面作为良好的抗凝剂，提高材料和血液间的生物相容性，另一方面通过静电作用与具有抗菌抗肿瘤作用的壳聚糖和甲氨蝶呤结合。本发明巧妙运用了各药物的生理生化特性，在钛表面形成有序、均一、生物相容性高的抗菌抗肿瘤涂层，所制备的植入材料具有良好的抗菌抗肿瘤活性，不仅有效防止细菌的粘附和繁殖，还能有效防止癌症的复发和转移。
【专利说明】一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料领域，涉及一种骨科植入材料及其制备方法，特别涉及一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料及其制备方法。 【背景技术】
[0002]传统的骨与软组织肿瘤治疗方法是对包括正常组织在内的肿瘤进行广泛切除，通过瘤体灭活再植入及各种人工假体置换如内腔置管术、关节置换及各种生物骨移植等方法进行保肢治疗，且在骨肿瘤手术过程中，由于肿瘤所在部位的特殊性如关节、脊柱部位，常粘连大量血管、神经，会导致整个手术过程中耗时较长，易引发感染。目前，为避免植入初期所造成的感染，多采用药物控制和后期创口消毒的方法，该方法复杂繁琐，持续时间长，并且在切除肿瘤后，常会有局部复发和全身转移。
[0003]常用的骨科植入材料有纯钛、钛合金、不锈钢等金属材料，以及可降解的聚乳酸、自体骨、异体骨、异种骨等，但其材料表面特性尚无法满足抗肿瘤和抗菌要求。纯钛材料具有比重轻、弹性模量和抗张强度与骨接近，耐蚀性和生物相容性等优越性，在保持钛材料本身所具有的优点上，增加自主装膜进行表面改性，使其促进正常骨细胞粘附，减少伤口愈合时间，同时载有抗菌抗肿瘤药物，降低手术中感染风险，杀死残留癌细胞，减少病人的痛苦。为肿瘤切除的内植入物提供一种新的材料。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料。
[0005]本发明的另一目的是提供一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料，特别的，该骨科植入材料由金属钛和具有抗菌抗肿瘤性能的修饰层组成。
[0007]进一步的，抗菌抗肿瘤性能的修饰层包括壳聚糖、甲氨蝶呤、肝素钠、多聚赖氨酸和多巴胺。
[0008]一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，包括以下步骤:
1)将医用纯钛片表面抛光；
2)将抛光后的纯钛与多巴胺溶液在20~30°C下反应10~14h，使多巴胺结合到纯钛片表面上，然后用PBS缓冲液将结合有多巴胺的纯钛片洗涤干净，液氮吹干，重复此过程
2~4次，所获材料标记为DM-Ti ；
3)在超声条件下，将肝素钠溶液逐滴加入多聚赖氨酸溶液中，形成多聚赖氨酸-肝素钠颗粒的悬浊液，再将DM-Ti放入该悬浊液反应10~14h，使钛片上的多巴胺与赖氨酸反应完全，再用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，所获材料标记为DM-H印-Ti ；
4)将甲氨蝶呤溶液加入壳聚糖溶液，制成混合液，将DM-Hep-Ti置于混合液中反应10~14h，使带负电的肝素和带正电的壳聚糖和甲氨蝶呤结合完全，再用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，即可，所获材料标记为DM-Hep-CH-Ti。
[0009]进一步的，步骤I)中所述的医用纯钛片表面抛光的方法，先用120目砂纸抛光，再依次用乙醇、丙酮分别超声洗涤25~35min，然后经HNO3和HF的混溶液抛光25~35min，洗涤干净，烘干。
[0010]进一步的，所述的HNO3和HF的混合液，其中HF和HNO3浓度独立为11~14mg/mL。
[0011]进一步的，步骤2)中所述的多巴胺溶液，其浓度为0.1~0.3mg/mL，溶剂为ρΗ8.3 ~8.7 的 Tris-HCl0
[0012]进一步的，步骤3)中所述的肝素钠溶液，其浓度为4~6mg/mL，溶剂为PBS缓冲液。
