一种齿缘草提取物的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种齿缘草提取物的制备方法及其应用，属于医药领域。其制备方法是以齿缘草为原料，用不同浓度乙醇提取后，通过两次大孔吸附树脂纯化得到，包括齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D。该齿缘草提取物，可与药学上可接受的载体或其他适宜赋形剂相结合，按照常规方法制成口服给药的剂型。本发明的齿缘草提取物可用于制备治疗艾滋病药物。
【专利说明】一种齿缘草提取物的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种中药材提取物的制备方法及其应用，具体是涉及一种齿缘草提取物的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]艾滋病是1981年发现的新病毒性传染病，中医过去对其未有记载。中医对艾滋病辨证，认为艾滋病属于疫病范畴。病因为疫毒热邪侵袭，正气虚弱而致。病机主要为卫外不固，阳气损伤，脏腑受累，引起肺虚脾虚肾虚，继发感染。热伤脉络，气血凝滞，形成癥积肿块肿瘤。
[0003]中医辨“证”:主要辨别邪正消长和虚证实证。艾滋病病毒为邪毒，邪毒入里而传变，与机体正气的邪正抗争的动态变化，为疾病的发展过程。感染早期以邪实为主，中期“因实致虚”，晚期“因虚致实”。艾滋病病情复制多变，艾滋病及其继发感染都可形成“病”，且有不同“型”和“期”。中医对艾滋病有辨证辨病，分型分期等不同诊治方案。
[0004]艾滋病的中医药治疗目前仍属于研究阶段，目前国内外尚未有公认疗效肯定被批准生产的抗艾滋病病毒中药或中药单体化合物。抗艾滋病病毒植物药和中药研究主要分3种途径，烟具获得的抗艾滋病病毒中药植物药及其成分，有些已在临床试用。
[0005]自艾滋病病毒发现以来，国际上用艾滋病病毒细胞培养和逆转录酶,蛋白酶和整合酶等体外实验方法，广泛筛选化合物的同时，也大量筛选植物和中草药提取物及其成分，也研究了一些中药复方制剂，发现在体外抑制艾滋病毒的有效药物，有的可抑制猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猴的病毒血症。有些已在临床试用，尚未明确效果。
[0006]我国自1987年派中西医结合医疗队去非洲治疗艾滋病病人。国内在2002年以前，缺乏特效抗艾滋病病毒药物，中西医在临床根据中医理论，对艾滋病病人辨病与辨证相结合，以清热解毒，扶正固本，或凉血补肾，活血化瘀等治则，按中药性能，选择中药，处方治疗。通过临床实践，认为有些中药复方治疗艾滋病可改善症状，缓解病情。近年来对实验诊断确诊的艾滋病病人，采用中药治疗，设对照组，在治疗期间，定期检测血液病毒载量(HIV-RNA)和CD4细胞水平，评价效果。有报道可改善症状，提高免疫力，大多仍在临床验证中。进入临床的抗HIV单味中药或植物药及中药复方如下:
甘草甜素:甘草甜素(glycyrrhizin,GL)是中药甘草(Glycyrrhiza glabra L)提取的甘草皂苷，有广谱抗病毒作用，体外抑制HIV-1逆转录酶，在细胞培养内抑制HIV细胞融合，也抗流感病毒和SARS病毒，体内实验证明可保护流感病毒感染小鼠引起的肺炎死亡和肺病变；保护小鼠的CCl4中毒性肝损伤；诱生Y-干扰素；有类激素作用。日本常用其静脉点滴治疗慢性乙型肝炎，也曾试用治疗艾滋病病人，可抑制血清HIV-1-P24抗原，升高CD4细胞。吕维柏教授1988-1992年在非洲坦桑尼亚应用甘草甜素口服制剂克艾可治疗艾滋病病人可改善症状，CD4细胞略有上升。其效果尚未被验证。
[0007]天花粉蛋白:天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS, GLQ223, Q物质)为中药括楼(Trichosanthes kiri1wii)属葫芦科(Cucurbitaceae),我国民间用于流产的中药复方的主要中药成分为栝楼，我国科学家分离鉴定器抗早孕和引产的有效成分为天花粉蛋白，分子量为27kD，其一、二级结构和三维结构已完全弄清，为抑制蛋白合成的植物毒蛋白，是单链的核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein, RIP)。美国在筛选抗HIV-1药物时，发现其在淋巴细胞培养内抑制HIV-1细胞融合，其后发现在单核巨噬细胞培养内HIV-1的P24抗原和RNA，在3只猴艾滋病病毒(SIV)感染猴静脉注射可抑制血浆HIV-1。美国在林场使用静脉点滴治疗艾滋病病人，可抑制外周血HIV-1感染的T淋巴细胞和单核巨噬细胞内HIV-1-P24抗原，使⑶4/⑶8比例略有升高。由于可引起过敏性反应死亡，神经毒性的精神失常和肾毒性反应，临床实验已中止。近年来从天花粉中分离出其他蛋白TAP29，分子量在29 kD，也有抑制HIV-1的作用，但毒性较小，未在临床试用。此外苦瓜(MOmordicacharantia)的苦瓜蛋白和商陆(Phytolacca americana)的商陆蛋白(Pokeweed protein)等都有抑制HIV的作用。
