一种冰片鸦胆子油纳米乳及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种冰片鸦胆子油纳米乳及其制备方法，所述冰片鸦胆子油纳米乳主要由质量配比如下的原料以转相法制得：肉豆蔻酸异丙酯30~40份，含0.5%~2.0%（w/w）冰片的鸦胆子油30~40份，乳化剂CremopherRH40?15~20份，助乳化剂Labrasol?10~15份。本发明提供了一种可通过血脑屏障的冰片鸦胆子油纳米乳及其制备方法，制得冰片鸦胆子油纳米乳粒径分布均匀，油酸含量较高，稳定性较好，对大鼠胶质瘤具有较强的抑瘤作用，为鸦胆子油治疗脑胶质瘤剂型开发提供参考，为纳米乳新型给药系统的研究提供实验依据。
【专利说明】一种冰片鸦胆子油纳米乳及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种冰片鸦胆子油纳米乳及其制备方法。
【背景技术】
[0002]鸦胆子油(Bruceajavanica oil)为苦木科植物鸦胆子(Brucea javanica.L.Merr)的干燥成熟果实中提取得到的脂肪油，主要活性成分为不饱和脂肪酸——油酸和亚油酸，其中油酸含量达到60%。药理研究发现鸦胆子油有低毒、高效和抗癌谱广等诸多优点，用于治疗肺癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等肿瘤，还可用于抑制脑胶质瘤，并能降低颅内压，显示出良好的应用前景。主要上市制剂为注射用鸦胆子油乳剂，但由于乳剂属于多相的动力学不稳定分散体系，粒径较大，易发生破乳分层现象，并且由于血脑屏障导致鸦胆子油入脑药物浓度较低，因此其临床应用受到一定限制。
【发明内容】
[0003]本发明目的是针对鸦胆子油及其制剂目前存在的不足，提供一种新型制剂一冰片鸦胆子油纳米乳(Borneol and Brucea javanica oil nanoemulsion , BBNE)?
[0004]本发明采用的技术方案是:
一种冰片鸦胆子油纳米乳，主要由质量配比如下的原料以转相法制得:
肉豆蘧酸异丙酯30-40份
含0.5%~2.0% (w/w)冰片 的鸦胆子油30~40份
乳化剂 Cremopher RH4015~20 份
助乳化剂Labrasol10~15份。
[0005]上述处方为制备过程中所用的主要原料，不包括制备过程中所用的水。
[0006]优选的，其主要原料质量组成如下:
肉豆蘧酸异丙酯35%
含1.0%冰片的鸦胆子油35%
乳化剂 Cremopher RH4018%
助乳化剂Labrasol12%。
[0007]冰片(Borneol)是龙脑香科植物龙脑香树脂的提取物，《本草纲目》记载冰片有“引药上行”之功效，在许多中成药中常作为“药引”，特别是可以促进药物跨过血脑屏障，常作为脑部病变的引经药。因此在治疗脑胶质瘤剂型开发的过程中，冰片将是一种非常理想的辅料。
[0008]本发明还涉及所述的冰片鸦胆子油纳米乳的制备方法，所述方法包括:
(1)油相制备:将配方量的含冰片的鸦胆子油、乳化剂和助乳化剂加入肉豆蘧酸异丙酯中，搅拌均匀，得到油相；
(2)水相制备:以去离子水作为水相；
(3)纳米乳制备:向所得油相中缓慢滴加水相，边滴加边磁力搅拌，油相和水相的混合体系由澄清变为混浊再变为粘稠，继续滴加并搅拌直至最终恢复澄清，即得所述冰片鸦胆子油纳米乳。
[0009]水相的用量受到很多因素的影响(温度、气压、搅拌速度、仪器等)，最终用量以油相和水相的混合体系恢复澄清时为准(25°C，磁力搅拌速度为800 rXmirT1时，V水相:V油相=3飞:I，并具有稀释稳定性)。
[0010]本发明冰片鸦胆子油纳米乳采用转向法进行制备，并借助伪三元相图筛选纳米乳最佳处方和制备工艺，初步考察BBNE理化性质和对大鼠脑胶肿瘤的抑瘤作用，为鸦胆子油治疗脑胶质瘤剂型开发提供参考，为纳米乳新型给药系统的研究提供实验依据。
