白藜芦醇甙在制备治疗慢性酒精中毒脑损伤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了白藜芦醇甙在制备治疗慢性酒精中毒脑损伤药物中的应用。本发明的技术方案要点为：白藜芦醇甙或者其与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐或者含有它们中任何一种的药物组合物与可药用辅料用于制备治疗或预防慢性酒精中毒脑损伤中记忆减退的药物。本发明的白藜芦醇甙具有神经保护的作用，能够明显改善慢性酒精中毒模型大鼠的神经损伤和降低慢性酒精中毒模型大鼠海马区Cdk5的表达。
【专利说明】白藜芦醇甙在制备治疗慢性酒精中毒脑损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，具体涉及白藜芦醇甙或白藜芦醇在制备治疗慢性酒精中毒脑损伤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]酒精中毒是当今世界严重的社会问题和医学问题，与酒精中毒和酒精滥用相关的健康、心理和社会问题已成为当前重大的公共卫生问题之一。酒精中毒对神经系统最大的危害是酒精对神经细胞的毒性作用以及对学习记忆的损害，在哺乳动物脑内，海马(Hippocampus)是神经元可塑性的重要区域，与学习记忆的形成密切相关，同时，海马也是酒精累及的敏感部位，因此本研究选取大鼠海马作为研究慢性酒精中毒对学习与记忆影响的部位。
[0003]酒精造成中枢神经系统损害的机制比较复杂，目前主要集中于以下三方面的研究:1、酒精导致神经元凋亡；2、酒精干扰神经递质传导，酒精影响的主要神经递质通路包括Y-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、谷氨酸、胆碱能系统等；3、酒精相
关基因。
[0004]细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5 (cyclin-dependent kinase 5, Cdk5)于1992年被多个实验室先后发现，因其具有与其它细胞周期依赖性蛋白成员同源的序列而得名。Cdk5几乎存在于整个中枢和外周神经系统的神经元中，在一些大神经元如海马的锥体细胞、皮层神经元等表达更高。Cdk5基因定位于7号染色体，具体为7q36，是一个3.95 kb长度的DNA序列。它含有12个外显子，控制987 bp的转录。Cdk5蛋白的分子量为33kDa。单体Cdk5无活性，当与其激活因子结合之后，Cdk5特异性磷酸化其底物蛋白的丝氨酸和苏氨酸位点。Odk5的激活蛋白主要包括神经元特异的p35和p39蛋白。p35主要分布于大脑皮层，而P39主要分布于小脑，它们在钙离子和钙调蛋白参与的情况下，随着细胞内钙离子浓度的升高而分别水解成P25和p29，这四者作为激活蛋白可与Cdk5形成异源二聚体而产生活性。在神经系统发育及成熟阶段，Cdk5通过磷酸化细胞骨架蛋白、信号分子以及调节蛋白等众多底物蛋白的特异性丝/苏氨酸位点，而在神经元的迁移分化、存活和突触的发生、信息传递、可塑性等诸多方面起到了重要的作用。此外，在一些病理条件下，P35的病理性剪切和Cdk5/p25的形成所导致的Cdk5活性失调及其亚细胞分布改变则促进了神经元的凋亡或死亡，参与了阿尔茨海默氏病(Alzheimer’ s disease, AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease, HD)以及脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等众多神经退行性疾病的发生发展过程。已有的研究表明，Cdk5广泛参与学习记忆过程，如Fischer等发现，在训练前或训练后即刻在小鼠的侧脑室、侧间隔及海马通过微导管注入Cdk5的抑制剂丁内酯I或细胞周期蛋白B激酶抑制剂roscovitine会明显损害情景条件性恐惧而不影响听觉条件性恐惧，在24小时记忆测试前注入则不会有这样的结果，提示这些部位的Cdk5在训练时期参与了关联性学习的巩固。