[0013]进一步的，步骤3)中所述的多聚赖氨酸溶液，其浓度为0.4~0.6mg/mL，溶剂为PBS缓冲液。
[0014]进一步的，步骤4)中所述的甲氨蝶呤溶液，其浓度为58~62Pg/mL，溶剂为ρΗ5.5~5.7的MES缓冲液。
[0015]进一步的，步骤4)中所述的壳聚糖溶液，其浓度为0.8~L2mg/mL，溶剂为ρΗ5.5~5.7的MES缓冲液。
[0016]本发明的有益效果是 :
本发明利用壳聚糖的正电作用杀死细菌，防止细菌的粘附和繁殖，避免了抗生素的使用，同时壳聚糖具有促成骨等作用，适合在骨科材料中使用。壳聚糖包裹有甲胺蝶呤，能在植入后将其释放，用于杀死肿瘤组织周围未清除干净的癌细胞，在骨愈合的同时可防止癌症的复发和转移。
[0017]在本发明中，多巴胺(Dopamine, DM)是一种生物体内的神经传导物质，其发生自聚的同时，部分儿茶酚基团可与金属或金属氧化物形成配位结合，可在钛金属表面形成均一、完整的多巴胺层；结合到钛表面的多巴胺可继续与多聚赖氨酸反应，同时多聚赖氨酸和肝素在溶液中可形成稳定的静电结合体，肝素具有良好的抗凝作用，可提高材料和血液间的生物相容性；且肝素带强负电荷，而壳聚糖和甲氨蝶呤均带一定的正电荷，经过静电作用可形成稳定的结合体；根据上述各药物的生理生化特性，可在钛表面形成了有序、均一、生物相容性高的抗菌抗肿瘤涂层。
[0018]本发明中所使用的药物均经过临床批准，且所使用缓冲溶液及制剂温和，安全可靠，且制备流程简单易行。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是不同材料的水接触角，*ρ〈0.05，#ρ〈0.01 ；
图2是不同材料的抑菌圈图；
图3是不同材料对骨肉瘤细胞MG63增殖的影响；
图4是骨肉瘤细胞MG63在不同材料表面的细胞形态。
【具体实施方式】
[0020]一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，包括以下步骤:
O医用纯钛片表面经砂纸抛光后，依次用乙醇、丙酮分别超声洗涤25~35min，然后经HNO3和HF的混合液抛光25~35min，洗涤干净，烘干；
2)抛光后的纯钛与多巴胺溶液在20~30°C下反应10~14h，使多巴胺结合到纯钛片表面上，然后用PBS缓冲液将结合有多巴胺的纯钛片洗涤干净，液氮吹干，重复此过程2~4次，所获材料标记为DM-Ti ；
3)在超声条件下，将肝素钠溶液逐滴加入等体积的多聚赖氨酸溶液中，形成多聚赖氨酸-肝素钠颗粒的悬浊液，再将DM-Ti放入该悬浊液反应10~14h，使钛片上的多巴胺与赖氨酸反应完全，再用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，所获材料标记为DM-Hep-Ti ；
4)将甲氨蝶呤溶液加入等体积的壳聚糖溶液，制成混合液，将DM-Hep-Ti置于混合液中反应10~14h，使带负电的肝素和带正电的壳聚糖和甲氨蝶呤结合完全，再用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，即可，所获材料标记为DM-H印-CH-Ti。
[0021]在使用砂纸对纯钛片进行抛光时，优选的，砂纸型号为120目砂纸。
[0022]在使用HNO3和HF混合液对纯钛片进行抛光时，优选的，HF和HNO3浓度独立为11~14mg/mL，以便有效避免钛片的钝化，并且能使钛片表面形成有利于细胞粘附的微型台阶状。
[0023]步骤2)中所述的多巴胺溶液，优选的，浓度为0.1~0.3mg/mL,溶剂为pH8.5的Tris-HCl，以便多巴胺有效地结合到抛光后的纯钛片表面。
[0024]步骤3)中所述的肝素钠溶液，优选的，浓度为4~6mg/mL，溶剂为PBS缓冲液。
[0025]步骤3)中所述的多聚赖氨酸溶液，优选的，浓度为0.4~0.6mg/mL，溶剂为PBS缓冲液。
[0026]步骤4)中所述的 甲氨蝶呤溶液，优选的，浓度为58~62Pg/mL，溶剂为pH5.5~5.7的MES缓冲液。
[0027]步骤4)中所述的壳聚糖溶液，优选的，浓度为0.8~1.2mg/mL，溶剂为pH5.5~
