一种吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物及其制备方法，具体地说，涉及一种由从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的含有多肽以及包括游离氨基酸和游离谷氨酸在内的多种氨基酸的脑蛋白水解物，以及该脑蛋白水解物的制备方法，属于生物制剂领域。本发明所提供的方法包括匀浆、丙酮两次脱脂、胰蛋白酶联合胃蛋白酶酶解等步骤。本发明所提供的方法制得的脑蛋白水解物中氨基酸的含量明显高于现有技术。
【专利说明】—种吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物及其制备
方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物及其制备方法，具体地说，涉及一种由从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的含有多肽以及包括游离氨基酸和游离谷氨酸在内的多种氨基酸的脑蛋白水解物，以及该脑蛋白水解物的制备方法，属于生物制剂领域。
【背景技术】
[0002]脑组织含有丰富的蛋白质，长期以来人们一直研究把动物脑组织中的蛋白质水解成氨基酸和低分子肽，用来治疗脑血管代偿不足所致的功能失调、中风、脑记忆障碍和脑外伤引起的功能紊乱、脑震荡后遗症等疾病。
[0003]脑蛋白水解物就是一种由动物脑组织经蛋白酶水解后得到的富含多种氨基酸和小分子多肽的混合物，由于含有大量人脑必须的氨基酸和多种神经生长的活性肽，可以调节和改进神经元的代谢，临床上，脑蛋白水解物主要用于治疗颅脑损伤和脑血管病(如脑梗和脑出血等)后遗症的恢复治疗，加速脑部神经系统的功能恢复。
[0004]其中以奥地利Ebewe制药厂研究的脑活素临床应用得较广泛。早于20世纪90年代初，国内学者便对其工艺、质量、药理药效及临床应用进行了研究，发表了大量的文章。
[0005]如申请号为94104516.1的中国专利申请公开了一种脑蛋白水解物的制备方法，采用匀浆、脱脂、风干、酶解、超滤、离子交换等步骤，该方法中风干步骤会造成多肽等物质的流失；申请号为01130523.1,200510064567.6,200710055421.4等中国专利申请公开了脑蛋白水解物的新的制备方法，上述方法中都存在使得氨基酸大量流失的步骤，因此，上述方法制得商榷；申请号为200610065169.0在制备脑蛋白水解物的过程中，加入了外源氨基酸，这也是目前临床应用的脑蛋白`水解物药物的基本情况，说明现有方法需要进一步改进；申请号为200410022091.5的中国专利公开了一种脑蛋白水解物制剂的制备方法，该方法是直接将脑组织匀浆液进行蛋白酶水解，并通过进一步加工得到脑蛋白水解物，这种工艺的缺点就是，在脑组织匀浆液中含有大量脂肪，影响蛋白酶的水解效果，制备效率低，同时，较多的脂肪类物质会混在最后的脑蛋白水解物中，影响最终药品的外观和稳定性。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的缺陷，本发明提供一种吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物。本发明所提供的脑蛋白水解物中不仅大分子物质含量低，游离脂肪酸含量低，且游离氨基酸含量高，生物活性高。
[0007]同时，本发明还提供所述的脑蛋白水解物的制备方法，其制备方法操作简单，适用于工业化大生产，并且产率高，可使企业获得较高的经济效益。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0009]—种吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物，其中，所述的脑蛋白水解物是采用如下方法制备得到的:
[0010]1)取除人以外的哺乳动物的脑组织，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的脑组织；
[0011]2)取干净的脑组织进行匀浆，每次匀浆2~3分钟，得到脑组织匀浆液；
[0012]3)向脑组织匀浆液中加入2.5~3.5倍体积的丙酮，搅拌25~35分钟，静置3.5~4.5小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣中加入1.5~2.5倍体积的丙酮，搅拌25~35分钟，静置3.5~4.5小时，过滤，滤渣在60~70°C下干燥3~5小时，得到脑蛋白粉；
[0013]4)取胰蛋白酶、无水氯化钙用冷纯化水溶解，配制成浓度为0.02%~0.04%g/ml的胰蛋白酶溶液，室温下放置1~2小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解，配制成浓度为0.02%~0.04%g/ml的胃蛋白酶溶液；
