新型fgfr3融合体的制作方法
【专利摘要】本发明的课题是阐明作为癌的新致病基因的多核苷酸，由此，提供该多核苷酸或其编码的多肽的检测方法、其检测用试剂盒、探针组、以及引物组。另外，还提供癌治疗用医药组合物。在所述检测方法中，检测FGFR3基因的一部分和TACC3基因的一部分的融合基因、或者其编码的融合蛋白。所述引物组、探针组或检测用试剂盒含有根据编码FGFR3的部分设计的正义引物、探针组、根据编码TACC3的部分设计的反义引物和探针组。由于所述多肽的抑制剂显示出抗肿瘤效果，因此，提供所述融合基因阳性或该多肽阳性的癌的治疗用医药组合物。
【专利说明】新型FGFR3融合体
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有FGFR3激酶区域的新型融合基因或由各融合基因所编码的融合 蛋白的检测方法。另外，涉及含有抑制该融合蛋白的物质的、用于治疗该融合基因阳性或该 融合蛋白阳性的癌的医药组合物。
【背景技术】
[0002] 纤维母细胞生长因子受体 3(FibroblastGrowthFactorReceptor3 ;FGFR3)基 因存在于第4号染色体短臂，并且编码的蛋白质为受体型酪氨酸激酶，在中央部具有细胞 膜贯通区域，并且在其駿基末端侧具有酪氨酸激酶区域、在氨基末端侧具有细胞外区域。根 据氨基末端侧的剪接的不同，已知有FGFR3b及FGFR3C该样的异构体，FGFR3bWFGF-I及 FGF-9 为配体，FGFR3CWFGF-l、-2、-4、-8、-9、-17、-18、-23 为配体形成二聚物，由此，将 自己的酪氨酸磯酸化而活化（非专利文献1及非专利文献2)。
[0003] 已知的是，在多发性骨肉瘤中，FGFR3基因通过染色体间转座而与I巧基因融合， 由于该转座所形成的蛋白质的异常而引起细胞的异常增殖，从而成为软骨发育不全症的致 病基因（非专利文献3)。另外，在末梢性T细胞恶性淋己瘤中，已知通过染色体间转座， FGFR3基因和ETV6基因融合（非专利文献4)。另外，在膀脫癌等中，已知FGFR3基因的活 化点突变，并且已知若将该些活化点突变基因导入到小鼠正常细胞NIH3T3细胞中，则其转 化为癌细胞样，但是已知的是野生型的FGFR3单独不会发生转化（非专利文献5)。
[0004]转化酸性卷曲螺旋含蛋白 3 (transforming,acidiccoiled-coilcontaining protein3 ;TACC3)基因与FGFR3基因一样存在于第4号染色体短臂，由16个外显子构成。 已知的是，所编码的蛋白质作为肌动蛋白与有丝分裂纺键体的稳定化有关（非专利文献 6)。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007]非专利文献1 细胞因子&生长因子综述（切tokine&GrowthFactorReview)， (英国）、2005 年、16 卷、p.139-149"
[0008] 非专利文献2 生物化学杂志炬iochemicaljournal)，（（英国），2011年、437 卷、P.199-213) '，
[0009]非专利文献 3 血液炬Iood)、（（美国）、2002 年、100 卷、P. 1579-1583)"
[0010] 非专利文献4 癌症研究（CancerReserch)、（（美国）、2001年、61卷、 P.8371-8374)，，
[0011]非专利文献 5 癌基因（Oncogene)、（（英国）、2009 年、28 卷、P. 4306-4316)"
[0012] 非专利文献6 细胞生物学趋势（TrendsinCellBiology)、。英国）、2008年、 18 卷、P.379-388)"
【发明内容】
[001引发明要解决的课题
[0014] 本发明的课题在于阐明作为癌的新致病基因的多核巧酸，由此提供该多核巧酸或 其编码的多肤的检测方法、及其检测用试剂盒、引物组及探针组。另外，本发明的课题在于， 对表达该些融合蛋白的癌症患者提供抑制本发明的多肤的药物。
[001引解决问题的手段
[0016] 本发明对由肺癌症患者及膀脫癌症患者检体所得到的激酶FGFR3的一部分与 TACC3基因的一部分融合而成的新型融合基因进行分离鉴定（实施例1、2、3及23)，发现该 些融合基因存在于肺癌症患者检体及膀脫癌症患者检体中（实施例4、5、6、20及23)，另外， 为了表达该些融合基因而制作了逆转录酶病毒（实施例7、10及24)，发现感染细胞具有肿 瘤形成能力，因此该融合基因是癌症的致病基因（实施例8、11及25)。构建了一种检测方 法（实施例4、5、6、19、20、27及28)，其中，从源自人膀脫癌症患者的细胞株或肺癌症患者检 体及膀脫癌症患者检体检测该新型融合基因W及由该新型融合基因所编码的融合蛋白。另 夕F，发现具有由该融合基因所编码的融合蛋白的抑制作用的药物抑制了感染细胞的肿瘤形 成能力，因此，对于表达该融合蛋白或对其编码的融合基因的癌症患者而言（即，FGFR3基 因和TACC3基因的融合基因阳性或者FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌症患者），该融合 蛋白的抑制剂是有效的（实施例9、12、13、14、16、22及30)。
[0017] 迄今为止，认为野生型的FGFR3单独不会转化为癌细胞，但是令人非常梅讶的是， 即便是野生型，通过与TACC3融合，也转化为癌细胞。另外，令人惊讶的是，确认到该FGFR3 和TACC3的融合蛋白在FGFR3激酶的駿基末端侧融合，形成了与迄今已知的在氨基末端的 融合激酶不同的结构。
[0018] 本发明人根据该些见解构建了该些融合基因的检测法，提供了用于该方法的试剂 盒、引物组及探针组，并通过检测该些融合基因或其所编码的融合蛋白，可W筛选成为通过 融合蛋白抑制剂的药物治疗对象的癌症患者。此外，还发现该融合蛋白抑制剂（特别是化 合物A?E、Dovitinib、AZD4547、BGJ398 或LY2874455)抑制FGFR3 和TACC3 的融合蛋白 的活性，并且对表达FGFR3和TACC3的融合蛋白的（即，FGFR3基因和TACC3基因的融合基 因阳性或者FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的）癌（例如肺癌或膀脫癌）等有效。
[0019]目P，本发明涉及W下内容。
[0020] [1]-种纤维母细胞生长因子受体3 (FGFR3)基因和转化酸性卷曲螺旋含蛋白 3 (TACC3)基因的融合基因或FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法，其特征在于，包括检测 从受试者得到的试样中的、编码下述多肤的多核巧酸或该多肤的存在的步骤：
[0021] 所示多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461? 982、序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043或序列号28 的氨基酸编号461?1040所示氨基酸序列的同源性为90 %W上的氨基酸序列，并且具有肿 瘤形成能力。
[002引凹根据山所述的方法，其中，所述多肤是含有序列号2的氨基酸编号461? 947、序列号4的氨基酸编号461?982、序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨 基酸编号461?1043或序列号28的氨基酸编号461?1040所示的氨基酸序列，并且具有 肿瘤形成能力的多肤；或者是含有在序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸 编号461?982、序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043 或序列号28的氨基酸编号461?1040所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入I?10 个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤。