[0008]金丝桃素:植物贯叶金丝桃(St.John Wort, Hypericum perforatum)民间传统用其提取物治疗抑郁症，从花提出的活性成分是金丝桃素(hypericin)，是芳香族多环二聚蒽醌类化合物，为抗抑郁症药物，已全合成。金丝桃素具有多种抗病毒活性，在细胞培养内抑制HIV，其作用机制为阻断病毒的脱衣，装配和释放，有杀病毒作用，可通过血脑屏障。在细胞培养内可抑制鼠白血病病毒繁殖。在体内可抑制鼠白血病病毒感染小鼠引起的脾肿大，也可抑制鸭乙型肝炎病毒感染鸭血请病毒DNA，并有广谱抗细菌活性。曾在临床I/II期试用治疗艾滋病患者，因有光敏感作用已停止试验。
[0009]右旋胡同素A:右旋胡同素A (+Calanolide A)是1992年报道从马来西亚热带雨林植物Calophyllum Ianigerum中分离的天然化合物，鼠香豆素类化合物，抑制HIV-1逆转录酶，但对HIV-2无效。属于非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂，在细胞培养内多对多住临床分离的AZT敏感和耐药HIV-1有效，并与AZT，NVP有协同作用。在HIV空纤维管小鼠体内实验模型(HIV hollow fiber mouse model)中证明有抗艾滋病病毒作用，与AZT联合应用可增强药效。已全合成，进行了 1-1I其临床试验证明有抑制HIV-1感染的治疗效果，毒性小，副作用轻，有头痛和食欲不振等，与AZT联合用药有效。是目前唯一进入II期临床实验的单一植物成分，正在观察验证疗效中，尚未批准生产。
[0010]小柴胡汤:小柴胡汤(柴胡，人参，半夏，黄芩，甘草，生姜，大枣) 是张仲景伤寒论方。日本用其治疗乙型肝炎，发现其在细胞培养内抑制HIV。美国在临床用于治疗数例艾滋病病人，可降低血清P24抗原。我们证明其有抑制HIV-1逆转录酶和在细胞培养内抑制HIV-1的作用。分别研究其7种成分中药的效果，发现仅黄芩水提物及其成分黄芩苷(baicalin)有抑制HIV-1作用，在体外无细胞系统中抑制HIV-1逆转录酶，在人T细胞和外周血单核细胞培养内抑制HIV-1细胞病变，病毒荧光抗原和P24抗原，体内鼠白血病病毒感染小鼠口服可抑制脾肿大和血白细胞升高。日本Ono报道黄芩苷元(baicalien)抑制HIV-1逆转录酶。
[0011]中研I号:中研I号(主药有紫花地丁，天花粉等组成)商品名为:艾
克冲剂，以清热解毒为治则，由我国中药研究院组方1992-1993年在非洲坦桑尼亚对早中期艾滋病临床应用，认为有一定改善症状，提高免疫力的效果。实验室证明该药体外抑制HIV逆转录酶活性，体内对猴艾滋病毒感染猴实验治疗结果表明，能降低血浆病毒滴度，并且能提高⑶4细胞数目及⑶4/⑶8比值和T，B淋巴细胞数值，诱生干扰素和产生免疫调节功能。曾在非洲和我国临床试用，尚未批准临床验证。
[0012]中研2号:中研2号(黄芪，人参，当归，枸杞和甘草等)是我国中医
研究院医疗队组方。1992年在非洲坦桑尼亚治疗艾滋病病人。1998-1999年在非洲专科门诊对29例艾滋病病人治疗，2/16例HIV病毒载量下降，CD4 8/29例CD4升高。2001-2002年在北京佑安医院治疗15例艾滋病病人，3/15例病毒载量下降，⑶4 1/15例CD4升高。有改善症状的效果。实验证明该药在人体内对猴艾滋病毒感染猴实验治疗表明，用药4-12周能降低血浆病毒滴度，P27抗原，并且能提高CD4细胞数目，对感染猴淋巴细胞有激活作用。
[0013]齿缘草为紫草科植物石生齿缘草(Eritrichium rupestre (Pall.) Bunge)的干燥地上部分。夏季花开时采收，除去根及杂质，阴干。收载于1998年《中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册》，其性凉，味苦、甘。具有杀“粘”，清热，解毒。用于温热流感，“协日”人脉症，“协日”热。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关齿缘草的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究关于齿缘草的化学成分及药理作用鲜有报道。
[0014]国内专利检索结果，未见齿缘草相关专利。
[0015]上述文献及专利等，尚未见齿缘草提取物制备方法及其应用的相关报道。
【发明内容】
[0016]本发明的目的在于提供一种齿缘草提取物的制备方法及其应用。
[0017]本发明是通过如下技术方案实现的:
本发明所用原料齿缘草为紫草科植物石生齿缘草(Eritrichium rupestre (Pall.)Bunge)的干燥地上部分。
[0018]本发明一种齿缘草提取物的制备方法及其应用；所述齿缘草提取物的制备方法为:
(1)齿缘草，加水浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，加水量为齿缘草重量的8-15倍，收集挥发油，即得齿缘草提取物A ;将齿缘草水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A ；
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为齿缘草重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得齿缘草提取物B ；
(3)将步骤(1)得到的药液A，浓缩至相对密度d=l.10-1.20，滤过，药液通过非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过极性大孔树脂；再用浓度30%-70%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物C ;再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物D ；
