一种引导骨组织再生的支架的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种引导骨组织再生的支架的制备方法，包括以下步骤：将聚乳酸-羟基乙酸溶于二氯甲烷中，向其中加入适量蒸馏水，超声振荡，得到均质初乳，再将其倒入一定量的聚乙烯醇水溶液中，搅拌至完全固化，高速离心，洗涤，冷冻干燥，得到聚乳酸-羟基乙酸微囊；将聚乳酸-羟基乙酸微囊用试验筛筛选出目标粒径的微囊，填充到模具中，采用二氯甲烷蒸汽使其融合成型，冷冻干燥后制得聚乳酸-羟基乙酸微囊支架。本发明的工艺简单可行，制备的聚乳酸-羟基乙酸微囊支架具有一定孔径和空隙率，具有三维连通的多孔结构，且孔结构均匀，抗压强度好，具有良好的生物相容性及降解性。
【专利说明】一种引导骨组织再生的支架的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于高分子生物医学材料领域，具体涉及一种引导骨组织再生的聚乳酸-羟基乙酸微囊支架的其制备方法。
【背景技术】
[0002]微囊(microcapsules，MC)系利用天然的或合成的高分子材料(统称为囊材membrane wall)作为囊膜壁壳,将固态或液态药物作为囊心物(core)包裹而成的药库型(reservoir type)微型胶囊。
[0003]组织工程支架是指在组织工程中，为细胞生长输送营养及排泄代谢产物的三维多孔结构的细胞载体。通常理想的骨组织工程中的支架除了良好的生物相容性、生物降解性之外还需要具备以下性能:(1)适当的降解性能且易于塑形:材料的降解需与细胞增殖和基质合成相适且降解时间可控，材料可个性化制备，利于手术操作；(2)具有三维贯通的立体结构:必须是高度多孔的类似泡沫状，并且有很大的内表面积，这样既有利于细胞的植入、粘附，又有利于细胞营养成分的渗入和代谢产物的排出；(3)良好的机械性能:支架需与所修复组织的机械相匹配。
[0004]生物可降解支架在组织工程中扮演着重要的角色。组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。组织工程支架材料不仅影响了细胞的生物学性质和培养效率，还决定了移植后支架能否与受体很好的结合发挥其修复功能。
[0005]聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)由两种单体——乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒以及良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国通过FDA认证，被`正式作为药用辅料收录进美国药典。
[0006]现有的技术主要采用加热工艺使支架成形，这种高温的应用会使一些蛋白质类的药物变性，限制了载药的种类；同时，由于大型加热的设备较少，加热工艺的选择也限制了支架的制作。虽然关于微球载药支架已经有了一些研究，但是微囊支架仍少见报道，微囊支架载药更是如此。从理论上来说，微球为实心结构，降解后也无法继续提供细胞粘附的空间；而聚乳酸-羟基乙酸微囊为一空心囊腔结构，降解之后，内部空腔暴露，进一步提高了细胞粘附的三维空间。
【发明内容】
[0007]发明目的:为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种引导骨组织再生支架的制备方法。
[0008]技术方案:为实现上述目的，本发明提供了本发明一种引导骨组织再生的支架的制备方法，其制备步骤包括以下:
(I)将聚乳酸-羟基乙酸溶解于二氯甲烷中，得到聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液；(2)将蒸馏水加入到步骤(1)得到的聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液中，蒸馏水与聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液的体积比为1: 5~1:10，涡旋使其分散均匀，再经过超声振荡形成均匀的初乳；
(3)将聚乙烯醇加入去离子水中，加热到50~80°C，高速搅拌至完全溶解，得到聚乙烯醇溶液；
(4)将步骤(2)得到的聚乳酸-羟基乙酸与蒸馏水形成的初乳缓慢加入到步骤(3)得到的聚乙烯醇溶液中，搅拌至完全固化，离心，去离子水洗涤，冷冻干燥，得到聚乳酸-羟基乙酸微囊；
(5)将步骤(4)得到的聚乳酸-羟基乙酸微囊用试验筛筛出目标粒径的微囊；
(6)将步骤(5)得到的聚乳酸-羟基乙酸微囊填充到聚四氟乙烯模具中，再将模具放入有二氯甲烷的玻璃容器中3飞分钟，从模具中取出，冷冻干燥，制得聚乳酸-羟基乙酸微囊支架。
