专利名称：胶原－壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种双层皮肤再生支架及其制备方法。具体说涉及胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法。
背景技术：
皮肤的烧伤或溃疡是十分常见的外科病症，如各种事故与战争中的创伤及自身疾病如糖尿病引起的皮肤溃烂。皮肤的缺损轻则影响病人的外表美观，重则引发感染或电解质与水分的大量流失，导致病人的死亡。皮肤组织虽然具有较强的再生能力，但是对于大面积的全层皮肤缺损，皮肤就丧失了自发再生的能力。治疗全厚皮缺损的关键是使创面尽早封闭，以减少机体消耗和内环境紊乱，以及微生物入侵等并发症的发生。迄今为止，自体皮移植仍然是临床治疗全层皮肤缺损最有效的方法。但是该方法面临着自体皮供应不足的缺点，如III度烧伤面积超过30％时供皮部位就已不足。
皮肤是人体最大的器官，约占人体重量的16％，是机体与外界的天然屏障和沟通的桥梁。皮肤的组成与结构具有高度的复杂性，包括多种细胞(表皮细胞、真皮细胞等)，胶原纤维、弹性纤维，糖蛋白或蛋白多糖等生物大分子，以及氨基酸、葡萄糖、维生素以及无机盐等小分子。人体的皮肤由表及里可以依次分为表皮、基底膜、真皮以及皮下组织四个部分。其中表皮层和真皮层是实现皮肤功能的最重要组成部分。表皮层属于上皮组织，厚约0.1mm，由10层左右的表皮细胞构成。真皮是一种致密的结缔组织，厚约2～5mm，主要是由成纤维细胞分泌的胶原纤维、弹性纤维以及蛋白多糖等物质构成。真皮层是皮肤发挥功能的最重要结构。皮肤复杂的组成和结构决定了其功能的多样性。皮肤首先是人体与外界环境的天然屏障，它可以避免机体内水分和电解质等物质的丧失，可以保护机体免受外界环境中的辐射、化学物质、细菌以及病毒的直接危害。同时皮肤又是机体与外界环境沟通的桥梁，通过皮肤的代谢可以调节机体内部水分和其它物质的平衡，调节人体体温，并起到感知外界信息的作用。
因此，在皮肤再生材料的设计中，通常应模拟皮肤的表皮和真皮双层结构的特点，设计具有模拟表皮层和真皮层的双层结构。其中真皮层支架起到诱导皮肤真皮再生的作用；而表皮层覆盖物则起到隔离外界环境、避免细菌侵入、防止水分蒸发等作用。
在我国，每年因为烧伤、机械损伤或慢性皮肤溃疡而需要医治的患者高达数千万。因此开发出能有效促进创面愈合与皮肤组织再生的新型皮肤再生支架具有重要的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效促进创面愈合与皮肤组织再生的胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法。
本发明的胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架，由胶原-壳聚糖多孔支架和硅橡胶薄膜两部分组成。
胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架的制备方法，采用冷冻-冻干法，步骤如下，以下浓度均按质量计1)用浓度为0.3％～5％的乙酸溶液分别配制浓度为0.1％～1％的胶原溶液和壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，搅拌均匀真空脱泡，得胶原-壳聚糖混合溶液，其中壳聚糖溶液的含量为5％～50％；2)将胶原-壳聚糖共混液注入模具中，采用冷冻-干燥法，在-5℃～-50℃温度下冷冻成固体，得到胶原-壳聚糖三维多孔支架；3)将步骤2)所得的胶原-壳聚糖三维多孔支架先在80℃～130℃温度下真空干热物理交联处理，再于浓度为0.05％～1％戊二醛溶液中交联1～48小时，反复清洗后，再次冷冻、冻干；4)将生物相容性良好的胶粘剂以0.05～0.5mg/cm2的量均匀涂覆在厚度为0.05～0.5毫米的硅橡胶薄膜表面，然后将胶原-壳聚糖真皮支架放在涂覆胶粘剂的硅橡胶薄膜表面上，获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架。
上述的生物相容性良好的胶粘剂可以是α-氰基丙烯酸酯类胶粘剂、纤维蛋白胶或明胶。其中α-氰基丙烯酸酯类胶粘剂可以选用α-氰基丙烯酸丁酯或α-氰基丙烯酸辛酯。所说的胶原是I型胶原，可以是牛腱胶原、猪皮胶原、鼠尾胶原。
本发明中的胶原-壳聚糖真皮支架，其突出特点是以可生物降解的胶原蛋白为主要原料，添加少量壳聚糖起促进交联、增强与耐降解作用；通过控制冷冻干燥条件，得到具有特定微结构(孔径、孔隙率等)的多孔支架。在材料的选择上，来自于动物体的天然材料如胶原和壳聚糖比合成材料具有更大的优势。I型胶原是真皮细胞外基质(ECM)的主要成分，其分子结构中富含RGD肽，是细胞膜表面整合素(Integrin)的特异性配体，具有促进细胞粘附与生长的功能。I型胶原的来源丰富、提纯容易，免疫原性温和。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物，具有抗感染、止痛、促凝血和促进创面愈合的功能，且来源丰富。通过在胶原中添加少量壳聚糖，能够弥补胶原中氨基含量不足的问题，从而有利于胶原的交联，提高其耐降解性能和机械强度。试验表明该支架能够有效促进成纤维细胞和表皮细胞的生长；免疫原性温和，具有良好的组织相容性；动物体内实验发现能够血管化，即能够成活。这种多孔支架可作为组织生长的临时支架，促进创面肉芽组织、成纤维细胞、内皮细胞和表皮细胞在支架的多孔内生长。这些长入的组织或细胞会分泌出相应的细胞外基质进而分化成新的皮肤组织，促进受损皮肤的再生。与此同时，外源性的胶原/壳聚糖多孔膜会随着新生组织的不断发育而逐渐降解，并被机体吸收，最终得到的是与人体自身完全相似的真皮组织。