同样，有实验证实在小鼠海马区通过微导管注入丁内酯I或roscovitine有利于情景恐惧记忆的消除。Tanaka等在转基因动物模型中也得到了一致的结果。Ohshima等在Cdk5的激活蛋白p35敲除的小鼠模型中进行Morris水迷宫行为学测试，发现敲除小鼠表现出空间学习能力缺陷及长时程抑制(long-term depression, LTD)的受损，而在激活蛋白p25短暂表达增多的转基因小鼠中学习能力和长时程增强(long-term potentiation,LTP)都得到增强。因此可以推断Cdk5在学习记忆中起着重要的作用。另外，多方面的研究也证实Cdk5和药物成瘾密切相关，我们先前的研究也证实Cdk5与酒精暴露有密切的关系O [0005]目前，市场上存在的治疗慢性酒精中毒的药物都存在一定的局限性。如戒酒硫(Disulfiram)能干扰酒精的代谢过程，喝少量酒就会引起恶心、呕吐、意识模糊和呼吸困难；环丙甲羟二羟吗啡酮(Naltrexone)能减少对酒精的依赖，但存在较大副作用，需在医生指导下使用；苯并二氮卓(Benzodiazepine)是抗焦虑药物，常用于治疗戒酒症状如焦虑和失眠，也用来预防癫痫发作和谵妄，应用它们时要小心，因为它们也有成瘾性；三环类抗抑郁药物可以用来控制任何原因引起的焦虑和抑郁，但是由于这些症状随着戒酒有可能消失，因此直到戒酒后如仍存在这些症状才使用此类药物。
[0006]白藜芦醇甙(Polydatin，PD)是从植物中提取的天然化学物质，即羟基二苯乙烯类化合物，其化学名称为3，4’，5-三羟基芪-3- β -D-葡萄糖苷(C2tlH22O8, 3，4’，5-trihydrox-ystibene-3- β -mono-D-glucoside),目前至少已经在70余种植物中发现了白藜芦醇式，研究表明白藜芦醇甙具有多方面的药理作用，如对抗局部缺血再灌注、保护心肌细胞的作用、保护血管平滑肌细胞、抗血小板聚集、改善微循环，还能够减轻多种因素造成的组织器官损伤，并且白藜芦醇甙还具有保护神经的作用。
[0007]据此，我们研究了白藜芦醇甙对慢性酒精中毒的神经保护作用及其与Cdk5的关系，白藜芦醇甙具有神经保护的作用，能够明显改善慢性酒精中毒模型大鼠的神经损伤和降低慢性酒精中毒模型大鼠海马区Cdk5的表达。
【发明内容】
[0008]本发明解决的技术问题在于提供白藜芦醇甙的新用途，即在制备慢性酒精中毒脑损伤药物中的新应用。
[0009]本发明的技术方案为:白藜芦醇甙或白藜芦醇在制备治疗或预防慢性酒精中毒脑损伤中记忆减退的药物中的应用。
[0010]本发明所述的白藜芦醇甙或者其与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐或者含有它们中任何一种的药物组合物与可药用辅料用于制备治疗或预防慢性酒精中毒脑损伤中记忆减退的药物。
[0011]本发明所述的白藜芦醇或者其与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐或者含有它们中任何一种的药物组合物与可药用辅料用于制备治疗或预防慢性酒精中毒脑损伤中记忆减退的药物。
[0012]本发明的动物实验中，学习记忆测试结果显示慢性酒精中毒大鼠训练成绩较正常大鼠明显下降，而高低剂量的白藜芦醇甙对慢性酒精中毒大鼠的学习记忆能力均有保护作用；免疫荧光结果显示慢性酒精中毒大鼠海马区Cdk5阳性细胞明显增加，而用药组，尤其高剂量组阳性细胞数目减少；XTT结果显示，高低剂量白藜芦醇甙对原代培养海马神经元细胞均具有保护作用；WeStern blot结果表明酒精处理后海马神经元细胞Cdk5蛋白表达水平明显升高，而高低剂量白藜芦醇甙与酒精共同作用于海马神经元细胞可以使Cdk5蛋白表达水平明显下降；Cdk5激酶活性测定显示，酒精处理后原代培养海马神经元细胞Cdk5激酶活性与对照组相比明显升高(P〈0.01)，而高低剂量白藜芦醇甙可以使Cdk5激酶活性明显下降。这说明白藜芦醇甙确实对慢性酒精中毒引起的脑细胞损伤具有保护作用，这种作用可以降低大鼠海马区Cdk5蛋白的表达。