[0011]筛选获得冰片鸦胆子油纳米乳最佳处方为:油相IPM 35%，鸦胆子油(含1%冰片)35%，乳化剂Cremopher RH40 18%, Labrasol 12%，纳米乳外观呈圆整球形，平均粒径(47.60±0.57)nm，PDI 为(0.22±0.01)，Zeia 电位为(-L 06±0.12) mV，载药量(0.4241 ±0.0056)mg/mL。抑瘤实验显示，模型组、鸦胆子油注射剂组、鸦胆子油纳米乳组和冰片鸦胆子油纳米组的瘤重分别为(1.32±0.19) g、(0.84±0.08) g、(0.76±0.06) g、(0.57±0.10) g，肿瘤体积分别为(72.2±9.4)mm3、(44.2±5.1) mm3、(42.3±4.9) mm3、(27.9±2.5) mm3，鸦胆子油注射剂组、鸦胆子油纳米乳组和冰片鸦胆子油纳米组的肿瘤质量抑制率分别为36.49%, 42.80%, 56.94%。
[0012]本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了一种可通过血脑屏障的冰片鸦胆子油纳米乳及其制备方法，制得冰片鸦胆子油纳米乳粒径分布均匀，油酸含量较高，稳定性较好，对大鼠胶质瘤具有较强的抑瘤作用，为鸦胆子油治疗脑胶质瘤剂型开发提供参考，为纳米乳新型给药 系统的研究提供实验依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为油酸对照品、空白纳米乳、鸦胆子油纳米乳供试品溶液的GC色谱图；A:油酸对照品，B:空白纳米乳，C:鸦胆子油纳米乳。
[0014]图2为伪三元相图筛选乳化剂和助乳化剂及与油相的比例；A:SolutolHS15和正丁醇，B:SolutolHS15 和 Labrasol ，C:Cremopher RH40 和正丁醇，D:Cremopher RH40 和Labrasol, a:Km=3: I, b:Km=3: 2, c:Km=l: I。
[0015]图3为BBNE透射电镜照片。
[0016]图4为BBNE的粒径分布。
[0017]图5 为 BBNE 的 Zeta 电位。
[0018]图6为各组瘤重对比情况；A:模型组，B:阳性组，C:鸦胆子油纳米乳组，D =BBNE组。
[0019]图7为各组瘤体积对比情况；A:模型组，B:阳性组，C:鸦胆子油纳米乳组，D:BBNE组。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:I材料 1.1仪器
岛津GC-2010气相色谱仪(日本岛津公司)，JEM-1200EX透射电子显微镜(日本Hitachi公司),380 ZLS激光粒度测定仪(美国Nicomp公司),立体定位仪(日本Narishige公司)，Bio-RAD 680酶标仪(美国Bio-RAD公司)，ZEISS Axiovert 200荧光倒置显微镜(德国Carl Zeiss 公司)，Thermo Scientific Forma II 水套 CO2 培养箱(美国 Thermo 公司)，CP225D电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HZ-92125恒温振荡器(江苏太仓市科教器材厂)，DF-1OlS集热式恒温搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)，HJ-6B多头测速加热搅拌机(金坛市金伟实验仪器厂)，TGL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，pH仪(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。