本发明选择硅橡胶薄膜作为表皮层的模拟物，因为硅橡胶具有良好的生物相容性，高的透气性和可控透湿性能，同时具有良好的弹性和临床易操作性等。这些特点赋予了硅橡胶薄膜的隔离功能、阻止细菌侵入功能、防止水分蒸发功能等，因此可以起到表皮层的功能，从而保证双层皮肤支架的实用性。
本发明的胶原-壳聚糖/硅橡胶复合多孔支架具有双层结构特征，其中胶原-壳聚糖多孔支架层可以诱导创面细胞的定向迁移、增殖及分化，原位诱导真皮组织的再生。而硅橡胶薄膜层具有阻止组织水分的挥发、保持创口湿润、防止细菌侵入等功能。生物相容性粘接剂可以实现胶原/壳聚糖多孔支架层和硅橡胶薄膜层的有效粘合，方便了手术的操作，增加了实用性。
本发明为深度烧伤和慢性皮肤溃疡病人的治疗提供了一种性能良好的皮肤替代物，可以显著促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，进而减轻病人的痛苦。可以广泛应用于烧伤创面、外科整形和爆发性紫癜等方面。本发明制备方法简单，材料来源广泛，生产效率高，适用于产业化生产。与国外同类产品相比，本发明产品成本方面具有很大优势。
图1是胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架整体外观照片；图2是胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架微结构图；图3是明胶为胶粘剂的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架细胞毒性评价结果；图4是α-氰基丙烯酸酯辛酯为胶粘剂的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架细胞毒性评价结果；图5是胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架对猪背全层皮肤缺损创面修复4周后的大体观察照片；图6是胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架猪背全层皮肤缺损创面修复4周后的组织切片图，标尺为200微米。
具体实施方法实施例1将胶原和壳聚糖分别溶于3％的乙酸溶液中，配制浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，其中壳聚糖的含量为10％，搅拌均匀真空脱泡；采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻2小时，然后冷冻干燥24小时。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联12h，于4℃下用0.25％的戊二醛溶液交联24h，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原-壳聚糖多孔支架。在厚约0.14mm的硅橡胶薄膜表面，将生物相容性良好的明胶胶粘剂以0.25mg/cm2的量均匀涂覆在硅橡胶薄膜表面，然后再将胶原-壳聚糖多孔支架轻轻放在涂覆明胶的硅橡胶薄膜表面上，即获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架。图1和图2分别为该复合皮肤再生支架的宏观形貌图和微观结构图。
实施例2将胶原和壳聚糖分别溶于3％的乙酸溶液中，配制浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，其中壳聚糖的含量为10％，搅拌均匀真空脱泡；采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻2小时，然后冷冻干燥24小时。冻干的胶原-壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联12h，于4℃下用0.25％的戊二醛溶液交联24h，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原-壳聚糖多孔支架。在厚约0.14mm的硅橡胶薄膜表面，将生物相容性良好的α-氰基丙烯酸酯辛酯胶粘剂以0.25mg/cm2的量均匀涂覆在硅橡胶薄膜表面，然后再将胶原-壳聚糖多孔支架轻轻放在涂覆胶的硅橡胶薄膜表面上，即获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架。
实施例3将胶原和壳聚糖分别溶于0.3％的乙酸溶液中，配制浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，其中壳聚糖的含量为5％，搅拌均匀真空脱泡；采用冷冻-冻干法，于-5℃冷冻成固体，然后冷冻干燥24小时。冻干的胶原/壳聚糖支架于80℃的真空干燥箱中真空干热交联12h，于4℃下用0.05％的戊二醛溶液交联1h，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原-壳聚糖多孔支架。在厚约0.05mm的硅橡胶薄膜表面，将生物相容性良好的α-氰基丙烯酸酯辛酯胶粘剂以0.05mg/cm2的量均匀涂覆在硅橡胶薄膜表面，然后再将胶原-壳聚糖多孔支架轻轻放在涂覆胶的硅橡胶薄膜表面上，即获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架。
