一种有序胶原材料及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种有序胶原材料及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是来源于动物结缔组织的一种材料，具有良好的生物相容性和可降解性，免疫源性比较低，有一定的机械支撑作用，经常被用来制作支架材料，应用于组织修复。胶原支架材料可以为损伤组织提供一定的支撑作用，有效促进细胞的粘附、增殖和迁移。在神经损伤部位植入特定取向性材料，能诱导损伤两端的神经细胞相向性增殖和迁移，减少细胞迁移的路径，促使神经元突触正确连接。这种有序性的多孔材料不仅能作为细胞移植的载体，也能携带生长因子促进组织损伤修复。
[0003]一些溶剂能结晶成骨针状结构，而且在结晶形成过程中，溶质并不参于结晶体的形成，而是被排斥在晶体的四周，通过低温干燥的方法将溶液冻干，便可形成一种中空纵向成孔的结构。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种有序胶原材料及其制备方法与应用。
[0005]本发明所提供的有序胶原材料的制备方法，具体可包括如下步骤:
[0006](1)将胶原膜用体积百分含量为3% -10% (如6% )的醋酸水溶液2-8°C (如4°C )浸泡48小时至2周的时间(如72小时)；
[0007]其中，所述胶原膜可剪碎处理，剪成大小约为1立方毫米的碎片；另外，在浸泡过程中可多次摇动。从而，促进所述胶原膜的溶解。
[0008](2)采用搅拌机进行间歇搅拌，每次搅拌时间为30秒，一次搅拌结束后放冰上5分钟再进行下一次搅拌，重复80-100次(如90次)(一次搅拌加上随后的一次冰上放置记为一次)；
[0009]该步骤是为了使所述胶原膜充分溶解。
[0010](3)冰上静置30分钟；
[0011](4)置于液氮中冷冻5-10分钟，取出后再置于-80°c继续冷冻2小时，然后真空冷冻干燥，得到胶原材料1 ;
[0012](5)用1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)对所述胶原材料1进行交联，得到胶原材料2 ；
[0013](6)洗涤所述胶原材料2，真空冷冻干燥，得到所述有序胶原材料。
[0014]在所述方法的步骤(5)中，对所述胶原材料1进行交联时，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)在交联体系中的终浓度为2mg/ml ;所述N-羟基丁二酰亚胺(NHS)在交联体系中的终浓度为lmg/ml。
[0015]在所述方法的步骤(5)中，对所述胶原材料1进行交联时的温度为37°C，时间为4h0
[0016]在所述方法的步骤(5)中，对所述胶原材料1进行交联时，所述交联体系中的溶剂为0.05M的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)水溶液。
[0017]更加具体的，步骤(5)中，所述“用1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)对所述胶原材料1进行交联”具体为:将EDC和NHS溶于0.05M的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)水溶液，至EDC的终浓度为2mg/ml，NHS的终浓度为lmg/ml，37°C反应4小时，然后利用水清洗10次，每次1小时。
[0018]在所述方法的步骤(1)中，在浸泡所述胶原膜前，所述体积百分含量为3% -10%的醋酸水溶液经过4°C预冷。
[0019]在所述方法的步骤(1)中，将所述胶原膜用所述体积百分含量为3% -10%的醋酸水溶液浸泡时，所述胶原膜和所述体积百分含量为3% -10%的醋酸水溶液的配比为3g:150ml ο
[0020]在所述方法的步骤(2)中，采用所述搅拌机进行间歇搅拌时的转速为5000rpm。
[0021]在本发明的一个实施例中，所述方法的步骤(3)具体为:将上下开口的塑料管(管口直径0.5cm-10cm,具体如1cm ;管长lcm-10cm,具体如3cm)立于铁质容器中，将步骤(2)处理后所得体系(胶原材料)注射到所述塑料管中，冰上静置30分钟。