[0021]1.2药品与试剂
鸦胆子油(江西省吉水县康民本草药用油提炼厂，批号0110914)；
油酸对照品(中国食品药品生物制品检定所，批号111621-201004)
冰片(浙江中医药大学中药饮片厂，批号101201)；
正己烷(美国TEDIA天地试剂公司，批号1203063)；
氟化硼乙醚(江苏永华粗细化学品有限公司，批号20120901)；
卵磷脂(国药集团化学试剂有限公司，批号20100601)；
Cremopher RH 40 (德国 BASF 公司，批号 79062488Q)；
Cremorpher EL (德国 BASF 公司，批号 61623988Q)；
SolutolHS15 (德国 BASF 公司，批号 27927024U)；
甘油(天津市永大化学试剂有限公司，批号20120308)；
PEG400 (上海浦东高南化工厂，批号:021032);
Labraso (法国 GATTEF0SSE 公司，批号 135760)；
肉豆蘧酸异丙酯IPM (阿拉丁化学试剂公司，批号47116)；
脑胶质瘤细胞株(中国科学院上海细胞研究所);
胰蛋白酶(美国Gibco公司)；
DMEM高糖培养液(吉诺生物医药技术有限公司)；
鸦胆子油注射乳(浙江九旭药业有限公司，批号20120510)；
其他试剂均为分析纯。
[0022]1.3实验动物
清洁级Wistar大鼠，体重(28(T300) g，雄性，由浙江中医药大学实验动物中心提供，SCXK (沪2007- 0005)。所有动物实验均按照浙江大学动物饲养和使用指南进行。
[0023]2 方法
2.1鸦胆子油GC分析方法
2.1.1鸦胆子油的衍生化方法鸦胆子油衍生化处理:取鸦胆子油适量，加正己烷10mL，精密量取5mL，置具塞试管中，用氮气吹干，加入0.5mol X I/1 KOH甲醇2mL，于65°C水浴皂化25min，放冷加15%三氟化硼乙醚2mL，于65°C水浴甲酯化15min，冰浴5min，加正己烷2mL，振摇2min，加饱和NaCl溶液ImL,使溶液上浮至瓶颈，取上层，加0.5g无水Na2SO4,振摇脱水，吸取上清液，即得。
[0024]2.1.2色谱条件
色谱柱:StabiIwax-DA (30X0.25mm,0.25mm) ；FID 检测器；进样口温度 250°C ;检测器温度250°C ;柱温170°C ;升温速率10°C Xmin—1，最终柱温220°C，保温3min ;载气为氮气，流速 0.SmLXmirT1 ;进样量 0.5 μ L0
[0025]2.1.3对照品和供试品溶液的配制
精密称取油酸对照品30mg，溶于IOmL正己烷，配制成含油酸3.0mgXmL—1的对照品贮备液。取冰片鸦胆子油纳米乳适量，加0.5g无水硫酸钠超声破乳30min。用石油醚萃取三次(4mL、2mL、2mL)后,合并石油醚层,用氮气吹干,加入正己烧2mL溶解,配制成供试品溶液。
[0026]2.1.4专属性考察
取油酸对照品贮备液、空白纳米乳、鸦胆子油纳米乳供试品溶液分别按照“2.1.1”项下衍生化方法处理后进样记录色谱图。
[0027]2.1.5标准曲线的制备
分别精密吸取油酸对照品贮备液0.5、1.0、1.5,2.0,2.5mL于IOmL容量瓶，然后按照“2.1.1”项下衍生化处理方法处理，分别制备成浓度为0.15,0.30,0.45,0.60,0.TSmgXmr1供进样的对照品溶液。每个样品取2μ L上样，重复进样6次，以峰面积A (mV*s)为纵坐标，浓度C (mgXmL—1)为横坐标绘制标准曲线。
[0028]2.1.6精密度和回收率试验