(4)上述齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D，其中一种或两种或三种或四种按一定比例混匀，即得本发明的齿缘草提取物。
[0019]一种齿缘草提取物的制备方法为:
(1)齿缘草，加水浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，加水量为齿缘草重量的8-15倍，收集挥发油，即得齿缘草提取物A ;将齿缘草水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A ；
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为齿缘草重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得齿缘草提取物B ；
(3)将步骤(1)得到的药液A，浓缩至相对密度d=l.10-1.20，滤过，药液通过非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过极性大孔树脂；再用浓度30%-70%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物C ;再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物D ；
(4)将上述齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D混匀，即得本发明的齿缘草提取物。
[0020]优选的一种齿缘草提取物的制备方法为:
(1)齿缘草，加水浸泡6小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间2小时，提取次数2次，加水量为齿缘草重量的12倍，收集挥发油，即得齿缘草提取物A ;将齿缘草水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A ；
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度60%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为齿缘草重量的12倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得齿缘草提取物B ；
(3)将步骤(1)得到的药液A，浓缩至相对密度d=l.12，滤过，药液通过DlOl非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过的DM130极性大孔树脂；再用浓度60%的乙醇溶液洗脱DlOl非极性大孔吸附树脂，收集60%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物C ;再用浓度75%的乙醇溶液洗脱DM130极性大孔吸附树脂，收集75%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物D ；
(4)将上述齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D混匀，即得本发明的齿缘草提取物。
[0021]本发明的一种齿缘草提取物的制备方法，其特征在于:所采用的非极性大孔吸附树脂为DlOl大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂；所采用的极性大孔吸附树脂为DM130大孔吸附树脂、ADS-17大孔吸附树脂。
[0022]本发明的一种齿缘草提取物的制备方法及其的应用，所述的应用为在制备治疗艾滋病药物中的应用。
[0023]本发明的齿缘草提取物与化学药或中药或天然药物组成的治疗艾滋病药物。
[0024]本发明的齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D在制备治疗艾滋病药物中的应用。
[0025]本发明的齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D与化学药或中药或天然药物组成的治疗艾滋病药物。
[0026]本发明的齿缘草提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。
[0027]本发明首次探索研究以紫草科植物石生齿缘草(Eritrichium rupestre (Pall.)Bunge)的干燥地上部分为原料提取制备治疗艾滋病提取物。本实验研究表明，本发明的齿缘草提取物可用于制备治疗艾滋病药物，齿缘草提取物对C8166细胞的毒性小，对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体具有显著的抑制活性，可在制备治疗艾滋病药物中应用。临床治疗艾滋病患者疗效显著。
【具体实施方式】
[0028]下面通过具体实验例和实施例对本发明的一种齿缘草提取物的制备方法极其应用做进一步说明，但不限于本发明。
[0029]下面通过具体实施例作进一步详述。
[0030]实施例1:齿缘草提取物的制备