5.7的MES缓冲液，壳聚糖易在酸性条件下溶解，且在壳聚糖剂量较高的条件下，可对甲氨蝶呤进行包裹。
[0028]下面结合具本实施例对本发明作进一步说明，但并不局限于此。
[0029]实施例1:
1)取Icm2的医用纯钛片，其表面经120目砂纸抛光，然后用乙醇超声洗涤30min，再用丙酮超声洗漆30min,再置于含12.5 mg/mL HNO3和12.5 mg/mL HF的混合液中抛光30min,去离子水洗涤干净，烘干；
2)以pH8.5的Tris-HCl为溶剂，配制0.2mg/mL的多巴胺溶液，将抛光后的纯钛置于多巴胺溶液中，在室温下反应12h，用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，重复此过程3次，所获得的材料标记为DM-Ti ；
3)以PBS缓冲液为溶剂，分别配制5mg/mL的肝素钠溶液和0.5mg/mL的多聚赖氨酸溶液，在超声条件下，将肝素钠溶液逐滴加入等体积的多聚赖氨酸溶液后，再持续超声30s，形成多聚赖氨酸-肝素钠颗粒的悬浊液，再将DM-Ti置于悬浊液反应12h，然后用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，所获得的材料标记为DM-Hep-Ti ；
4)以pH5.6的MES缓冲液为溶剂，分别配置6(^g/mL的甲氨蝶呤溶液和2mg/mL的壳聚糖溶液，将甲氨蝶呤溶液缓慢滴入等体积的壳聚糖溶液，制成混合液，再将DM-Hep-Ti置于混合液中，常温反应12h，用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，即可获得抗菌抗肿瘤骨科植入材料，标记为DM-H印-CH-Ti。
[0030]实施例2:
1)取Icm2的医用纯钛片，其表面经120目砂纸抛光，然后用乙醇超声洗涤25min，再用丙酮超声洗漆25min,再置于含11 mg/mL HNO3和11 mg/mL HF的混合液中抛光35min,去离子水洗涤干净，烘干；
2)以pH8.7的Tris-HCl为溶剂，配制0.lmg/mL的多巴胺溶液，将抛光后的纯钛片置于多巴胺溶液中，在室温下反应14h，用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，重复此过程2次，所获得的材料标记为DM-Ti ；
3)以PBS缓冲液为溶剂，分别配制6mg/mL的肝素钠溶液和0.6mg/mL的多聚赖氨酸溶液，在超声条件下，将肝素钠溶液逐滴加入等体积的多聚赖氨酸溶液后，再持续超声30s，形成多聚赖氨酸-肝素钠颗粒的悬浊液，再将DM-Ti置于悬浊液反应10h，然后用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，所获得的材料标记为DM-Hep-Ti ；
4)以pH5.5的MES缓冲液为溶剂，分别配置58Pg/mL的甲氨蝶呤溶液和0.8mg/mL的壳聚糖溶液，将甲氨蝶呤溶液缓慢滴入等体积的壳聚糖溶液，制成混合液，再将DM-Hep-Ti置于混合液中，常温反应14h，用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，即可获得抗菌抗肿瘤骨科植入材料，标记为DM-1fep-CH-Ti。
[0031]实施例3:
1)取Icm2的医用纯钛片，其表面经120目砂纸抛光，然后用乙醇超声洗涤35min，再用丙酮超声洗漆35min,再置于含14 mg/mL HNO3和14 mg/mL HF的混合液中抛光25min,去离子水洗涤干净，烘干；
2)以pH8.3的Tris-HCl为溶剂，配制0.3mg/mL的多巴胺溶液，将抛光后的纯钛置于多巴胺溶液中，在室温下反应10h，用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，重复此过程4次，所获得的材料标记为DM-Ti ；