精密吸取对照品贮备液0.7,0.15,0.23mL于IOmL容量瓶，配制成低、中、高3个浓度分别为0.21,0.45,0.69 mgXmL—1的对照品溶液，然后按照“2.1.1”项下衍生化处理方法处理后进样测定，每个浓度连续测定5次，连续测定5 d，计算日内、日间精密度。分别取空白辅料适量，按相当于鸦胆子油中油酸含量的80%、100%、120%加入不同量的油酸对照品，按照“2.1.1”项下衍生化处理方法处理后进样测定，平行测定3次，计算加样回收率。
[0029]2.1.7稳定性和重复性试验
取同一样品溶液室温下放置，于0、2、4、8、12、24h测定，考察鸦胆子油稳定性。量取鸦胆子油约20mg，6份，分别溶于IOmL正己烷，精密量取，按照“2.1.1”项下衍生化处理方法处理后进样测定，计算RSD。
[0030]2.2冰片鸦胆子油纳米乳的制备
2.2.1纳米乳的制备方法
BBNE的制备采用转相法，将乳化剂和助乳化剂加入油相中，搅拌均匀，然后向混合体系中缓慢滴加水相(去离子水)，边加边磁力搅拌(800 rXmirT1)，开始时，体系为黏度较小的澄清油相，加入水相后体系变混浊，当水相水加到临界点时，体系会突然变为粘稠透亮，同时难以搅拌，此时为液晶相或凝胶相；继续滴加水相并不断搅拌，当水相加到一定量时，体系会突然变稀恢复澄清状态；形成水包油(0/W)型纳米乳，即所述冰片鸦胆子油纳米乳。
[0031]2.2.2绘制伪三元相图筛选处方
实验中以肉豆蘧酸异丙酯(IPM)作为油相，将乳化剂和助乳化剂按一定质量比(Km=3:1、3:2、1:1)混合，必要时水浴加热使固体或者半固体乳化剂溶化溶解，将乳化剂与助乳剂搅拌混合均匀后成为混合乳化剂(MS);取IPM与冰片鸦胆子油(含1%冰片，将冰片溶于鸦胆子油)混合均匀(1:1)成为油相混合物(OS)。将MS与OS分别按质量比(9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9)称取MS与OS，分别置于小烧杯中，25°C下，恒温磁力搅拌器搅拌使充分混匀。在搅拌状态下，用装有水相(去离子水)的微量注射器滴定以上的混合物体系，观察可能发生的变化，记录变“澄清透明”的相变化点及加入的水量。记录不同的MS与OS的比例,用Origin 8.0软件绘制伪三元相图，比较纳米乳区域面积的大小来进一步筛选冰片鸦胆子油纳米乳最佳处方。
[0032]在前期的预实验研究中，已经筛选确定了乳化剂与助乳化剂的组合分别是SolutolHS15 与正丁醇、Solutol HS15 与 Labrasol、Cremopher RH与正丁醇、Cremopher RH与 Labrasolο
[0033]2.2.3形态、粒径和Zeta电位的测定
取适量冰片鸦胆子油纳米乳滴于铜网上，静置10 min后用滤纸片吸干，再滴加2.0%磷钨酸溶液于铜网上负染5 min，自然挥干，用透射电子显微镜观察冰片鸦胆子油纳米乳。采用激光粒度测定仪测定冰片鸦胆子油纳米乳平均粒径和Zeta电位。
[0034]2.2.4载药量的测定
精密量取按照最优处方自制得到的BBNE 2mL，6份，置于50mL具塞洁净试管中，按照“2.1.3”和“2.1.1”项下方法处理后进样测定计算BBNE的载药量。
[0035]2.2.5稳定性试验
取按照最优处方自制得到的BBNE适量，分别用灭菌注射用水、5%葡萄糖注射液及0.9%氯化钠注射液稀释观察，并在不同时间点，测定其PH值及粒径，测试稀释稳定性。取适量冰片鸦胆子油纳米乳于3500 rXmirT1离心I h> 10000 rXmirT1离心20 min后，观察形态，测定粒径，测试离心稳定性。取适量冰片鸦胆子油纳米乳密封保存，于室温下放置，分别于
1、2、3、4个月后观察形态测定粒径，测试长期稳定性。
[0036]2.3冰片鸦胆子油纳米乳对大鼠脑胶质瘤抑瘤作用初步研究
2.3.1脑胶质瘤大鼠模型的建立