(1)齿缘草19kg，加水浸泡6小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间2小时，提取次数2次，加水量为齿缘草重量的12倍，收集挥发油，即得齿缘草提取物A ;将齿缘草水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A ；
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度60%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为齿缘草重量的12倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得齿缘草提取物B;
(3)将步骤(1)得到的药液A，浓缩至相对密度d=l.12，滤过，药液通过DlOl非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过DM130极性大孔树脂；再用浓度60%的乙醇溶液洗脱DlOl非极性大孔吸附树脂，收集60%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物C ;再用浓度75% 的乙醇溶液洗脱DM130极性大孔吸附树脂，收集75%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物D ;
(4)将上述齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D混匀，即得本发明的齿缘草提取物。
[0031]实施例2:齿缘草提取物的制备
(1)齿缘草21kg，加水浸泡4小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间I小时，提取次数3次，加水量为齿缘草重量的8倍，收集挥发油，即得齿缘草提取物A ;将齿缘草水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A ；
(3)将步骤(1)得到药渣A用浓度50%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为I次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为齿缘草重量的8倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得齿缘草提取物B;
(2)将步骤(1)得到的药液A，浓缩至相对密度d=l.20，滤过，药液通过AB-8非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过ADS-17极性大孔树脂；再用浓度30%的乙醇溶液洗脱AB-8非极性大孔吸附树脂，收集30%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物C ;再用浓度50%的乙醇溶液洗脱ADS-17极性大孔吸附树脂，收集50%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物D ；
(4)将上述齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D混匀，即得本发明的齿缘草提取物。
[0032]实施例3:齿缘草提取物的制备
(I)齿缘草25kg，加水浸泡12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间4小时，提取次数I次，加水量为齿缘草重量的15倍，收集挥发油，即得齿缘草提取物A ;将齿缘草水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A ；
(3)将步骤(1)得到药渣A用浓度95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为3次，每次提取时间为I小时，每次溶剂用量为齿缘草重量的15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得齿缘草提取物B ；
(2)将步骤(1)得到的药液A，浓缩至相对密度d=l.10，滤过，药液通过DlOl非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过DM130极性大孔树脂；再用浓度70%的乙醇溶液洗脱DlOl非极性大孔吸附树脂，收集70%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物C ;再用浓度95%的乙醇溶液洗脱DM130极性大孔吸附树脂，收集95%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物D ； (4)将上述齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D混匀，即得本发明的齿缘草提取物。
[0033]实施例4:齿缘草提取物片剂的制备
取实施例1齿缘草提取物365g，加入淀粉110g，混匀，制粒，干燥，过筛，加微晶纤维素15g，硬脂酸镁5g，混匀，压制成1000片，即得齿缘草提取物片剂。
[0034]实施例5:齿缘草提取物颗粒剂的制备
取实施例2齿缘草提取物365g，加入糊精160g，混匀，制粒，干燥，整粒，即得齿缘草提取物颗粒剂。