[0009]进一步地，所述步骤(1)中的聚乳酸-羟基乙酸和二氯甲烷的质量体积比为0.05~0.lg/ml。
[0010]进一步地，所述步骤(2)中的润旋转速为2000r/min,振幅6mm,润旋时间为10~30s。
[0011]进一步地，所述步骤(2)中的超声振荡的功率为100~300W，超声振荡时间为15s~2min。
[0012]进一步地，所述步骤(3)中，聚乙烯醇和去离子水的质量体积比为5~10g/L;搅拌时间为2~3h。
[0013]进一步地，所述步骤(4)中的聚乳酸-羟基乙酸与蒸馏水形成的初乳和聚乙烯醇的体积比为(5~10) =1OO。
[0014]进一步地，所述搅拌的转速≥1000r/min,搅拌时间为4~5h。
[0015]进一步地，所述步骤(5)中的试验筛目数为50-400目。
[0016]进一步地，所述步骤(6)中的二氯甲烷占玻璃容器的体积为2~3%。
[0017]进一步地，所述步骤(4)与步骤(6)中，所述的冷冻干燥的温度为-45°C~-35°C，冷冻干燥时间为40~48h。
[0018]进一步地，所述步骤(9)中的聚乳酸-羟基乙酸中加入司盘-80，司盘-80作为一种表面活性剂，将更加有利于乳化的完全。
[0019]本发明制备的微囊内部为均一的空腔结构，仅外围是聚乳酸-羟基乙酸的囊材，这种结构一方面可以加快聚乳酸-羟基乙酸微囊的降解速度，另一方面，降解后可进一步提高孔隙率、提供细胞黏附空间可用于骨组织的缺损修复和重建。这种空心结构及制备条件易于装载各类药物以及细胞因子，可为骨组织工程的实现提供便利条件。
[0020]通过将本发明中的聚乳酸-羟基乙酸微囊支架植入骨缺损区，提供一个良好的机械强度支撑表面的软组织，同时为细胞生长输送营养及排泄代谢产物的三维多孔结构的细胞载体，引导成骨细胞向受损伤的部位附着、增殖，达到组织修复的目的。将聚乳酸-羟基乙酸微囊制作成支架之后可以同时发挥组织工程和药物装载两方面的作用，利用聚乳酸-羟基乙酸微囊紧密堆积得到的聚乳酸-羟基乙酸微囊支架具有降解时间可控、孔相连性好、尺寸易调控等优点，同时对聚乳酸-羟基乙酸微囊进行载药可以进一步提高支架材料的应用价值。
[0021]本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果:
(I)制备的微囊内部为均一的空腔结构，仅外围是聚乳酸-羟基乙酸的囊材，这种结构一方面可以加快聚乳酸-羟基乙酸微囊的降解速度，另一方面，降解后可进一步提高孔隙率、提供细胞黏附空间。 [0022](2)制备的微囊支架强度高、孔隙率高、压缩强度好。
[0023](3)制备的微囊支架具有三维连通的孔隙结构，有利于细胞的黏附和增殖。
[0024](4)制备的微囊支架作为骨组织工程支架，具有良好的生物相容性和降解性。
[0025](5)制备工艺简单，对设备相求低，实验原材料价格低廉，易于产业化。
[0026](6)制备的微囊易于装载各类药物以及细胞因子，可为骨组织工程的实现提供便利条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为本发明制备的支架接种细胞后1、3天的SEM图像。
[0028]图2为不同烧结、二氯甲烷蒸气粘结时间下的PLGA支架表面与截面的表面形貌。
[0029]【具体实施方式】:
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明要求保护的范围不限于此。
[0030]实施例1:
将0.5g聚乳酸-羟基乙酸溶解于IOml 二氯甲烷中，得到聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液；将0.5ml蒸馏水加入到聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液中，2000r/min、振幅6mm涡旋15s使其分散均匀，再经过300W的超声振荡15s，形成均匀的初乳；将Ig聚乙烯醇加入200ml去离子水中，加热到5(T80°C，高速搅拌至完全溶解，得到聚乙烯醇溶液；聚乳酸-羟基乙酸与蒸馏水的初乳缓慢加入200ml、0.5%的聚乙烯醇溶液中，以1000r/min的速度搅拌4h至完全固化，5000r/min速度高速离心5min，去离子水洗涤三次，_45°C冷冻干燥48h，得到聚乳酸-羟基乙酸微囊；聚乳酸-羟基乙酸微囊用试验筛筛出37.5^75微米、75~150微米、150-300微米三种粒径的微囊；三种粒径的聚乳酸-羟基乙酸微囊填充到聚四氟乙烯至模具中，再将模具放入有IOml 二氯甲烷的容积为385ml的玻璃容器中3min，从模具中取出，_45°C冷冻干燥48h，制得聚乳酸-羟基乙酸微囊支架。