[0023] [3]根据[1]所述的方法，其中，所述多肤是含有与序列号2、序列号4、序列号6、 序列号26或序列号28所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤 形成能力的多肤。
[0024] [4]根据[1]所述的方法，其中，所述多肤是含有序列号2、序列号4、序列号6、序 列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤；或者是含有在序列 号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入 1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤。
[002引 閒根据山所述的方法，其中，所述多肤为由序列号2、序列号4、序列号6、序列 号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肤。
[0026] [6] -种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的检测用试剂盒，其含有W能够特异 性地扩增编码下述多肤的多核巧酸的方式设计的正义引物及反义引物：
[0027] 所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461? 982、序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043或序列号28 的氨基酸编号461?1040所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿 瘤形成能力。
[002引 [7]根据[6]所述的试剂盒，其中，所述多肤是含有序列号2的氨基酸编号461? 947、序列号4的氨基酸编号461?982或序列号6的氨基酸编号461?996所示的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力的多肤；或者，所述多肤是含有在序列号2的氨基酸编号461? 947、序列号4的氨基酸编号461?982、序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨 基酸编号461?1043或序列号28的氨基酸编号461?1040所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤。
[0029][引根据[6]所述的试剂盒，其中，所述多肤是含有与序列号2、序列号4、序列号 6、序列号26或序列号28所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿 瘤形成能力的多肤。
[0030] [9]根据[6]所述的试剂盒，其中，所述多肤是含有序列号2、序列号4、序列号6、 序列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤；或者，所述多肤 是含有在序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤。
[003。 [10]根据脚所述的试剂盒，其中，所述多肤为由序列号2、序列号4、序列号6、序 列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肤。
[003引山]一种用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物组，其选自由下述a)?e)构成的组：
[0033] a)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号1所示的碱基序列构成的多核巧酸 杂交的核酸分子所构成的反义引物、W及由在严格条件下与该多核巧酸的互补链杂交的核 酸分子所构成的正义引物；
[0034]b)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号3所示的碱基序列构成的多核巧酸 杂交的核酸分子所构成的反义引物、W及由在严格条件下与该多核巧酸的互补链杂交的核 酸分子所构成的正义引物；W及
[0035] C)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号5所示的碱基序列构成的多核巧酸 杂交的核酸分子所构成的反义引物、W及由在严格条件下与该多核巧酸的互补链杂交的核 酸分子所构成的正义引物；
[0036] d)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号25所示的碱基序列构成的多核巧 酸杂交的核酸分子所构成的反义引物、W及由在严格条件下与该多核巧酸的互补链杂交的 核酸分子所构成的正义引物；
[0037]e)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号27所示的碱基序列构成的多核巧 酸杂交的核酸分子所构成的反义引物、W及由在严格条件下与该多核巧酸的互补链杂交的 核酸分子所构成的正义引物。
[003引[12]-种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号1的碱基编号 1?2280中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸构成，所述反义引物由与序列号1的碱 基编号2281?2856中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成。
[0039] [13] -种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号3的碱基编号 1?2280中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸构成，所述反义引物由与序列号3的碱 基编号2281?2961中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成。
[0040] [14] -种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号5的碱基编号 1?2368中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸构成，所述反义引物由与序列号5的碱 基编号2369?3003中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成。
[0041] [15] -种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号25的碱基编号 1?2242中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸构成，所述反义引物由与序列号25的 碱基编号2243?3144中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成。 [004引[16] -种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号27的碱基编号 1?2233中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸构成，所述反义引物由与序列号27的 碱基编号2234?3135中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成。 [004引 [17] -种用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的探针组，选自由下述 a)?C)构成的组：