[0014]5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至40~45°C，加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40~45°C之间酶解3.5~4.5小时后，再加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40~45°C之间酶解1.5~2.5小时，酶解结束，加热至85~95°C、保温25~35分钟，然后降温至20~30°C，得到酶解液；
[0015]6)将所得的酶解液用离心机离心15~25分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至5.0~7.0 ;
[0016]7)将所得澄清液体进行浓缩、干燥、粉碎过筛，得到脑蛋白水解物干粉。
[0017]作为本发明所述的脑蛋白水解物的第一种优选方案，步骤4)中所述的无水氯化钙用量为胰蛋白酶用量的12~13wt%。
[0018]作为本发明所述的脑蛋白水解物的第二种优选方案，步骤5)中加入的活化好的胰蛋白酶的量为步骤2)的干净的脑组织总重量的2~3wt% ;加入的胃蛋白酶的量为步骤2)的干净的脑组织总重量的0.5~lwt%。
[0019]作为本发明所述的脑蛋白水解物的第三种优选方案，步骤5)中所述的胃蛋白酶在加入前先进行超声波预处理。
[0020]作为本发明所述的脑蛋白水解物的第四种优选方案，所述的超声波预处理为以超声功率为60~80W、超声频率为30~35kHz、超声时间与间歇时间比为1:1的超声波进行超声波预处理8~12min。
[0021 ] 本发明还进一步提供所述的吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备方法，该方法包括如下步骤:
[0022]1)取除人以外的哺乳动物的脑组织，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的脑组织；
[0023]2)取干净的脑组织进行匀浆，每次匀浆2~3分钟，得到脑组织匀浆液；
[0024]3)向脑组织匀浆液中加入2.5~3.5倍体积的丙酮，搅拌25~35分钟，静置
3.5~4.5小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣中加入1.5~2.5倍体积的丙酮，搅拌25~35分钟，静置3.5~4.5小时，过滤，滤渣在60~70°C下干燥3~5小时，得到脑蛋白粉；
[0025]4)取胰蛋白酶、无水氯化钙用冷纯化水溶解，配成浓度为0.02%~0.04%g/ml的胰蛋白酶溶液，室温下放置1~2小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解，配成浓度为0.02%~
0.04%g/ml的胃蛋白酶溶液；
[0026]5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至40~45°C，再加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40~45°C之间酶解3.5~4.5小时后，再次加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40~45°C之间酶解1.5~2.5小时，酶解结束，加热至85~95°C、保温25~35分钟，然后降温至20~30°C，得到酶解液；
[0027]6)将所得的酶解液用离心机离心15~25分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至5.0~7.0 ;
[0028]7)将所得澄清液体进行浓缩、干燥、粉碎过筛，得到脑蛋白水解物干粉。
[0029]作为本发明所述的制备方法的第一种优选方案，步骤4)中所述的无水氯化钙用量为胰蛋白酶用量的12~13wt%。
[0030]作为本发明所述的制备方法的第二种优选方案，步骤5)中加入活化好的胰蛋白酶的量为步骤2)的干净的脑组织总重量的2~3wt% ;加入胃蛋白酶的量为步骤2)的干净的脑组织总重量的0.5~lwt%。
[0031]作为本发明所述的制备方法的第三种优选，步骤7)中所述的浓缩为在70~80°C下浓缩至澄清液体原体积的1/4~1/2 ;所述的干燥为在70~80°C下干燥3~5小时；所述的过筛为过100目筛。
[0032]作为本发明所述的制备方法的第四种优选方案，步骤5)中所述的胃蛋白酶在加入前先进行超声波预处理；优选以超声功率为60~80W、超声频率为30~35kHz、超声时间与间歇时间比为1:1的超声波进行超声波预处理8~12min。
[0033]下面对本发明的技术方案作进一步的解释和说明:
[0034]本发明涉及一种吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物，该脑蛋白水解物中氨基酸的含量明显高于现有技术。`
[0035]本发明还涉及所述的脑蛋白水解物的制备方法，该方法为:取除人以外的哺乳动物的脑组织，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的脑组织；将干净的脑组织进行匀浆，每次匀浆2~3分钟，匀浆后向所得的脑组织匀浆液中加入丙酮，搅拌25~35分钟，静置