[0035]实施例6:齿缘草提取物胶囊的制备
取实施例3齿缘草提取物345g，加入淀粉85g，混匀，制粒，整粒，装胶囊1000粒，即得齿缘草提取物胶囊。
[0036]实验例1:齿缘草提取物胶囊治疗艾滋病临床观察试验。
[0037]1、钱某某，男，43岁，吉林长春，低烧I月，伴有咽痛，到医院检查出艾滋病，用西药制疗三个月，不好转，并出现瘤痒皮炎，后期出现带血丝腹泻。2010年6月10日开始服用本发明的齿缘草提取物胶囊，每次服用5粒，每天服用3次，三天后腹泻停止，服用三个月后皮炎消失，至今还能下地干活，身体很好。
[0038]2、孙某某，女，32岁，沈阳辽宁人，全身瘤痒，会阴部出现疮面，到医院检查为艾滋病。经西药治疗一月未能见效，反而出现少量便血泻痢，服用本发明的齿缘草提取物胶囊，每次服用5粒，每天服用3次，4天泻痢停止，4个月后会阴部疮面痊愈，还同时用本发明的齿缘草提取物外洗，3天洗一次，共洗九次，至今身体好，能参加正常工作
实验例2齿缘草提取物体外抗HIV-1活性试验
待测样品:药物:齿缘草提取物、齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D，均为按本发明实施例1方法制备得到。阳性对照化合物叠氮胸昔(AZT，3’-Azido-3’ -deoxythymidine)购自Sigma公司。待测样品溶解于二甲基亚帆(DMSO)中，分装后4°C保存；AZT溶解于RPM1-1640完全培养基中，0.22um滤膜过滤除菌，分装后_20°C保存。
[0039]试剂:HEPES (4_轻乙基呱嗦乙磺酸)、MTT (3_ (4，5—二甲基曝哩_2) _2，5—二苯基四氮哩嗅盐)、DMF (N, N —二甲基甲酞胺)、青霉素(Penicillin)、硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)、谷氨酞胺(Glutamine)均购自Sigma公司;2-琉基乙醇(2-ME, 2-Mercaptoethanol)为 Bio-Rad 公司产品。RPM1-1640 和新生小牛血清为 Gibco 公
司产品。
[0040]培养基:RPM1-1640完全培养基，含有10%新生小牛血清，2mM L-谷氨酞胺，IOmMHEPES, 50uM 2-琉基乙醇，100000IU 青霉素，100 μ g/ml 链霉素。
[0041]细胞和病毒:人T淋巴细胞系C8166，HIV-1实验株HIV-1ni B。均由英国MedicalResearch Council, A 工 DS Reagent Project 惠赠。所有细胞和病毒均含 10% 小牛血清的RPM工-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-1 m B，滴定并计算出病毒的TCID5tlt5病毒贮存液分装后，置_70°C保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。
[0042]HIV-1感染性滴定:HIV-1 m B按Johnson&Byington (1990)所述方法改良进行滴定，简述如下:将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50ul (4X 105/ml)，每孔终体积为200ul。37°C,CO2培养。第三天补加新鲜RPM1-1640完全培养基IOOul，第七天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导的细胞病变效应(CytopathicEffect, CPE),以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定。按 Reed &Muench 方法计算病毒的 TCID5tl(50% Tissue Culture InfectionDose,半数组织培养感染剂量)。
[0043]对C8166细胞的毒性试验:将4X 105/ml C8166细胞悬液IOOul与不同的待测药物溶液混合，设三个重复孔。同时设置不含药物的对照孔。37°C，CO2培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800酶标仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC5tl值(50%Cytotoxic Concentration)，即对50%的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的药物浓度。实验结果如表1。
[0044]表1齿缘草提取物对C8166细胞的毒性作用的实验数。
【权利要求】
1.一种齿缘草提取物的制备方法及其应用；所述齿缘草提取物的制备方法为: (1)齿缘草，加水浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，加水量为齿缘草重量的8-15倍，收集挥发油，即得齿缘草提取物A ;将齿缘草水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A ； (2)将步骤(1)得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为齿缘草重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得齿缘草提取物B ； (3)将步骤(1)得到的药液A，浓缩至相对密度d=l.10-1.20，滤过，药液通过非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过极性大孔树脂；再用浓度30%-70%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物C ;再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物D ； (4)上述齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D，其中一种或两种或三种或四种按一定比例混匀，即得本发明的齿缘草提取物。
