高品质穿心莲内酯组份的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，是将穿心莲药材粉碎后经甲醇回流提取、再经过水沉、反相色谱和亲水色谱的纯化制得穿心莲内酯组份，产物为淡黄色；其主要成分为穿心莲内酯，新穿心莲内酯，脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯。采用高效液相色谱外标法测定穿心莲内酯组份中四个主要内酯的含量占总质量的75％以上，其中穿心莲内酯占总内酯组份的41～44％，新穿心莲内酯占总内酯组份的14～21％，脱氧穿心莲内酯占总内酯组份的18～25％，脱水穿心莲内酯为余量。此方法具有工艺简单、易操作、成本低、可工业化生产等突出优点。
【专利说明】高品质穿心莲内酯组份的制备方法
【【技术领域】】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，涉及一种从穿心莲药材中提取分离高品质穿心莲内酯组份的方法，特别涉及一种依次用反相色谱、亲水色谱分离制备高品质穿心莲内酯组份的方法。
【【背景技术】】
[0002]穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f)Nees.是爵床科植物穿心莲的全草或叶，干燥地上部分入药。性寒味苦，具有消炎抗菌、凉血消肿功效，主治感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，热淋涩痛等，是重要的“中药抗生素”。穿心莲的主要化学成分为二萜内酯类化合物和黄酮类化合物，穿心莲叶主要为二萜内酯类化合物，其中含量最多的为穿心莲内酯(Andrographolide),还包括新穿心莲内酯(NeoandrographoIide)、脱氧穿心莲内酯(Deoxyandrographolide)和脱水穿心莲内酯(14-Deoxy-ll,12-didehydroandrographoIide)等，穿心莲根的主要活性成分为黄酮类化合物。
[0003]近年来对穿心莲的研究，主要集中于穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的提取分离、精制、衍生、含量测定等方面。穿心莲活性成分的提取常用的有渗漉法、浸溃法、碱水提取法、超声提取法及微波辅助提取法等；穿心莲活性成分的提纯常用的有活性炭脱色、正相溶剂萃取、Sehadex LH-20柱色谱、硅胶柱纯化等。而极少有研究是关于穿心莲内酯组份的提取精制。
[0004]目前市场上在售的穿心莲产品涵盖了片剂、胶囊、滴丸、注射液等多种剂型，其中穿心莲片和穿心莲胶囊是通过工艺提取制备得穿心莲浸膏，制成相应剂型；穿心莲滴丸的主要成分为穿心莲内酷。市场分析研究表明，穿心莲注射液在穿心莲广品中占有最大的市场份额。穿琥宁、炎琥宁、莲必治等穿心莲注射液`是以穿心莲内酯为原料，经过一定工艺制备而成，但临床试验及研究表明，其不稳定性和某些副作用导致曾辉煌一时的穿心莲注射液遭遇瓶颈期。喜炎平是穿心莲总内酯通过磺化而得的磺酸盐注射剂，由于其在治疗手足口病中的独特疗效，喜炎平广获市场认可，2011年销售量已经突破8000万支，又由于喜炎平抗炎、抗病毒的显著疗效及其可靠的安全性，已成为国内中药抗炎、抗病毒类药物的主要品种，未来市场空间巨大。
【
【发明内容】
】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0007]一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其具体步骤为:
[0008](I)回流提取:将穿心莲叶粉碎后用甲醇水溶液回流提取两次，合并两次提取液；
[0009]所述的甲醇水溶液的体积浓度为70~100%，用量为10~15倍量(v:m)；
[0010]所述的提取时间为每次I~3小时；[0011](2)水沉:直接向步骤(1)所得提取液中加入纯水稀释至甲醇体积浓度为30~80 %，充分搅拌后静置，过滤，取滤液；