3.5~4.5小时，过滤，滤渣中再加入丙酮搅拌、静置，所得滤渣进行干燥，得到脑蛋白粉。本发明中，将干净的脑组织匀浆后向所得脑组织匀浆液中分两次加入丙酮脱脂，使丙酮脱脂更加高效、彻底，从而能更干净地去除脑组织中的脂肪等物质。
[0036]接下来，配制胰蛋白酶和胃蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶活化后待用。然后在用纯化水溶解并加热的脑蛋白粉溶液中先加入胰蛋白酶再加入胃蛋白酶进行酶解。本发明中，通过试验例表明先加入胰蛋白酶再加入胃蛋白酶进行酶解比其他方式加入进行酶解的氨基酸总量要高。因为，在整个酶解过程中，酶解初期底物浓度高，水解产物少，酶解速度快；酶解一段时间后，胰蛋白酶活力降低，这时再补加一部分胃蛋白酶，增加了酶的活力，从而使水解速度仍然保持较高的水平。
[0037]最后，将所得的酶解液离心，收集上清液，过滤，滤液浓缩、干燥、过筛得到脑蛋白水解物干粉。通过对酶解液的进一步精制和过滤等操作，从而使得到的脑蛋白水解物干粉中的杂质和脂肪等物质得以完全去除，保证了得到的脑蛋白水解物干粉的纯度。
[0038]作为本发明的一种优选方案，本发明的制备方法的步骤5)中所述的胃蛋白酶在加入前先进行超声波预处理；最优选以超声功率为60~80W、超声频率为30~35kHz、超声时间与间歇时间比为1:1的超声波进行超声波预处理8~12min。
[0039]将胃蛋白酶溶液在加入前进行超声波处理，可以改变胃蛋白酶的构象，使胃蛋白酶的活性中心充分暴露，增加底物一脑蛋白粉与胃蛋白酶结合的机会，加速反应，促进脑蛋白粉的水解，并最大限度地将脑组织中的有效成分提取出来。
[0040]本发明所提供的吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备方法适用于除人以外的哺乳动物如猪、狗、牛、羊、鹿、马、兔等动物的脑组织，从生产成本、生产工艺、产品质量稳定性、临床疗效等因素考虑，本发明所提供的吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备方法优选适用于猪脑组织。
[0041]与现有技术相比，本发明所提供的脑蛋白水解物中氨基酸的含量明显高于现有技术。
【具体实施方式】
[0042]以下为本发明的【具体实施方式】，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
[0043]实施例1、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0044](1)取新鲜健康的猪脑，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的猪脑；
[0045](2)取干净的猪脑10kg，加10L注射用水，使用高压匀浆泵进行匀浆，每次匀浆2分钟，得到脑组织匀浆液；
[0046](3)向脑组织匀浆液中加入2.5倍量的丙酮，搅拌25分钟，静置3.5小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣中加入 1.5倍量的丙酮，搅拌25分钟，静置3.5小时，过滤，滤渣在60 V下干燥3小时，得到脑蛋白粉；
[0047](4)取胰蛋白酶、无水氯化钙(其中无水氯化钙的用量为胰蛋白酶用量的12wt%)用冷纯化水溶解，配成浓度为0.02%g/ml的胰蛋白酶溶液，室温下放置1小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解，配成浓度为0.02%g/ml的胃蛋白酶溶液；
[0048](5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至40°C，按步骤2)的干净的猪脑总重量的2被％加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40°C之间酶解3.5小时后，再按步骤2)的干净的猪脑总重量的0.5wt%加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40°C之间酶解
1.5小时，酶解结束，加热至85°C、保温25分钟，然后降温至20°C，得到酶解液；
[0049](6)将所得的酶解液用离心机离心15分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至5.0 ;
[0050](7)将所得澄清液体在70°C下浓缩至澄清液体原体积的1/4、在70°C下干燥3小时、粉碎过100目筛，得到脑蛋白水解物干粉。
[0051]实施例2、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0052](1)取新鲜健康的猪脑，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的猪脑；
[0053](2)取干净的猪脑10kg，加10L注射用水，使用高压匀浆泵进行匀浆，每次匀浆2分钟，得到脑组织匀浆液；