健康Wistar雄性大鼠30只，体重28(T300g，参照文献方法制作模型。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉。在立体定位仪引导下将微量加样器中的IXlO6个XmL—1大鼠胶质瘤细胞15 μ L细胞悬液缓慢注入大鼠右侧尾状核部位(针尖对准颅骨前因正中，将针尖向右移3mm、向后移1mm)。用骨腊封住颉骨开口，将颉顶皮肤缝合,用碘氟进行消毒。细胞接种完毕后，注意保持大鼠体温和呼吸道通畅，予以侧卧位放入鼠笼，直至大鼠恢复正常活动和饮食，饲养观察三周。
[0037]2.3.2动物分组与给药方案
选取生存状况良好造模成功大鼠24只，随机分为4组。A组:模型组(生理盐水);B组:阳性组，鸦胆子油注射剂GmLXkg-1X(T1)5C组:鸦胆子油纳米乳组(未加入冰片、其他同最优处方，2 mLXkfXcT1，折合鸦胆子油量)；D组:冰片鸦胆子油纳米乳组(按照最优处方自制得到)(2 mLXkfXcT1，折合鸦胆子油量)。分别大鼠尾静脉注射给药，连续给药一周，自由饮食饮水。
[0038]2.3.3抑瘤作用的评价
大鼠称重后颈椎脱白处死，解剖大鼠，取出完整脑组织，分离肿瘤块并称重，将肿瘤块用4%多聚甲醛固定，测量肿瘤长短径，按照公式分别计算各组肿瘤体积、各组肿瘤抑制率。
[0039]肿瘤体积=a2XbX X6—1 (a为肿瘤短径，b为肿瘤长径)肿瘤抑制率=(模型组平均瘤重一给药组平均瘤重)X模型组平均瘤重H X 100% (抑瘤率> 30%为肿瘤对药物敏感)。
[0040]3 结果
3.1鸦胆子油衍生化GC分析方法
3.1.1专属性考察
油酸对照品、空白纳米乳、鸦胆子油纳米乳供试品溶液气相进样得色谱图(图1)，可见杂质峰与油酸峰分离较好，且峰形良好，测定干扰较小，专一性良好，油酸的出峰时间为
11.5min 左右。
[0041]3.1.2标准曲线和方法学考察结果
油酸在0.15~0.7 mgXrnL—1范围内呈良好的线性关系，回归方程:A = 346583C -3039.5，r = 0.9999。低、中、高3种浓度的回收率分别为99.8%、98.3%、99.4% ;日内精密度RSD分别为0.14%、0.16%,0.5%，日间精密度RSD分别为1.1%、1.0%、1.5%。油酸的稳定性RSD为1.24% ;重复性RSD为1.26%，均符合方法学要求。
[0042]3.2冰片鸦胆子油纳米乳的制备
3.2.1最佳处方的确定
通过比较伪三元相图的区域面积，可以得到Cremopher RH40为乳化剂与Labrasol为助乳化剂，且乳化剂和助乳化剂的Km=3:2时区域面积最大，最终筛选BBNE的处方以IPM为油相，Cremopher RH40为乳化剂与Labrasol为助乳化剂,且乳化剂和助乳化剂的Km值为3:2。最佳处方为:油相IPM 35%、鸦胆子油(含1%冰片)35%、乳化剂Cremopher RH40 18%、Labrasol 12%。
[0043]3.2.2外观形态
BBNE负染后通过透射电镜观察形态，可见呈圆整球形、大小分布均匀、粒子相互之间分散无黏连。结果表明，按最佳处方成功制得的冰片鸦胆子油0/W型纳米乳。
[0044]3.2.3粒径及Zeta电位
BBNE平均粒径(47.60±0.57)nm，PDI为(0.22±0.01 )，粒径在纳米乳的最佳粒径范围内，粒径分布范围窄，利于纳米乳体系的稳定。
[0045]3.2.4油酸的含量
测定冰片鸦胆子油纳米乳中的油酸含量为0.42 mgXmL'
[0046]3.2.5 稳定性
考察了冰片鸦胆子油纳米乳(按最佳处方制得)与注射溶剂配伍后的稳定性、离心条件下稳定性及长期稳定性。在稀释过程中纳米乳的状态仍保持澄清带有淡蓝色乳光的均匀透明状态，且稀释后的纳米乳不分层、没有药物析出、无沉淀，说明其配伍稳定性好，且PH值接近中性，符合静脉注射的要求。在离心稳定性试验后，纳米乳均能保持均匀透明的稳定状态。长期存放下，纳米乳仍保持稳定状态，粒径无明显改变，纳米乳稳定性较好。