[0012]所述的静置条件为:静置温度为O~4°C,静置时间为6~15小时；
[0013](3)反相色谱纯化:直接向步骤(2)所得滤液中加入纯水稀释后上样，进行反相色谱纯化；上样量与填料的质量比为1:20~1:80，依次用甲醇水溶液进行梯度洗脱，每次洗脱体积为2~5个柱体积；收集合并有效甲醇洗脱液，减压浓缩至近干得稠膏；
[0014]所述的甲醇水溶液的体积浓度为30~70% ；
[0015]所述的反相色谱填料粒径为5~60 μ m ;[0016](4)亲水色谱纯化:将步骤(3)所得稠膏用乙酸乙酯或乙腈溶解后进行亲水色谱纯化，上样量与填料质量比为1:3~1:6，依次用洗脱溶液进行梯度洗脱，每次洗脱体积为3~10个柱体积，收集合并有效洗脱液并减压浓缩，干燥得淡黄色穿心莲内酯组份干粉。
[0017]其中，淡黄色穿心莲内酯组份干粉的成分主要为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯，四种成分以外标法定量，含量占总质量的75%以上，其中穿心莲内酯占总内酯组份的41~44%，新穿心莲内酯占总内酯组份的14~21%，脱氧穿心莲内酯占总内酯组份的18~25%，脱水穿心莲内酯为余量。
[0018]所述的洗脱溶液为体积浓度为I~20%的甲醇-乙酸乙酯混合溶液或者乙腈、I%~15 %的甲醇-乙腈混合溶液。
[0019]所述的亲水色谱填料粒径为5~60 μ。
[0020]与现有技术相比，本发明的积极效果是:
[0021](I)穿心莲内酯组份纯度高:由于穿心莲药材总内酯含量高达1%~3%，本发明针对内酯组份特性，有选择性地进行提取分离，制备所得穿心莲总内酯组份的含量占总质量的75%以上。
[0022](2)溶剂利用率高，成本低:本发明通过四步操作完成对高品质穿心莲内酯组份的提取制备，前三步操作中向溶液中直接加水即可进行下一步操作，不存在溶剂倒换现象，溶剂利用率高，工业生产时可大幅降低成本。
[0023](3)反相及亲水色谱技术联用:依次利用反相及亲水色谱技术进行分离纯化，充分利用填料及内酯组份特性，达到高纯度的分离结果。
[0024](4)方法简单易行，操作简便:本发明涉及的制备高品质穿心莲内酯组份的方法，仪器自动化程度高，操作方便简单，可适用于大规模生产。
【【具体实施方式】】
[0025]以下提供本发明一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法的【具体实施方式】。
[0026]实施例1
[0027]IOg穿心莲叶适当粉碎后，每次加入6倍量80%甲醇溶液回流提取两次，每次2小时，合并墨绿色提取液。向所得提取液中直接加入一定量水稀释至甲醇体积浓度为60%，在4°C冰箱内静置10小时后过滤，得黄绿色滤液。
[0028]向所得滤液中直接加入水稀释至甲醇体积浓度为40%并平均分为两批进行反相色谱纯化。每批上样固体质量为0.96g，反相色谱填料质量为20g。先用3VB体积浓度为40%的甲醇将大部分强极性杂质及色素洗脱去除，然后依次用5VB体积浓度为55%的甲醇、2VB体积浓度为60%的甲醇对穿心莲主要内酯组份进行洗脱并收集，合并55%甲醇和60%甲醇洗脱液，减压浓缩至近干得稠膏，质量为0.57g。所得稠膏用IOmL乙酸乙酯溶解后进行亲水色谱纯化，亲水填料质量为3g。先用8VB甲醇-乙酸乙酯(5:95v:v)对穿心莲内酯，脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯组份进行洗脱并收集，再用4V B甲醇-乙酸乙酯(10:90v:v)对新穿心莲内酯进行洗脱并收集，合并所有洗脱液，减压浓缩后干燥得的最终产物淡黄色干粉，质量为0.35g。经高效液相色谱外标法测定，该组份中穿心莲总内酯含量占产物总质量的80 %，其中穿心莲内酯占总内酯组份的43 %，新穿心莲内酯占总内酯组份的14%，脱氧穿心莲内酯占总内酯组份的23%，脱水穿心莲内酯占总内酯组份的20%。