[0054](3)向脑组织匀浆液中加入3.5倍量的丙酮，搅拌35分钟，静置4.5小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣中加入2.5倍量的丙酮，搅拌35分钟，静置4.5小时，过滤，滤渣在70°C下干燥5小时，得到脑蛋白粉；
[0055](4)取胰蛋白酶、无水氯化钙(其中无水氯化钙的用量为胰蛋白酶用量的13wt%)用冷纯化水溶解，配成浓度为0.04%g/ml的胰蛋白酶溶液，室温下放置2小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解，配成浓度为0.04%g/ml的胃蛋白酶溶液；
[0056](5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至45°C，按步骤2)的干净的猪脑总重量的3被％加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在45°C之间酶解4.5小时后，再按步骤2)的干净的猪脑总重量的lwt%加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在45°C之间酶解
2.5小时，酶解结束，加热至95°C、保温35分钟，然后降温至30°C，得到酶解液；
[0057](6)将所得的酶解液用离心机离心25分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至7.0 ;
[0058](7)将所得澄清液体在80°C下浓缩至澄清液体原体积的1/2、在80°C下干燥5小时、粉碎过100目筛，得到脑蛋白水解物干粉。
[0059]实施例3、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0060](1)取新鲜健康的猪脑，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的猪脑；
[0061](2)取干净的猪脑10kg，加10L注射用水，使用高压匀浆泵进行匀浆，每次匀浆2.5分钟，得到脑组织匀浆液；
[0062](3)向脑组织匀浆液中加入3倍量的丙酮，搅拌30分钟，静置4小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣中加入2倍量的丙酮，搅拌30分钟，静置4小时，过滤，滤渣在65°C下干燥4小时，得到脑蛋白粉；
[0063](4)取胰蛋白酶、无水氯化钙(其中无水氯化钙的用量为胰蛋白酶用量的12.5wt%)用冷纯化水溶解，配成浓度为0.03%g/ml的胰蛋白酶溶液，室温下放置1.5小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解，配成浓度为0.03%g/ml的胃蛋白酶溶液；
[0064](5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至42°C，按步骤2)的干净的猪脑总重量的2.5被％加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在42°C之间酶解4小时后，再按步骤2)的干净的猪脑总重量的0.8wt%加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在42°C之间酶解2小时，酶解结束，加热至90°C、保温30分钟，然后降温至25°C，得到酶解液；
[0065](6)将所得的酶解液用离心机离心20分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至6.0 ;
[0066](7)将所得澄清液体在75°C下浓缩至澄清液体原体积的1/3、在75°C下干燥4小时、粉碎过100目筛，得到脑蛋白水解物干粉。
[0067]实施例4、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0068] (1)取新鲜健康的猪脑，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的猪脑；
[0069](2)取干净的羊脑10kg，加10L注射用水，使用高压匀浆泵进行匀浆，每次匀浆2.8分钟，得到脑组织匀浆液；
[0070](3)向脑组织匀浆液中加入2.8倍量的丙酮，搅拌28分钟，静置3.8小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣加入1.8倍量的丙酮，搅拌28分钟，静置3.8小时，过滤，滤渣在62°C下干燥3.2小时，得到脑蛋白粉；
[0071](4)取胰蛋白酶、无水氯化钙(其中无水氯化钙的用量为胰蛋白酶用量的12.2wt%)用冷纯化水溶解,配成浓度为0.025%g/ml的胰蛋白酶溶液,室温下放置1.2小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解，配成浓度为0.025%g/ml的胃蛋白酶溶液；