2.根据权利要求1所述一种齿缘草提取物的制备方法为: (1)齿缘草，加水浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，加水量为齿缘草重量的8-15倍，收集挥发油，即得齿缘草提取物A ;将齿缘草水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A ； (2)将步骤(1)得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为齿缘草重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得齿缘草提取物B ; (3)将步骤(1)得到的药液A，浓缩至相对密度d=l.10-1.20，滤过，药液通过非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过极性大孔树脂；再用浓度30%-70%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物C ;再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物D ； (4)将上述齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D混匀，即得本发明的齿缘草提取物。
3.根据权利要求1所述一种齿缘草提取物的制备方法为: (1)齿缘草，加水浸泡6小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间2小时，提取次数2次，加水量为齿缘草重量的12倍，收集挥发油，即得齿缘草提取物A ;将齿缘草水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A ； (2)将步骤(1)得到药渣A用浓度60%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为齿缘草重量的12倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得齿缘草提取物B; (3)将步骤(1)得到的药液A，浓缩至相对密度d=l.12，滤过，药液通过DlOl非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过的DM130极性大孔树脂；再用浓度60%的乙醇溶液洗脱DlOl非极性大孔吸附树脂，收集60%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物C ;再用浓度75%的乙醇溶液洗脱DM130极性大孔吸附树脂，收集75%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得齿缘草提取物D ； (4)将上述齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D混匀，即得本发明的齿缘草提取物。
4.根据权利要求1、权利要求2所述的一种齿缘草提取物的制备方法，其特征在于:所采用的非极性大孔吸附树脂为DlOl大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂；所采用的极性大孔吸附树脂为DM130大孔吸附树脂、ADS-17大孔吸附树脂。
5.根据权利要求1所述的应用为在制备治疗艾滋病药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的齿缘草提取物与化学药或中药或天然药物组成的治疗艾滋病药物。
7.根据权利要求1所述的齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D在制备治疗艾滋病药物中的应用。
8.根据权利要求1所述的齿缘草提取物A、齿缘草提取物B、齿缘草提取物C、齿缘草提取物D与化学药或中药或天然药物组成的治疗艾滋病药物。
9.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3所述的齿缘草提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片`剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。
【文档编号】A61P31/18GK103585239SQ201310525327
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】孔倩倩 申请人:济南星懿医药技术有限公司