[0013]说明书附图
图1是Y-迷宫检测酒精处理对大鼠空间学习记忆改变的影响，图2是免疫荧光检测大鼠海马组织Cdk5蛋白表达情况，图3是Western blot法检测大鼠海马原代培养神经元Cdk5表达情况，图4是Cdk5激酶活性的比较。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例白藜芦醇甙对慢性酒精中毒大鼠学习记忆及海马Cdk5表达的影响。
[0015]一、材料与方法
1、白藜芦醇甙的提取
虎杖粗粉水煎、过滤、浓缩；体积分数为95%的乙醇溶解过滤除杂质，回收乙醇；用乙酸乙脂萃取4次，合并萃取液；减压回收乙酸乙脂至浸膏状，用稀乙醇溶解，放置，过滤，析出物为白色针状晶体，难溶于水，为白藜芦醇式。
[0016]2、药品及试剂
兔抗鼠Cdk5多克隆抗体:北京博奥森；Cy3标记羊抗兔IgG，DAPI，抗荧光淬灭封片液:碧云天；四氮唑盐复合物(XTT): Sigma ；HRP标记羊抗兔IgG:中杉金桥。
[0017]3、动物及分组
清洁级雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠,体重200g_220g,由郑州大学动物中心提供,许可证号:SCXk (豫)2005-0001，随机分为4组(/7=10):A正常组、B酒精中毒模型组、C酒精+低剂量白藜芦醇甙组、D酒精+高剂量白藜芦醇甙组。
[0018]4、慢性酒精中毒模型的建立
米用被广泛使用的双瓶自由选择法(2-bottle free-choice procedures betweenwater and ethanol (EtOH))制备慢性酒精中毒大鼠模型,分为三个阶段:糖水递减诱导阶段、双瓶选择测试(Two-bottle choice tests)阶段、强制供应阶段。
[0019]5、给药
第9周开始，C、D组大鼠继续饮酒的同时，每天上午9点分别以质量浓度为0.1%、0.4%的白藜芦醇甙生理盐水溶液(2 ml/kg)灌胃，A组、B组以等体积生理盐水灌胃，连续灌胃10 cL
[0020]6、电刺激Y迷宫任务 Y-迷宫法检测大鼠的学习记忆。以10次电刺激后有9次做出正确反应为学会，用大鼠学会所需训练的次数来表示其空间分辩反应的学习记忆成绩。训练次数越少，说明大鼠学习能力越强。所有学习记忆测试均于晚间安静、暗光下进行。
[0021]7、荧光免疫检测法大鼠经Zoletil 50? (10 mg/kg, 1.ρ.)麻醉后处死，50mM磷酸盐缓冲液(PBS)灌注，4%多聚甲醛固定，断头取脑。将鼠脑置于特制大鼠脑分割槽内，自视交叉处切开，取视交叉后脑组织于恒温冷冻切片机内切成8μπι切片，贴于防脱载玻片上；微波修复15分钟，山羊血清封闭20分钟；加入兔抗鼠Cdk5多克隆抗体(I: 100), 4°C过夜；加入Cy3标记羊抗兔IgG (I: 500)，室温放置2小时；DAPI核复染3分钟；抗荧光淬灭封片液封片；倒置荧光显微镜(Leica DMRXA)观察并拍照。
[0022]8、Cdk5激酶活性检测
Cdk5激酶活性检测方法参照文献方法进行。(Chen PC, Chen JC.Enhanced Cdk5activity and p35 translocation in the ventral striatum of acute and chronicmethamphetamine-treated rats.Neuropsychopharmacology.2005;30:538-549.)
9、大鼠海马原代神经元培养
大鼠海马原代神经元培养方法参照文献方法进行。(Li R, Guo M, Zhang G, Xu X，Li Q.Neuroprotection of nicotiflorin in permanent focal cerebral ischemia andin neuronal cultures.Biol Pharm Bull.2006 Sep;29 (9):1868-72.)