[0072](5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至43°C，按步骤2)的干净的猪脑总重量的2.2被％加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在43°C之间酶解3.8小时后，再按步骤2)的干净的猪脑总重量的0.6wt%加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在43°C之间酶解1.8小时，酶解结束，加热至86°C、保温28分钟，然后降温至22°C，得到酶解液；
[0073](6)将所得的酶解液用离心机离心22分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至5.5 ;
[0074](7)将所得澄清液体在72°C下浓缩至澄清液体原体积的1/4、在72°C下干燥3.5小时、粉碎过100目筛，得到脑蛋白水解物干粉。
[0075]实施例5、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0076](1)取新鲜健康的猪脑，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的猪脑；
[0077](2)取干净的猪脑10kg，加10L注射用水，使用高压匀浆泵进行匀浆，每次匀浆2.8分钟，得到脑组织匀浆液；
[0078](3)向脑组织匀浆液中加入3.2倍量的丙酮，搅拌32分钟，静置4.2小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣中加入2.2倍量的丙酮，搅拌32分钟，静置4.2小时，过滤，滤渣在68°C下干燥4.8小时，得到脑蛋白粉；
[0079](4)取胰蛋白酶、无水氯化钙(其中无水氯化钙的用量为胰蛋白酶用量的12.8wt%)用冷纯化水溶解，配成浓度为0.03%g/ml的胰蛋白酶溶液，室温下放置1.8小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解，配成浓度为0.03%g/ml的胃蛋白酶溶液；
[0080](5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至44°C，按步骤2)的干净的猪脑总重量的2.8被％加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在44°C之间酶解4.2小时后，再按步骤2)的干净的猪脑总重量的0.8wt%加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在44°C之间酶解2.3小时，酶解结束，加热至92°C、保温33分钟，然后降温至28°C，得到酶解液；
[0081](6)将所得的酶解液用离心机离心23分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至6.5 ;
[0082](7)将所得澄清液体在78°C下浓缩至澄清液体原体积的1/2、在78°C下干燥4.8小时、粉碎过100目筛，得到脑蛋白水解物干粉。
[0083]实施例6、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0084](1)取新鲜健康的猪脑，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的猪脑；
[0085](2)取干净的猪脑10kg，加10L注射用水，使用高压匀浆泵进行匀浆，每次匀浆2.8分钟，得到脑组织匀浆液；
[0086](3)向脑组织匀浆液中加入3.4倍量的丙酮，搅拌33分钟，静置4.4小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣中加入2.2倍量的丙酮，搅拌32分钟，静置4.2小时，过滤，滤渣在68°C下干燥4.8小时，得到脑蛋白粉；
[0087](4)取胰蛋白酶、无水氯化钙(其中无水氯化钙的用量为胰蛋白酶用量的12.8wt%)用冷纯化水溶解，配成浓度为0.03%g/ml的胰蛋白酶溶液，室温下放置1.8小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解，配成浓度为0.03%g/ml的胃蛋白酶溶液；
[0088](5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至41°C，按步骤2)的干净的猪脑总重量的2.8被％加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在41°C之间酶解4.2小时后，再按步骤2)的干净的猪脑总重量的0.8wt%加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在44°C之间酶解2.3小时，酶解结束，加热至92°C、保温33分钟，然后降温至28°C，得到酶解液；
[0089](6)将所得的酶解·液用离心机离心23分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至6.5 ;