实施例4将胶原和壳聚糖分别溶于3％的乙酸溶液中，配制浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，其中壳聚糖的含量为50％，搅拌均匀真空脱泡；采用冷冻-冻干法，于-50℃冷冻2小时，然后冷冻干燥24小时。冻干的胶原-壳聚糖支架于130℃的真空干燥箱中真空干热交联12h，于4℃下用1％的戊二醛溶液交联48h，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原-壳聚糖多孔支架。在厚约0.14mm的硅橡胶薄膜表面，将生物相容性良好的纤维蛋白胶粘剂以0.5mg/cm2的量均匀涂覆在硅橡胶薄膜表面，然后再将胶原-壳聚糖多孔支架轻轻放在涂覆胶的硅橡胶薄膜表面上，即获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架。
实施例5明胶为胶粘剂的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架的细胞毒性将实施例1得到的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架经环氧乙烷灭菌后，以添加了10％小牛血清、100单位/毫升青霉素和100单位/毫升的链霉素的DMEM培养液为浸提介质，4℃条件下浸提24小时。以该浸提液为培养液，观察成纤维细胞的活性随时间的变化(图3)，证明该双层皮肤再生支架没有细胞毒性。细胞活性采用3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)方法检测。
实施例6α-氰基丙烯酸酯辛酯为胶粘剂的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架的细胞毒性将实施例2得到的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架经环氧乙烷灭菌后，以添加了10％小牛血清、100单位/毫升青霉素和100单位/毫升的链霉素的DMEM培养液为浸提介质，4℃条件下浸提24小时。以该浸提液为培养液，观察成纤维细胞的活性随时间的变化(图4)，证明该双层皮肤再生支架没有细胞毒性。细胞活性采用3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)方法检测。
实施例7胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架的体外皮肤再生能力评价同实例1制备交联的胶原-壳聚糖支架。在厚约0.14mm的硅橡胶薄膜，将生物相容性良好的α-氰基丙烯酸酯辛酯胶粘剂以0.5mg/cm2的量均匀涂覆在硅橡胶薄膜表面，然后再将胶原/壳聚糖多孔支架轻轻放在涂覆胶的硅橡胶薄膜表面上，即获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架。该复合再生支架经环氧乙烷灭菌后，移植于猪背部全层皮肤缺损处，经常规打包包扎，分别于术后3、7、14、28天后评价创面愈合情况。图5为移植4周后创面的大体观察，图6为移植4周后的组织切片图，证明真皮组织已经长入支架中。
权利要求
1.胶原—壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架，其特征是由胶原—壳聚糖多孔支架和硅橡胶薄膜两部分组成。
2.根据权利要求1所述的胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架的制备方法，其特征是包括如下步骤，以下浓度均按质量计1)用浓度为0.3％～5％的乙酸溶液分别配制浓度为0.1％～1％的胶原溶液和壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，搅拌均匀真空脱泡，得胶原—壳聚糖混合溶液，其中壳聚糖溶液的含量为5％～50％；2)将胶原—壳聚糖共混液注入模具中，采用冷冻—干燥法，在-5℃～-50℃温度下冷冻成固体，冻干，得到胶原—壳聚糖三维多孔支架；3)将步骤2)所得的胶原—壳聚糖三维多孔支架先在80℃～130℃温度下真空干热物理交联处理，再于浓度为0.05％～1％戊二醛溶液中交联1～48小时，反复清洗后，再次冷冻、冻干；4)将生物相容性良好的胶粘剂以0.05～0.5mg/cm2的量均匀涂覆在厚度为0.05～0.5毫米的硅橡胶薄膜表面，然后将胶原—壳聚糖真皮支架放在涂覆胶粘剂的硅橡胶薄膜表面上，获得胶原—壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架。
3.根据权利要求2所述的胶原—壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架的制备方法，其特征是所说的生物相容性良好的胶粘剂是α-氰基丙烯酸酯类胶粘剂、纤维蛋白胶或明胶。
4.根据权利要求3所述的胶原—壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架的制备方法，其特征是α-氰基丙烯酸酯类胶粘剂选用α-氰基丙烯酸丁酯或α-氰基丙烯酸辛酯。
全文摘要
本发明公开了一种胶原－壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法。该皮肤再生支架由胶原/壳聚糖多孔支架和硅橡胶薄膜通过生物相容性良好的胶粘剂粘结而成。其中胶原/壳聚糖多孔支架可以有效诱导缺损组织处细胞的迁移、增殖和分化，原位诱导缺损真皮组织的再生；硅橡胶薄膜则起到了临时表皮层的作用，可以有效控制水分的挥发和防止细菌的侵入等，对创面起到了临时保护作用。本发明所制备的胶原－壳聚糖/硅橡胶复合支架具有良好的生物相容性，可控的降解速率和优异的创面修复能力，具有较良好的临床应用前景。
文档编号A61L27/60GK1785444SQ20051006187
公开日2006年6月14日 申请日期2005年12月7日 优先权日2005年12月7日
发明者高长有, 马列, 石延超, 沈家骢, 韩春茂 申请人:浙江大学