[0047]3.3冰片鸦胆子油纳米乳对大鼠脑胶质瘤抑瘤作用
称取各组瘤重，A、B、C、D组的瘤重分别为(1.32±0.19) g，(0.84±0.08) g，(0.76±0.06) g，(0.57±0.10) g，(图 6);计算 A、B、C、D 组的肿瘤体积分别为(72.2±9.4)mm3, (44.2±5.l)mm3，(42.3±4.9) mm3，(27.9±2.5) mm3 (图 7) ;B、C、D 组的肿瘤质量抑制率分别为36.49%，42.80%, 56.94%，结果表明B、C、D组对大鼠胶质瘤均有抑制作用，具有统计学差异，且D组对大鼠胶质瘤的抑制作用强于B、C组。
[0048]4 讨论
鸦胆子中的脂肪酸特别是长碳链脂肪酸极性较强，高温下不稳定，易发生聚合、脱酸、裂解等副反应，分析中易造成损失，难以直接进行气相色谱分析。因此，对脂肪酸的色谱分析进行脂肪酸衍生化处理，本实验采用三氟化硼乙醚进行甲酯化，在甲酯化的过程中，甲酯化时间和温度的变化均对油酸的测定产生一定的影响，在甲酯化时间为15分钟，甲酯化温度为65°C时，出峰峰面积最大，并且随着时间的延长和温度的升高，峰面积反而减小，因此，为了达到较好的衍生化效果，注意选择甲酯化时间和温度。 [0049]研究中采用绘制伪三元相图筛选乳化剂和助乳化剂，并确定最佳处方。在筛选处方中除了考虑纳米乳形成的区域面积外，还应该综合考虑乳化剂和助乳化剂用量少、粒径小、乳化速度快、稳定性高的原则。伪三元相图相对于正交设计和均匀设计筛选处方，虽然试验次数多，但是精度高，具有良好的预测性，可以直接获取较佳处方。相对于星点设计效应面优化法，仍有一定的缺点，特别是星点设计效应面优化法所建立的数学模型描绘效应面，可以通过在较优区域的多个效应所选择的较佳条件进行叠加，缩小较佳条件范围，因此BBNE处方可以运用星点设计效应面优化法做进一步的研究。研究中所制备BBNE粒径小、稳定性高、载药量大，可以归功于处方中IPM油相，能够将鸦胆子油相溶，使药物与各辅料相互溶解，从而增加系统的含药量；选择的Cremopher RH40和Labrasol,乳化能力强,纳米乳粒径小，保持很闻的稳定性。
[0050]实验初步考察BBNE的抑瘤作用，BBNE相对于鸦胆子油注射乳和鸦胆子油纳米乳，具有更强的抑瘤作用，初步验证冰片可以运用于治疗脑胶质瘤剂型设计中达到“引药上行”的功效，可能由于冰片能够促进药物跨血脑屏障，增加药物脑部靶向性，提高药物的治疗效果，在后期将做进一步药效研究。
【权利要求】
1.一种冰片鸦胆子油纳米乳，主要由质量配比如下的原料以转相法制得: 肉豆蘧酸异丙酯30-40份 含0.5%~2.0%冰片的鸦胆子油30-40份 乳化剂 Cremopher RH4015~20 份 助乳化剂Labrasol10~15份。
2.如权利要求1所述的冰片鸦胆子油纳米乳，其特征在于其主要原料质量组成如下: 肉豆蘧酸异丙酯35% 含1.0%冰片的鸦胆子油35% 乳化剂 Cremopher RH4018% 助乳化剂Labrasol12%。
3.权利要求1或2所述的冰片鸦胆子油纳米乳的制备方法，所述方法包括: 油相制备:将配方量的含冰片的鸦胆子油、乳化剂和助乳化剂加入肉豆蘧酸异丙酯中，搅拌均匀，得到油相； 水相制备:以去离子水作为水相； 纳米乳制备:向所得油相中缓慢滴加水相，边滴加边磁力搅拌，油相和水相的混合体系由澄清变为混浊再变为粘稠， 继续滴加并搅拌直至最终恢复澄清，即得所述冰片鸦胆子油纳米乳。
【文档编号】A61K9/107GK103610711SQ201310589308
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】李范珠, 王国伟, 徐骏军, 李颖芳, 魏颖慧, 郭曼曼, 徐秀玲 申请人:浙江中医药大学