[0029]实施例2 [0030]20g穿心莲叶适当粉碎后，加入5倍量85%甲醇溶液回流提取两次，每次2.5小时，合并墨绿色提取液。向所得提取液中直接加入水稀释至甲醇体积浓度为50%，在4°C冰箱内静置9小时后过滤，得黄绿色滤液。
[0031]向所得滤液中直接加入水稀释至甲醇体积浓度为30%并将所得滤液平均分为四批进行反相色谱纯化。每批上样固体质量为0.98g，反相色谱填料质量为20g。先用3VB体积浓度为30%的甲醇将大部分强极性杂质及色素洗脱去除，然后依次用3VB体积浓度为55%的甲醇、3VB体积浓度为60%的甲醇对穿心莲主要内酯组份进行洗脱并收集，合并55%甲醇和60%甲醇洗脱液，减压浓缩至近干得稠膏，质量为1.2g。所得稠膏用20mL乙酸乙酯溶解后平均分成两批进行亲水色谱纯化，亲水色谱填料质量为3g。先用7VB甲醇-乙酸乙酯(5:95v:v)对穿心莲内酯，脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯组份进行洗脱并收集，再用5VB甲醇-乙酸乙酯(10:90v:v)对新穿心莲内酯进行洗脱并收集，合并所有洗脱液，减压浓缩后真空干燥得的最终产物淡黄色干粉，质量为0.64g。经高效液相色谱外标法测定，该组份中穿心莲总内酯含量占产物总质量的76%，其中穿心莲内酯占总内酯组份的43%，新穿心莲内酯占总内酯组份的17 %，脱氧穿心莲内酯占总内酯组份的21 %，脱水穿心莲内酯占总内酯组份的19%。
[0032]实施例3
[0033]15g穿心莲叶适当粉碎后，加入7倍量80%甲醇溶液回流提取两次，每次2小时，合并墨绿色提取液。向所得提取液中直接加入水稀释至甲醇体积浓度为65%，在4°C冰箱内静置12小时后过滤，得黄绿色滤液。
[0034]所得滤液中直接加入水稀释至甲醇体积浓度为40%并平均分为三批进行反相色谱纯化。每批上样固体质量为1.10g，反相色谱填料质量为20g。先用3VB体积浓度为40%的甲醇将大部分强极性杂质及色素洗脱去除，然后依次用4VB体积浓度为55%的甲醇、3VB体积浓度为60 %的甲醇对穿心莲主要内酯组份进行洗脱并收集，合并55 %甲醇和60 %甲醇的洗脱液，减压浓缩至近干得稠膏，质量为0.86g。所得稠膏用IOmL乙腈溶解后进行亲水色谱的纯化，亲水色谱填料质量为3g。先用8VB乙腈对穿心莲内酯，新穿心莲内酯，脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯组份进行洗脱并收集，再用4VB甲醇-乙腈(5:95v:v)对新穿心莲内酯进行洗脱并收集，合并所有洗脱液，减压浓缩后真空干燥得的最重产物淡黄色干粉，质量为0.45g。经高效液相色谱外标法测定，该组份中穿心莲总内酯含量占产物总质量的75%，其中穿心莲内酯占总内酯组份的44%，新穿心莲内酯占总内酯组份的21%，脱氧穿心莲内酯占总内酯组份的18%，脱水穿心莲内酯占总内酯组份的17%。[0035]实施例4
[0036]30g穿心莲叶适当粉碎后，加入5倍量90%甲醇溶液回流提取两次，每次2小时，合并墨绿色提取液。向所得提取液中直接加入水稀释至甲醇体积浓度为40%，在4°C冰箱内静置6小时后过滤，得黄绿色滤液。
[0037]将所得滤液平均分为六批进行反相色谱纯化。每批上样固体质量为1.20g,反相色谱填料质量为20g。先用4VB体积浓度为40%的甲醇将大部分强极性杂质及色素洗脱去除，然后依次用2VB体积浓度为55%的甲醇、3VB体积浓度为60%的甲醇对穿心莲主要内酯组份进行洗脱并收集，合并有效洗脱液，减压浓缩至近干得稠膏，质量为1.77g。所得稠膏用27mL乙腈溶解后平均分为三批进行亲水色谱纯化，亲水填料质量为3g。先用IOVB乙腈对穿心莲内酯，新穿心莲内酯，脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯组份进行洗脱并收集，再用4VB甲醇-乙腈(10:90v:v)对新穿心莲内酯进行洗脱并收集，合并所有洗脱液，减压浓缩后真空干燥得的最终产物淡黄色干粉，质量为1.05g。经高效液相色谱外标法测定，该组份中穿心莲总内酯含量占总质量的75%，其中穿心莲内酯占总内酯组份的41 %，新穿心莲内酯占总内酯组份的15 %，脱氧穿心莲内酯占总内酯组份的25 %，脱水穿心莲内酯占总内酯组份的19%。