[0044]a)探针组，其包括由含有与序列号1的碱基编号1?2280中任意的连续的至少 16个碱基互补的寡核巧酸的多种邻接的探针对构成的探针组（优选包括20种探针组）、W 及由含有与序列号1的碱基编号2281?2856中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核 巧酸的多种邻接的探针对构成的探针组（优选包括20种探针组）；
[0045]b)探针组，其包括由含有与序列号3的碱基编号1?2280中任意的连续的至少 16个碱基互补的寡核巧酸的多种邻接的探针对构成的探针组（优选包括20种探针组）、W 及由含有与序列号3的碱基编号2281?2961中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核 巧酸的多种邻接的探针对构成的探针组（优选包括20种探针组）；
[0046] C)探针组，其包括由含有与序列号5的碱基编号1?2368中任意的连续的至少 16个碱基互补的寡核巧酸的多种邻接的探针对构成的探针组（优选包括20种探针组）、W 及由含有与序列号5的碱基编号2369?3003中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核 巧酸的多种邻接的探针对构成的探针组（优选包括20种探针组）。
[0047] [18]根据山?閒中任一项所述的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的检 测方法，其特征在于，所述检测多核巧酸的存在的步骤包括：使用从受试者得到的试样W及 [17]所述的探针组进行原位杂交的步骤；将杂交的信号放大的步骤；W及检测所述信号重 叠的步骤。
[004引 [19] 一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的检测用试剂盒，其含有用于检测 FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的[17]所述的探针组W及将杂交后的信号放大的试 剂。
[0049] 巧0]根据[1]?[5]中任一项所述的FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法，其 特征在于，所述检测多肤的存在的步骤包括；i)使识别源自该多肤的FGFR3基因的部分的 抗体（一次抗体）及识别源自该多肤的TACC3基因的部分的抗体（一次抗体）与从受试者 得到的试样接触的步骤；ii)添加与该一次抗体分别结合的、并且连结有寡核巧酸的各二 次抗体的步骤；iii)添加连接溶液从而进行连接反应的步骤，其中该连接溶液含有与该二 次抗体所连结的该寡核巧酸部分互补的二种寡核巧酸、W及在它们接近时能够使其连接从 而在该二次抗体间形成环状结构的连接酶；iv)沿所形成的环状结构使核酸伸长的步骤； V)使能够与伸长的核酸杂交的经标记的寡核巧酸探针杂交的步骤；W及Vi)检测该标记信 号的步骤。
[0050]KU-种FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测用试剂盒，其用于山?閒中任一 项所述的FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法中，并且含有；识别源自所述融合多肤的 FGFR3基因的部分的抗体（一次抗体）及识别源自所述融合多肤的TACC3基因的部分的抗 体（一次抗体）、与该一次抗体分别结合并且连结有寡核巧酸的二次抗体、与连结于该二次 抗体的该寡核巧酸部分互补的二种寡核巧酸、在它们接近时能够使其连接从而在该二次抗 体间形成环状结构的连接酶、W及经标记的寡核巧酸探针。
[0051] 巧2] -种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白 阳性的癌的治疗用医药组合物，其含有抑制下述多肤的物质：
[0052] 所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461? 982或序列号6的氨基酸编号461?996所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序 列、并且具有肿瘤形成能力。
[005引 巧引根据巧引所述的医药组合物，其中，所述多肤是含有序列号2的氨基酸编号 461?947、序列号4的氨基酸编号461?982或序列号6的氨基酸编号461?996所示的 氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤；或者是含有在序列号2的氨基酸编号461? 947、序列号4的氨基酸编号461?982或序列号6的氨基酸编号461?996所示的氨基酸 序列中缺失、取代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能 力的多肤。
[0054] 巧4]根据巧2]所述的医药组合物，其中，所述多肤为由序列号2的氨基酸编号 461?947、序列号4的氨基酸编号461?982或序列号6的氨基酸编号461?996所示的 氨基酸序列构成的多肤。
[0055] 巧引根据巧2]所述的医药组合物，其中，所述多肤为含有与序列号2、序列号4或 序列号6所示氨基酸序列的同源性为90 %W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多 肤。
[005引巧6]根据巧引所述的医药组合物，其中，所述多肤是含有序列号2、序列号4或序 列号6所示氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤；或者是含有在序列号2、序列号4 或序列号6所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力的多肤。
[0057]巧7]根据巧引所述的医药组合物，其中，所述多肤为由序列号2、序列号4或序列 号6所示的氨基酸序列构成的多肤。
[005引 巧8]根据巧引?巧7]中任一项所述的癌治疗用医药组合物，其中，所述的抑制多 肤的物质为Dovitinib、AZD4547、BGJ398 或LY2874455。
[005引 巧9]根据巧引?巧7]中任一项所述的癌治疗用医药组合物，其中，所述癌为肺癌 或膀脫癌。
[0060] 巧0]抑制下述多肤的物质用于制造FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或 FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌的治疗用医药组合物的应用：
[0061] 所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461? 982或序列号6的氨基酸编号461?996所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力。
[0062] 巧1]抑制下述多肤的物质用于治疗FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或 FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌的应用：
[0063] 所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461? 982或序列号6的氨基酸编号461?996所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力。
