Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白（rLj-112）可阻止真菌细胞膜麦角固醇的合成，从而破坏了真菌细胞的完整性，使真菌细胞膜破坏、膜通透性增高、细胞内容物质释放、细胞破裂溶解，从而杀死真菌，即能够剂量依赖性的抑制真菌而对细菌无抑制作用，发明了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。
【专利说明】LJ-RGD3全RGD模体缺失突变体L_j-112重组蛋白在制备抗
真菌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj_112重组蛋白(r Lj-112)的新用途，尤其是一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]自发现第一个抗真菌抗生素灰黄霉素以来，抗真菌药物领域已取得了长足的进展。现有抗真菌药物根据作用机制可分为:①作用于真菌细胞膜，干扰真菌细胞膜麦角固醇的合成(如唑类、丙烯胺类和吗啉类)以及损害细胞膜脂质结构及其功能的药物(如多烯类)；②影响真菌细胞壁合成的药物(如卡泊芬净);③干扰真菌核酸合成的药物(如5-氟胞嘧啶，灰黄霉素);④作用机制尚未明确的药物(如碘化钾等)。但是，现有药物由于存在着疗效、安全性、耐药性等问题而远远不能满足需要。
[0003]LJ-RGD3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由118个氨基酸残基组成，Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，17个精氨酸，是一类HRG的碱性蛋白。中国专利申请号为201110094370.2、名称为“类HRG的七鳃鳗Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112在抗肿瘤药物中的应用”的发明专利，公开了 Lj-RGD3的三个RGD模体全缺失突变体Lj-112基因。Lj-112基因人工合成序列324bp长，其蛋白质由108个氨基酸组成，其中含有17个组氨酸残基，组氨酸所占比例为15.7%，Lj-112蛋白分子量为1.2KDa。Lj-112基因可克隆于载体，获得Lj-112重组蛋白(r Lj-112)并可在大肠杆菌等进行了高效诱导表达等。Lj-112重组蛋白(r Lj-112)具有抑制血管新生、抗肿瘤功能。但是，迄今为止并没有关于Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。
【发明内容】
[0004]本发明是发现了 Lj_RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白具有抑制真菌的作用，从而发明了 Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白
在制备抗真菌药物中的应用。
[0005]本发明的技术解决方案是一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白(rLj-112)在制备抗真菌药物中的应用。
[0006]本发明发现了 Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白(rLj-112)可阻止真菌细胞膜麦角固醇的合成，从而破坏了真菌细胞的完整性，使真菌细胞膜破坏、膜通透性增高、细胞内容物质释放、细胞破裂溶解，从而杀死真菌，即能够剂量依赖性的抑制真菌而对细菌无抑制作用，发明了 Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1是rLj-112的最小杀菌浓度(MBC)及抑制率测试结果图。
[0008]图2牛津杯法检测rLj-112的抑菌活性的效果图。
[0009]图3白色念珠菌经rLj-112处理后的扫描电镜图。
【具体实施方式】[0010]可按现有技术方法获得本发明发现了 Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白(rLj-112)。
[0011]实验:
1.最小杀菌浓度(MBC)及抑菌率的测定
(O菌液制备:将甘油保菌复苏，30°C孵育过夜(18_24h)，用牛肉膏蛋白胨液体培养基校正菌液浓度至l_2X108CFU/ml ;所述菌为白色念珠菌，AS2.2086，产品货号:BZW23170，供应商:南京康恩特有限公司。