3)以PBS缓冲液为溶剂，分别配制4mg/mL的肝素钠溶液和0.4mg/mL的多聚赖氨酸溶液，在超声条件下，将肝素钠溶液逐滴加入等体积的多聚赖氨酸溶液后，再持续超声30s，形成多聚赖氨酸-肝素钠颗粒的悬浊液，再将DM-Ti置于悬浊液反应14h，然后用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，所获得的材料标记为DM-Hep-Ti ；
4)以pH5.7的MES缓冲液为溶剂，分别配置62Pg/mL的甲氨蝶呤溶液和1.2mg/mL的壳聚糖溶液，将甲氨蝶呤溶液缓慢滴入等体积的壳聚糖溶液，制成混合液，再将DM-Hep-Ti置于混合液中，常温反应10h，用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，即可获得抗菌抗肿瘤骨科植入材料，标记为DM-1fep-CH-Ti。
[0032]
下面对实施例中制备的抗菌抗肿瘤骨科植入材料作进一步效果检测。
[0033]1.水接触角测定
材料表面的亲疏水特性可通过水接触角来进行表征，取10μ1超纯水滴于实施例1中制备纯T1、DM-T1、DM-H印-Ti和DM-H印-CH-Ti材料表面，Imin后采用ε rma角度计式接触角测定仪进行测试，每个样品取间距5mm的3个点进行测量，共6次读数，取算术平均值，结果如图1所示，相对于纯Ti，DM-Ti中因DM沉积其表面水接触角略有增加，但无显著性差异。而结合了肝素纳米颗粒和壳聚糖颗粒后的DM-Hep-CH-Ti材料，其接触角显著下降(p〈0.05)，因为肝素表面和壳聚糖表面含大量亲水集团-NH2、-OH、-C00H，该实验结果说明肝素纳米颗粒和壳聚糖颗粒被成功结合到金属钛片表面。
[0034]2.抑菌作用检测
采用抑菌圈法进行检测实施例2中制备的纯T1、DM-Ti, DM-Hep-Ti和DM-H印-CH-Ti材料的抑菌性能。取复苏后的金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)菌液,加入40°C的上层培养基中，使菌体浓度为IO6个/mL。将含菌的上层培养基倒入预先铺好的固体培养基上，待上层培养基凝固后，加入实施例2中制备的不同表面修饰的钛片，如图2所示，其中I代表纯Ti，2代表DM-Ti，3代表DM-Hep-Ti，4代表DM-Hep-CH-Ti，且在培养基正中间挖一个小洞，加入15μ1氨苄霉素溶液，于37°C培养箱中培养12h，观察结果如图2所示，4(DM-Hep-CH-Ti材料)周围有明显抑菌圈，与氨苄霉素周围的抑菌圈相似，说明本发明中所制备的DM-Hep-CH-Ti具有一定的抑菌作用。
[0035]3.抑制肿瘤细胞增殖
采用MTT法检测实施例3中制备的材料对骨肉瘤细胞MG63增殖的影响。调整MG63细胞浓度至2X IO4个/mL，然后分别接种到含实施例3制备的纯T1、DM-T1、DM-Hep-Ti和DM-Hep-CH-Ti材料的24孔板中，每孔加入500 μ L MG63细胞液，每组含3个平行实验，分别于37 °C培养。分别在培养到3d、5d和7d时吸去培养基，PBS清洗I次，每孔加入300 μ L新鲜培养基和30 yL MTT溶液(其中噻唑蓝浓度为5mg/mL)，37 °C孵育4h后，小心吸弃孔内上清液，每孔加入300 μ L DMS0，吹打混匀，用酶标仪在490 nm波长下测定OD值。结果如图3所示，与纯Ti和所制备中间样品相比，DM-Hep-CH-Ti对MG63的增殖具有明显的抑制作用，该结果表明本发明成功地对纯钛表面进了表面改性，所制备的材料具有抗肿瘤效果。
[0036]4.对肿瘤细胞的杀伤作用
将实施例1中制备的纯T1、 DM-T1、DM-H印-Ti和DM-H印-CH-Ti材料分别置于24孔板中，分别取500 μ L浓度为5 X IO4个/mL的MG63细胞液接种于上述四个种材料的表面，37°C孵育24h后，吸去培养基，使用戊二醛于4°C固定过夜，然后依次使用50%、70%、95%、100%的酒精进行梯度脱水，各浓度的酒精分别脱水lOmin。脱水后的材料再经冷冻干燥、喷金后，置于扫描电镜下观察MG63细胞分别在纯T1、DM-T1、DM-H印-Ti和DM-H印-CH-Ti材料表面的粘附形态。结果如图4所示，在Ti，DM-Ti及DM-H印-Ti表面，细胞形态饱满、均一、正常，细胞呈梭形，而在DM-Hep-CH-Ti表面，细胞较小，很难找到正常的梭形细胞，几乎不存在完整细胞结构，实验结果说明DM-Hep-CH-Ti对MG63细胞具有毒性，具有一定的杀伤肿瘤细胞的能力。