[0064] 巧2]抑制下述多肤的物质，其用于治疗FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性 或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌：
[0065] 所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461? 982或序列号6的氨基酸编号461?996所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力。
[0066] 巧3] -种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白 阳性的癌的治疗方法，包括向对象给予有效量的抑制下述多肤的物质：
[0067] 所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461? 982或序列号6的氨基酸编号461?996所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力。
[0068] 另外，本发明涉及
[0069] -种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的存 在的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
[0070] 检测从受试者得到的试样中的编码下述（1)?（3)中记载的多肤的多核巧酸的存 在的步骤，
[0071](1)所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的 氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
[0072](2)所述多肤含有序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨 基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肤含有在序列号2的氨 基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列 号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461?1043 (或序列 号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
[0073] (3)所述多肤由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基 酸序列构成。
[0074] 另外，本发明涉及
[00巧]一种本段落中记载的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌 或膀脫癌）的存在的检测方法，其特征在于，该多核巧酸的存在的检测步骤包括：使用从受 试者得到的试样及[17]所述的标记探针组进行原位杂交的步骤；W及检测所述标记的信 号重叠的步骤。
[007引另外，本发明涉及
[0077] 一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的诊 断方法，其特征在于，包括下述步骤：
[007引检测从受试者得到的试样中的编码下述（1)?（3)中记载的多肤的多核巧酸的存 在的步骤，
[0079](1)所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的 氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
[0080](2)所述多肤含有序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨 基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肤含有在序列号2的氨 基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列 号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461?1043 (或序列 号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
[0081] (3)所述多肤由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基 酸序列构成。
[0082] 另外，本发明涉及
[0083]-种本段落中记载的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌 或膀脫癌）的诊断方法，其特征在于，该多核巧酸的存在的检测步骤包括：使用从受试者得 到的试样及[17]中记载的标记探针组进行原位杂交的步骤；W及检测所述标记的信号重 叠的步骤。
[0084] 另外，作为其他方案，本发明涉及一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的 癌（特别是肺癌或膀脫癌）的治疗方法，包括对通过上述2个方案的诊断方法诊断为FGFR3 基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的患者给予本发明的抑制 多肤的物质（在一种方案中为化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398或化合物 LY287445 巧。
[0085] 另外，本发明涉及
[0086] -种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的存 在的检测方法，其特征在于，包含下述步骤：
[0087] (1)W从受试者得到的试样作为模板，使用上述山]?[16]中任一项所述的引物 组进行PCR的步骤；W及
[008引 （2)检测PCR产物的存在的步骤。
[008引另外，本发明涉及
[0090] 一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的诊 断方法，其特征在于，包含下述步骤：
[0091] (1)W从受试者得到的试样作为模板，使用上述山]?[16]中任一项所述的引物 组进行PCR的步骤；W及
[0092] (2)检测PCR产物的存在的步骤。
[0093] 另外，作为其他方案，本发明涉及一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性 的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的治疗方法，包括对通过上述诊断方法诊断为FGFR3基因 和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的患者给予抑制本发明的多 肤的物质（在一种方案中为化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398或化合物 LY287445 巧。
[0094] 另外，本发明涉及
[0095] 一种检测染色体的重排（genomicrearrangement,基因重排）的方法，包含下述 步骤：
[0096] 检测从受试者得到的试样中的编码下述（1)?（3)中记载的多肤的多核巧酸的存 在的步骤，