[0012](2)蛋白的制备:用牛肉膏蛋白胨培养基将蛋白(rLj_112)2倍依次稀释，广8管蛋白浓度依次为90.4,45.2,22.6,11.3,5.6,2.8,1.4,0.7,0.35 μ M ;然后在每管内加入等量上述菌液，使每管最终菌液浓度约为5Χ 105CFU/ml。第I管至第8管蛋白浓度分别为45.2、22.6,11.3,5.6,2.8,1.4,0.7,0.35,0.175 μ M0
[0013](3)阳性对照酮康唑的制备:用甲醇将酮康唑10倍依次稀释，1-5管药物浓度为94,9.4,0.94,0.094,0.0094 μ M0然后在每管内加入等量上述菌液，使每管最终菌液浓度约为 5 X 105CFU/ml。第 I 管至第 5 管药物浓度分别为 47,4.7,0.47、0.047、0.0047 μ Μ。
[0014](4)孵育:将接种好的稀释管放入30°C培养箱中孵育16-24h。
[0015](5)酶标仪检测:与阳性对照管比较能够抑制99%以上活菌生长管药物浓度为受
试囷MBC ;存活百分率(％)= OD (抗菌药+酿)一0D(抗菌药+液体培养基)/ OD(水+菌夜)一OD(水+液体培养基)XlOOo
[0016]结果如图1所示:横坐标为受试蛋白或对照药浓度，单位为μ M ;纵坐标为真菌存活百分率(％)。Α，阳性对照，酮康唑；B，rLj-112。结果表明rLj-112的MBC值为7.7 μ M，阳性对照酮康唑(ketoconazole)的MBC值为15 μ Μ。
[0017]2.用牛津杯法检测rLj-112的抑菌活性 具体操作方法如下:
(1)指示菌培养基:牛肉膏蛋白胨培养基，用0.1MPa压力灭菌20 min ;固体培养基中加入2.0%的琼脂；
(2)指示菌菌悬液:白色念珠菌(出处同上)接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，30°C摇床培养 24h ；
(3)检测平板的制备，牛肉膏蛋白胨固体培养基用0.1MPa压力灭菌20 min，5冷却至60°C左右，取一定量倒入已灭菌的培养皿中，使其凝固，待用；
(4)涂布:取0.2^0.5ml, 106CFU/ml白念珠菌均匀涂布在培养皿中，涂布后以平板无可见水滴为准；
(5)加待测蛋白:用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，将待测的蛋白rLj-112加入牛津杯中(牛津杯最大容量200ul)；(6)4°C扩散:将平皿放置到4°C冰箱中扩散数小时，使待测蛋白均匀扩散到培养基中；
(7)培养:将平皿放置到30°C培养箱中培养16、24h，拍照。
[0018]所拍照片如图2所示:A，阳性对照，酮康唑；B, rLj-112 (30 μ I) ；C, rLj-112(60 μ I); D,rLj-112 (90 μ I)；E,rLj-112 (120 μ I); F,rLj-112 (150 μ I); G,rLj-112(180μ I) ； H，阴性对照，Tris。结果表明:随着rLj-112剂量的增加，牛津杯抑菌环增大，即rLj-112剂量依赖性的抑制白念珠菌的生长。
[0019]3.rLj-112处理后白色念珠菌的扫描电镜观察
(1)菌液制备:将甘油保菌(白色念珠菌，出处同上)复苏，30°C孵育过夜(18-24h)，用牛肉膏蛋白胨液体培养基校正浓度至f2X108CFU/ml ；
(2)孵育:将rLj-112 (2.6 μ Μ)与上述菌 1:1 孵育 16_24h ；
(3)固定:用PBS(pH7.2)冲洗3次，用体积分数3%戊二醛室温下固定2_4 h ；
(4)逐级脱水:PBS(pH6.8)冲洗2-3次，每次间隔20 min，后经系列乙醇(体积分数为 30%、50%、70%、80%、90%、100%)脱水，每次 20 min,其中 100% 乙醇脱水 2 次；
(5)干燥、黏样、镀膜后，在扫描电镜下观察。
[0020]电镜图如图3所示:A，PBS对照；B，rLj-112。用PBS处理的对照组，白念珠菌细胞形态完整，细胞膜表面光滑；而rLj-112处理过的白念珠菌显示出了明显的细胞膜破裂，细胞内容物外渗现象。
【权利要求】
1.一 种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白在制备抗真菌药物中的应 用。
【文档编号】A61K38/17GK103536902SQ201310487361
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】李庆伟, 王继红, 武彩萍, 吕莉 申请人:辽宁师范大学