10、XTT法检测细胞存活率
对数期细胞以5X IO5个/ml接种，以5X105cell/ml接种于96孔板内，100 μ 1/well，细胞贴壁培养24h后，加药处理。白藜芦醇甙剂量设置为12.5,50( μ g/ml)单独或与酒精(25mmol/ml)共同作用，同时设空白对照。每个浓度设六个平行孔。细胞加药后继续培养24h后，每孔加入50 μ I XTT/PMS混合液，置培养箱中37°C 孵育2h，酶标仪测定450nm波长处吸光度值(A)。根据下列公式计算细胞平均存活率:存活率=A药物处麵/Amm X 100%,实验重复3次。
[0023]11> Western blot方法检测Cdk5蛋白表达
Western blot检测Cdk5蛋白表达的方法参照文献描述[Rajgopal Y, VemuriMC.Ethanol induced changes in cyclin-dependent kinase-5 activity andits activators, P35, P67 (Munc-18) in rat brain.Neurosci Lett.2001 Aug10;308(3): 173-6.]。取含等量蛋白(50 mg/lane)的细胞裂解物进行SDS-PAGE凝胶电泳。结束后电转移至PVDF膜，转移条件为60 V,4.5 h于Towbin buffer [25 mM Tris-HCl (pH8.3), 192 mM glycine, 20% (v/v) methanol]。转移后洗膜，加入一抗(anti_Cdk5, 1:300)过夜。二抗孵育Ih，DAB显色，拍照。
[0024]12、统计分析
采用SPSS11.5软件(version 11.5，SPSS Inc.，USA)进行数据统计，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)和LSD检验。所有的数据均以均数土标准差(X 土s)表不。
[0025]二、结果
1、酒精处理大鼠Y-迷宫成绩比较
图1为Y-迷宫检测酒精处理对大鼠学习记忆成绩的影响。n=10。1:对照组；2:模型组；3:低剂量组；4:高剂量组;*与对照组相比，P < 0.01 ;与模型组相比，# P < 0.05，##P< 0.010
[0026]Y-迷宫行为检测结果显示，慢性酒精中毒大鼠训练成绩(99.73±11.78)较正常大鼠明显下降(32.18±10.41)，而高低剂量白藜芦醇甙(88.15±6.51)和(41.00±4.65)对慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力均有保护作用，高剂量白藜芦醇甙保护作用更加明显。
[0027]2、免疫荧光检测Cdk5
图2为免疫荧光检测大鼠海马组织(Alexa Fluor 488，400X)。Cdk5表达细胞显绿色荧光。A:对照组Cdk5蛋白表达；B:模型组Cdk5蛋白表达；C:低剂量组Cdk5蛋白表达；D:高剂量组Cdk5蛋白表达。Scale=IO μ m。
[0028]Cdk5在海马区神经元细胞表达，阳性细胞胞质呈绿色。模型组组与正常对照组及饮酒对照组相比较，镜下见大量的荧光着色细胞，分布密集，且荧光强度增加。用药组，尤其高剂量组阳性细胞数目减少。
[0029]3、白藜芦醇甙对原代培养海马神经元细胞存活率的影响
XTT法结果显示，25mmol/ml酒精作用于原代培养海马神经元细胞，与对照组相比，细胞存活率明显下降，说明酒精对神经元细胞具有毒性作用；而12.5 μ g/ml和50 μ g/ml白藜芦醇甙作用于原代培养海马神经元细胞，与对照组相比，对细胞存活率无明显影响，提示此浓度范围内的白藜芦醇对神经元细胞的毒性相对较低；12.5 μ g/ml和50 μ g/ml白藜芦醇甙与25mmol/ml酒精共同作用于原代培养海马神经元细胞，与酒精单独作用组相比，细胞存活率明显上升(P < 0.05或P < 0.01)，说明高低剂量白藜芦醇甙对神经元细胞均具有保护作用。
[0030]表.1白藜芦醇甙和酒精对海马神经元细胞存活率的影响
【权利要求】
1.白藜芦醇甙或白藜芦醇在制备治疗或预防慢性酒精中毒脑损伤中记忆减退的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的白藜芦醇甙或白藜芦醇在制备治疗或预防慢性酒精中毒脑损伤中记忆减退的药物中的应用，其特征在于:所述的白藜芦醇甙或者其与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐或者含有它们中任何一种的药物组合物与可药用辅料用于制备治疗或预防慢性酒精中毒脑损伤中记忆减退的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的白藜芦醇甙或白藜芦醇在制备治疗或预防慢性酒精中毒脑损伤中记忆减退的药物中的应用，其特征在于:所述的白藜芦醇或者其与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐或者含有它们中任何一种的药物组合 物与可药用辅料用于制备治疗或预防慢性酒精中毒脑损伤中记忆减退的药物中的应用。
【文档编号】A61P25/28GK103690547SQ201310692332
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】张瑞岭, 杜爱林, 徐春阳, 李爽, 牛敬媛, 姜洪波, 郭珂一, 孙莉莉, 弓茹月, 苏慧洁, 吴雅倩, 仲丽丽, 靳玫, 李慧智, 解娜, 林瑞峰, 马世江, 李静, 于小免, 李天超, 冯素萍, 黄艳芬, 靖素华, 陈璇, 王乐男, 陈璐 申请人:新乡医学院第二附属医院