【权利要求】
1.一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料，其特征在于:其由金属钛和具有抗菌抗肿瘤性能的修饰层组成。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料，其特征在于:所述的修饰层包括壳聚糖、甲氨蝶呤、肝素钠、多聚赖氨酸和多巴胺。
3.一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)将医用纯钛片表面抛光； 2)将抛光后的纯钛与多巴胺溶液在20~30°C下反应10~14h，使多巴胺结合到纯钛片表面上，然后用PBS缓冲液将结合有多巴胺的纯钛片洗涤干净，液氮吹干，重复此过程2~4次，所获材料标记为DM-Ti ； 3)在超声条件下，将肝素钠溶液逐滴加入多聚赖氨酸溶液中，形成多聚赖氨酸-肝素钠颗粒的悬浊液，再将DM-Ti放入该悬浊液反应10~14h，使钛片上的多巴胺与赖氨酸反应完全，再用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，所获材料标记为DM-H印-Ti ； 4)将甲氨蝶呤溶液加入壳聚糖溶液，制成混合液，将DM-Hep-Ti置于混合液中反应10~14h，使带负电的肝素和带正电的壳聚糖和甲氨蝶呤结合完全，再用PBS缓冲液清洗干净，液氮吹干，即可，所获材料标记为DM-Hep-CH-Ti。
4.根据权利要求3所述的一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，其特征在于:步骤I)中，医用纯钛片表面抛光的方法为:先用120目砂纸抛光，再依次用乙醇、丙酮分别超声洗涤25~35min，然后经HNO3和HF的混溶液抛光25~35min，洗涤干净，烘干。
5.根据权利要求4所述的一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，其特征在于:所述的HNO3和HF的混合液，其中HF和HNO3浓度独立为11~14mg/mL。
6.根据权利要求3或4所述的一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，其特征在于:步骤2)中所述的多巴胺溶液，其浓度为0.1~0.3mg/mL,溶剂为pH8.3~8.7的Tris-HCl。
7.根据权利要求3所述的一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，其特征在于:步骤3)中所述的肝素钠溶液，其浓度为4~6mg/mL，溶剂为PBS缓冲液。
8.根据权利要求3、4、5或7所述的一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，其特征在于:步骤3)中所述的多聚赖氨酸溶液，其浓度为0.4~0.6mg/mL，溶剂为PBS缓冲液。
9.根据权利要求3所述的一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，其特征在于:步骤4)中所述的甲氨蝶呤溶液，其浓度为58~62Pg/mL，溶剂为pH5.5~5.7的MES缓冲液。
10.根据权利要求3、4、5、7或9所述的一种抗菌抗肿瘤骨科植入材料的制备方法，其特征在于:步骤4)中所述的壳聚糖溶液，其浓度为0.8~1.2mg/mL，溶剂为pH5.5~5.7的MES缓冲液。
【文档编号】A61L27/22GK103463675SQ201310374552
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】李丽华, 张余, 李梅, 何鹏, 夏虹, 尹庆水, 郑冠 申请人:广州军区广州总医院