[0031]本实例制备出的聚乳酸-羟基乙酸微囊支架兼具优异的力学性能和生物活性，连通率好、孔隙率佳。微囊与微囊之间部分融合，结合好。
[0032]实施例2:
将Ig聚乳酸-羟基乙酸溶解于IOml 二氯甲烷中，得到聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液；将Iml蒸馏水加入到聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液中，2000r/min、振幅6mm涡旋30s使其分散均匀，再经过300W的超声振荡30s，形成均匀的初乳；将2g聚乙烯醇加入200ml去离子水中，加热到5(T80°C，高速搅拌至完全溶解，得到聚乙烯醇溶液；聚乳酸-羟基乙酸与蒸馏水的初乳缓慢加入200ml、l%的聚乙烯醇溶液中，以1200r/min的速度搅拌4h至完全固化，5000r/min速度高速离心5min，去离子水洗涤三次，_45°C冷冻干燥48h，得到聚乳酸-羟基乙酸微囊；聚乳酸-羟基乙酸微囊用试验筛筛出37.5^75微米、75~150微米、150-300微米三种粒径的微囊；三种粒径的聚乳酸-羟基乙酸微囊填充到聚四氟乙烯至模具中，再将模具放入有IOml 二氯甲烷的容积为385ml的玻璃容器中4min，从模具中取出，_45°C冷冻干燥48h，制得聚乳酸-羟基乙酸微囊支架。
[0033]本实例制备出的聚乳酸-羟基乙酸微囊支架兼具优异的力学性能和生物活性，连通率好、孔隙率佳。微囊与微囊之间部分融合，结合好。
[0034]实施例3:
将Ig聚乳酸-羟基乙酸溶解于IOml 二氯甲烷中，得到聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液；将Iml蒸馏水加入到聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液中，2000r/min、振幅6mm涡旋30s使其分散均匀，再经过300W的超声振荡2min，形成均匀的初乳；将2g聚乙烯醇加入200ml去离子水中，加热到5(T80°C，高速搅拌至完全溶解，得到聚乙烯醇溶液；聚乳酸-羟基乙酸与蒸馏水的初乳缓慢加入200ml、l%的聚乙烯醇溶液中，以1500r/min的速度搅拌4h至完全固化，5000r/min速度高速离心5min，去离子水洗涤三次，_45°C冷冻干燥48h，得到聚乳酸-羟基乙酸微囊；聚乳酸-羟基乙酸微囊用试验筛筛出37.5^75微米、75~150微米、150-300微米三种粒径的微囊；三种粒径的聚乳酸-羟基乙酸微囊填充到聚四氟乙烯模具中，再将模具放入有IOml 二氯甲烷的容积为385ml的玻璃容器中5min，从模具中取出，_45°C冷冻干燥48h，制得聚乳酸-羟基乙酸微囊支架。
[0035]本实例制备出的聚乳酸-羟基乙酸微囊支架兼具优异的力学性能和生物活性，连通率好、孔隙率佳。微囊与微囊之间部分融合，结合好。
[0036]实施例4:
将0.5g聚乳酸-羟基乙酸、0.5g司盘-80溶解于IOml 二氯甲烷中，得到聚乳酸-羟基乙酸与司盘-80的二氯甲烷混合溶液。将Iml蒸馏水加入到聚乳酸-羟基乙酸与司盘-80的二氯甲烷混合溶液中，2000r/min、振幅6mm涡旋IOs使其分散均匀，再经过100W的超声振荡15s，形成均匀的初乳；将28聚乙烯醇加入200ml去离子水中，加热到5(T80°C，高速搅拌至完全溶解，得到聚乙烯醇溶液；聚乳酸-羟基乙酸与司盘-80的二氯甲烷混合溶液与蒸馏水的初乳缓慢加入200ml、l%的聚乙烯醇溶液中，以1500r/min的速度搅拌4h至完全固化,5000r/min速度高速离心5min,去离子水洗漆三次，_45°C冷冻干燥48h,得到聚乳酸-轻基乙酸微囊；聚乳酸-羟基乙酸微囊用试验筛筛出37.5微米粒径以下的微囊；37.5微米粒径以下的聚乳酸-羟基乙酸微囊填充到聚四氟乙烯至模具中，再将模具放入有IOml 二氯甲烷的容积为385ml的玻璃容器中3min，从模具中取出，_45°C冷冻干燥48h，制得聚乳酸-羟基乙酸微囊支架。
[0037]图1为支架接种细胞后1、3天的SEM图像。从图中可以看到细胞能够很好的粘附在支架的表面，并且有一个较大范围的铺展。与I天组的相比，细胞培养3天后，支架上粘附的细胞数量有了明显的增加，支架表面80%左右的区域都有细胞的粘附，并且细胞的粘附不再只局限于单个微囊，它们可以利用伪足在两个微囊之间连接，甚至可以在多个微囊形成的空隙中向内粘附。