[0022]相应的，所述方法的步骤(4)具体为:将所述铁质容器置于液氮中，冷冻5-10分钟(如7min)，再将所述塑料管取出，放于-80°C继续冷冻2小时，然后真空冷冻干燥，得到所述胶原材料1。
[0023]在本发明中，进行所述真空冷冻干燥时采用的真空冷冻干燥机具体为宁波新芝公司产品，其型号为SCIENTZ-30F。
[0024]在所述方法的步骤(6)中，对所述胶原材料2进行洗涤，具体为采用去离子水对所述胶原材料2进行洗涤。
[0025]在所述方法的步骤￠)中，在所述真空冷冻干燥后还包括辐照灭菌的步骤。在本发明的一个实施例中，所述辐照灭菌的剂量为8-15kGy (如12kGy)。
[0026]在本发明中，所述胶原膜为I型胶原(胶原纯度大于95 未进行化学交联处理)。具体是按照如下方法制备得到的:将牛皮肤剥离真皮部分，在1% (lg/100ml)的SDS(溶于水)溶液中处理48小时，用1% (体积分数)的Triton X-100 (Sigma，溶于水)处理24小时，1M Na0H(溶于水)处理8小时；用含有0.5?1.5mol/L NaCl和25?100mmol/L Tris-HCl (ρΗ7.6)的缓冲液处理 24 小时，0.5% (0.5g/100ml)的胰酶(Sigma,CAS#:8049-47-6,溶于PBS缓冲液)处理48小时，用去离子水清洗后，得到所述胶原膜。
[0027]利用以上所述方法制备得到的有序胶原材料也属于本发明的保护范围。
[0028]所述有序胶原材料在如下(a)-(d)任一中的应用也属于本发明的保护范围:
[0029](a)体外修复神经元；
[0030](b)体外促进神经干细胞向神经元分化，和/或引导神经元轴突定向延伸；
[0031](c)制备用于修复神经元的产品；
[0032](d)制备用于促进神经干细胞向神经元分化，和/或引导神经元轴突定向延伸的女口广叩ο
[0033]在上述(b)和(d)中，所述“引导神经元轴突定向延伸”中的“定向”为:沿着所述有序胶原材料的纤维排列方向。
[0034]实验证明，将神经细胞接种到本发明所提供的有序胶原材料上，能引导神经元轴突定向延伸。本发明所提供的有序胶原材料对于神经元的修复(神经损伤后神经元轴突再生)具有重要意义。
【附图说明】
[0035]图1为本发明制备的有序胶原材料的形态观察。A为宏观照片，B为扫描电镜照片。
[0036]图2为本发明制备的有序胶原材料促进神经元轴突延纤维方向延伸。神经元标志物MAP2的免疫染色呈绿色，神经元细胞核的Hochest33342染色呈蓝色。
[0037]图3为本发明制备的有序胶原材料促进神经干细胞向神经元分化后延纤维排列方向延伸。MAP2的免疫染色呈绿色，细胞核的Hochest33342染色呈蓝色。
【具体实施方式】
[0038]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040]胶原膜:1型胶原，胶原纯度大于95 未进行化学交联处理。在本发明中，所述胶原膜是按照如下方法制备得到的:将牛皮肤剥离真皮部分，在1% (lg/100ml)的SDS(溶于水)溶液中处理48小时，用1% (体积分数)的Triton X-100 (Sigma，溶于水)处理24小时，1M NaOH(溶于水)处理8小时；用含有0.5?1.5mol/L NaCl和25?100mmol/L Tris-HCl (pH7.6)的缓冲液处理 24 小时，0.5% (0.5g/100ml)的胰酶(Sigma,CAS#:8049-47-6,溶于PBS缓冲液)处理48小时，用去离子水清洗后，得到所述胶原膜。
[0041]搅拌机:飞利浦公司产品，其型号为HR2850。
[0042]真空冷冻干燥机:LABC0NC06L Freeze Dry System。
[0043]实施例1、有序胶原材料的制备及鉴定
[0044]—、有序胶原材料的制备
[0045]本实施例将以胶原膜为原始材料，制备有序胶原材料。具体如下:
[0046](1)称取3克胶原膜，剪碎至大小约为1立方毫米，加入150ml经4°C预冷的醋酸溶液(体积分数6%，溶剂为水)，4°C浸泡72h，期间多次摇动，促进所述胶原膜的溶解。
[0047](2)采用搅拌机充分搅拌(转速为5000