[0090](7)将所得澄清液体在78°C下浓缩至澄清液体原体积的1/2、在78°C下干燥4.8小时、粉碎过100目筛，得到脑蛋白水解物干粉。
[0091]实施例7、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0092]具体步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤5)的胃蛋白酶在加入前先进行超声波预处理，所述的超声波预处理为以超声功率为60W、超声频率为30kHz、超声时间与间歇时间比为1:1的超声波进行超声波预处理8min。
[0093]实施例8、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0094]具体步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤5)的胃蛋白酶在加入前先进行超声波预处理，所述的超声波预处理为以超声功率为80W、超声频率为35kHz、超声时间与间歇时间比为1:1的超声波进行超声波预处理12min。
[0095]实施例9、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0096]具体步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤5)的胃蛋白酶在加入前先进行超声波预处理，所述的超声波预处理为以超声功率为70W、超声频率为32kHz、超声时间与间歇时间比为1:1的超声波进行超声波预处理lOmin。
[0097]实施例10、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0098]具体步骤同实施例5，与实施例5不同的是步骤5)的胃蛋白酶在加入前先进行超声波预处理，所述的超声波预处理为以超声功率为75W、超声频率为33kHz、超声时间与间歇时间比为1:1的超声波进行超声波预处理9min。
`[0099]实施例11、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0100]其它同实施例1，所不同的是所用的脑组织为狗脑。
[0101]实施例12、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0102]其它同实施例1，所不同的是所用的脑组织为牛脑。
[0103]实施例13、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0104]其它同实施例1，所不同的是所用的脑组织为羊脑。
[0105]实施例14、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0106]其它同实施例1，所不同的是所用的脑组织为马脑。
[0107]实施例15、吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备
[0108]其它同实施例1，所不同的是所用的脑组织为兔脑。
[0109]试验例1、脱脂方法对脑蛋白粉质量的影响
[0110]脑蛋白粉质量优劣是酶解反应成功与否的关键。若脱脂不够彻底，脑蛋白粉含脂肪高，会导致水解反应难于进行，水解体系呈混浊悬浮体，给后面分离步骤带来很大的麻烦，水解液中氨基酸、低分子肽含量也低。脂肪去除得越干净，蛋白质反应中心暴露得越充分，利于酶解反应的进行，水解终点明显，固液易于分离。该试验例以脑蛋白粉中脂肪的含量为检测指标，考察了不同的脱脂方法对脑蛋白粉质量的影响。
[0111]各样品按照以下方法制得:
[0112]样品1:按照本发明实施例1的步骤(1)- (3)制得的脑蛋白粉；
[0113]样品2:取新鲜健康的猪脑，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的猪脑；取干净的猪脑lOKg，加10L注射用水，使用高压匀浆泵进行匀浆，每次匀浆2分钟，得到脑组织匀浆液；向脑组织匀浆液中加入3倍量丙酮浸泡，搅拌，于_5°C放置20小时，过滤，再用3倍量丙酮浸泡，反复3次，挥去丙酮，于60°C干燥5小时，粉碎，得到脑蛋白粉。
[0114]分析方法:采用索氏抽提法测定各样品中脂肪的含量。结果见表1所示。
[0115]表1、不同脱脂方法得到的脑蛋白粉中脂肪的含量
[0116]
【权利要求】
1.一种吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物，其特征在于，所述的脑蛋白水解物是采用如下方法制备得到的:1)取除人以外的哺乳动物的脑组织，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的脑组织；2)取干净的脑组织进行匀浆，每次匀浆2~3分钟，得到脑组织匀浆液；3)向脑组织匀浆液中加入2.5~3.5倍体积的丙酮，搅拌25~35分钟，静置3.5~4.5小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣中加入1.5~2.5倍体积的丙酮，搅拌25~35分钟，静置3.5~4.5小时，过滤，滤渣在60