[0038]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，其具体步骤为:(1)回流提取:将穿心莲叶粉碎后用甲醇水溶液回流提取两次，合并两次提取液；(2)水沉:直接向步骤(1)所得提取液中加入纯水稀释至甲醇体积浓度为30~80%，充分搅拌后静置，过滤，取滤液；(3)反相色谱纯化:直接向步骤(2)所得滤液中加入纯水稀释后上样，进行反相色谱纯化；上样量与填料的质量比为1:20~1:80，依次用甲醇水溶液进行梯度洗脱，每次洗脱体积为2~5个柱体积；收集合并有效甲醇洗脱液，减压浓缩至近干得稠膏；(4)亲水色谱纯化:将步骤(3)所得稠膏用乙酸乙酯或乙腈溶解后进行亲水色谱纯化，上样量与填料质量比为1:3~1:6，依次用洗脱溶液进行梯度洗脱，每次洗脱体积为3~10个柱体积，收集合并有效洗脱液并减压浓缩，干燥得淡黄色穿心莲内酯组份干粉。
2.如权利要求1所述的一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述的甲醇水溶液的体积浓度为70~100%，用量为10~15倍量。
3.如权利要求1所述的一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述的提取时间为每次I~3小时。
4.如权利要求1所述的一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，在所述步骤⑵中，所述的静置条件为:静置温度为O~4°C,静置时间为6~15小时。
5.如权利要求1所述的一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述的甲醇水溶液的体积浓度为30~70%。
6.如权利要求1所述的一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述的反相色谱填料粒径为5~60 μ m。
7.如权利要求1所述的一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述的淡黄色穿心莲内酯组份干粉的成分主要为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯。
8.如权利要求1所述的一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述的淡黄色穿心莲内酯组份干粉的成分主要为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯；穿心莲内酯占总内酯组份的41~44 %，新穿心莲内酯占总内酯组份的14~21%，脱氧穿心莲内酯占总内酯组份的18~25%，脱水穿心莲内酯为余量。
9.如权利要求1所述的一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，在所述步骤⑷中，所述的洗脱溶液为体积浓度为I~20%的甲醇-乙酸乙酯混合溶液或者乙腈、I%~15 %的甲醇-乙腈混合溶液。
10.如权利要求1所述的一种高品质穿心莲内酯组份的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)中,所述的亲水色谱填料粒径为5~60 μ m。
【文档编号】A61K36/19GK103585208SQ201310577892
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】金郁, 付青, 朱文亚, 梁鑫淼, 柯燕雄 申请人:华东理工大学