[0038]图2为不同烧结、二氯甲烷蒸气粘结时间下的PLGA支架表面与截面的表面形貌。支架材料用途决定了它要有比较大的抗压强度，所以微囊之间要求粘结紧密，使微囊之间并不是点接触，而要紧密的粘结在一起。当温度在PLGA玻璃化温度以上、熔融温度以下时，微囊之间由于核聚变可发生物理的结合，而PLGA可溶解于二氯甲烷，当二氯甲烷蒸气挥发时，使微囊的表面产生轻微的溶解，这时相接触的两个微囊之间的接触点发生融合，待二氯甲烷完全挥发后微囊又重新硬固。从图中我们可以发现，随着烧结及溶剂粘结的时间延长，微囊之间的粘结也更加紧密。当粘结时间与烧结时间均较长时，微囊的球形结构已经不能很清晰的分辨，同时微囊与微囊之间的结合也变得十分牢固，截面的形态可以见到这种结合被破坏的痕迹。
[0039]本实例制备出的聚乳酸-羟基乙酸微囊支架兼具优异的力学性能和生物活性，连通率好、孔隙率佳，微囊与微囊之间部分融合，结合好。
[0040]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本【技术领域】的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保 护范围。
【权利要求】
1.一种引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:其制备步骤包括以下: (1)将聚乳酸-羟基乙酸溶解于二氯甲烷中，得到聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液； (2)将蒸馏水加入到步骤(1)得到的聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液中，蒸馏水与聚乳酸-羟基乙酸的二氯甲烷溶液的体积比为1: 5~1:10，涡旋使其分散均匀，再经过超声振荡形成均匀的初乳； (3)将聚乙烯醇加入去离子水中，加热到5(T80°C，高速搅拌至完全溶解，得到聚乙烯醇溶液； (4)将步骤(2)得到的聚乳酸-羟基乙酸与蒸馏水形成的初乳缓慢加入到步骤(3)得到的聚乙烯醇溶液中，搅拌至完全固化，离心，去离子水洗涤，冷冻干燥，得到聚乳酸-羟基乙酸微囊； (5)将步骤(4)得到的聚乳酸-羟基乙酸微囊用试验筛筛出目标粒径的微囊； (6)将步骤(5)得到的聚乳酸-羟基乙酸微囊填充到聚四氟乙烯模具中，再将模具放入有二氯甲烷的玻璃容器中3飞分钟，从模具中取出，冷冻干燥，制得聚乳酸-羟基乙酸微囊支架。
2.根据权利要求1所述的引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(O中的聚乳酸-羟基乙酸和二氯甲烷的质量体积比为0.05、.lg/ml。
3.根据权利要求1所述的引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的涡旋转速为2000r/min，振幅6mm，涡旋时间为l(T30s。
4.根据权利要求1所述的引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的超声振荡的功率为10(T300W，超声振荡时间为15s~2min。
5.根据权利要求1所述的引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中，聚乙烯醇和去离子水的质量体积比为5~10g/L，搅拌时间为2~3h。
6.根据权利要求1所述的引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中的聚乳酸-羟基乙酸与蒸馏水形成的初乳和聚乙烯醇的体积比为(5~10):100。
7.根据权利要求1所述的引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:所述搅拌的转速> 1000r/min,搅拌时间为4~5h。
8.根据权利要求1所述的引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中的试验筛目数为50-400目。
9.根据权利要求1所述的引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:所述步骤Cl)中的聚乳酸-羟基乙酸中加入司盘-80。
10.根据权利要求1所述的引导骨组织再生的支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)与步骤(6)中，所述的冷冻干燥的温度为_45°C~-35°C，冷冻干燥时间为4(T48h。
【文档编号】A61L27/50GK103550824SQ201310535353
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】章非敏, 陈刚, 刘珏 申请人:南京医科大学附属口腔医院