~70°C下干燥3~5小时，得到脑蛋白粉；4)取胰蛋白酶、无水氯化钙用冷纯化水溶解，配制成浓度为0.02%~0.04%g/ml的胰蛋白酶溶液，室温下放置1~2小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解,配制成浓度为0.02%~0.04%g/ml的胃蛋白酶溶液；5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至40~45°C，加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40~45°C之间酶解3.5~4.5小时后，再加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40~45°C之间酶解1.5~2.5小时，酶解结束，加热至85~95°C、保温25~35分钟，然后降温至20~30°C，得到酶解液；6)将所得的酶解液用离心机离心15~25分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至5.0~7.0 ;7)将所得澄清液体进行浓缩、干燥、粉碎过筛，得到脑蛋白水解物干粉。
2.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物，其特征在于，步骤4)中所述的无水氯化钙的用量为胰蛋白酶用量的12~13wt%。
3.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物，其特征在于，步骤5)中加入的活化好的胰蛋白酶的量为步骤2)的干净的脑组织总重量的2~3wt% ;加入的胃蛋白酶的量为步骤2)的干净的脑组织总重量的0.5~lwt%。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的脑蛋白水解物，其特征在于，步骤5)中所述的胃蛋白酶在加入前先进行超声波预处理。
5.根据权利要求4所述的脑蛋白水解物，其特征在于，所述的超声波预处理为以超声功率为60~80W、超声频率为30~35kHz、超声时间与间歇时间比为1:1的超声波进行超声波预处理8~12min。
6.—种权利要求1所述的吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤:1)取除人以外的哺乳动物的脑组织，自然缓化至无冰渣，剔除杂质，得到干净的脑组织；2)取干净的脑组织进行匀浆，每次匀浆2~3分钟，得到脑组织匀浆液；3)向脑组织匀浆液中加入2.5~3.5倍体积的丙酮，搅拌25~35分钟，静置3.5~4.5小时，过滤，得丙酮渣；再向丙酮渣中加入1.5~2.5倍体积的丙酮，搅拌25~35分钟，静置3.5~4.5小时，过滤，滤渣在60~70°C下干燥3~5小时，得到脑蛋白粉；4)取胰蛋白酶、无水氯化钙用冷纯化水溶解，配成浓度为0.02%~0.04%g/ml的胰蛋白酶溶液，室温下放置1~2小时活化；胃蛋白酶用冷纯化水溶解,配成浓度为0.02%~0.04%g/ml的胃蛋白酶溶液；5)取脑蛋白粉，加入纯化水，搅拌均匀，加热至40~45°C，加入活化好的胰蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40~45°C之间酶解3.5~4.5小时后，再加入胃蛋白酶，搅拌均匀，控制温度在40~45°C之间酶解1.5~2.5小时，酶解结束，加热至85~95°C、保温25~35分钟，然后降温至20~30°C，得到酶解液；6)将所得的酶解液用离心机离心15~25分钟，收集上清液，过滤得到澄清液体，控制澄清液体的pH值至5.0~7.0 ;7)将所得澄清液体进行浓缩、干燥、粉碎过筛，得到脑蛋白水解物干粉。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述的无水氯化钙的用量为胰蛋白酶用量的12~13wt%。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中加入活化好的胰蛋白酶的量为步骤2)的干净的脑组织总重量的2~3wt% ;加入胃蛋白酶的量为步骤2)的干净的脑组织总重量的0.5~lwt%。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤7)中所述的浓缩为在70~80°C下浓缩至澄清液体原体积的1/4~1/2 ;所述的干燥为在70~80°C下干燥3~5小时；所述的过筛为过100目筛。
10.根据权利要求6~9任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述的胃蛋白酶在加入前先进行超声波预处理；优选以超声功率为60~80W、超声频率为30~35kHz、超声时间与间歇 时间比为1:1的超声波进行超声波预处理8~12min。
【文档编号】A61K35/30GK103656607SQ201310692429
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】郭智华 申请人:弘美制药（中国）有限公司