[0097](1)所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的 氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能 力；
[0098](2)所述多肤含有序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨 基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肤含有在序列号2的氨 基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列 号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461?1043 (或序列 号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入I?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
[0099] (3)所述多肤由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基 酸序列构成。
[0100] 此外，本发明还涉及
[010。 一种检测染色体的重排（genomicrearrangement,基因重排）的方法，其特征在 于，包含下述步骤：
[0102] (1)使用i)从受试者得到的试样、ii)含有编码FGFR3基因的5'侧基因组区域的 英光标记探针（第一探针）、W及iii)含有编码TACC3基因的3'基因组区域的英光标记探 针（第二探针）（此处，第一探针和第二探针的英光不同）进行原位杂交的步骤；W及
[0103] (2)检测所述标记的信号重叠的步骤。
[0104] 另外，本发明涉及
[0105] 一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的存 在的检测方法，其特征在于，包含下述步骤：
[0106] (1)使用i)从受试者得到的试样、ii)含有编码FGFR3基因的5'侧基因组区域的 英光标记探针（第一探针）、W及iii)含有编码TACC3基因的3'基因组区域的英光标记探 针（第二探针）（在此，第一探针和第二探针的英光不同）进行原位杂交的步骤；W及
[0107] (2)检测所述标记的信号重叠的步骤。
[010引另外，本发明涉及
[0109] 一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的诊 断方法，其特征在于，包含下述步骤：
[0110] (1)使用i)从受试者得到的试样、ii)含有编码FGFR3基因的5'侧基因组区域的 英光标记探针（第一探针）、W及iii)含有编码TACC3基因的3'基因组区域的英光标记探 针（第二探针）（在此，第一探针和第二探针的英光不同）进行原位杂交的步骤；W及
[0111] (2)检测所述标记的信号重叠的步骤。
[0112] 另外，作为其他方案，本发明涉及一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性 的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的治疗方法，包括对于通过上述诊断方法诊断为FGFR3基因 和TACC3基因的融合基因阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的患者给予抑制本发明的多 肤的物质（在一种方案中为化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398、或化合物 LY287445 巧。
[011引另外，本发明涉及
[0114] 下述（1)?（3)中记载的多肤（W下也称为"本发明的多肤"）或编码该多肤的多 核巧酸（W下也称为"本发明的多核巧酸"）：
[0115](1)所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的 氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
[0116](2)所述多肤含有序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨 基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肤含有在序列号2的氨 基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列 号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461?1043 (或序列 号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
[0117] (3)所述多肤由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基 酸序列构成。
[0118] 另外，本发明涉及一种FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法，其特征在于，包含 检测从受试者得到的试样中的下述（1)?（3)中记载的多肤的存在的步骤：
[0119](1)所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的 氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能 力；
[0120](2)所述多肤含有序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨 基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肤含有在序列号2的氨 基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列 号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461?1043 (或序列 号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
[0121] (3)所述多肤由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基 酸序列构成。
[0122] 另外，本发明涉及
[0123] 一种FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的存在的检测 方法，其特征在于，包含下述步骤：
[0124] 检测从受试者得到的试样中的下述（1)?（3)中记载的多肤的存在的步骤，
[0125](1)所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的 氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能 力；
[0126](2)所述多肤含有序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨 基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肤含有在序列号2的氨 基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列 号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461?1043 (或序列 号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
[0127] (3)所述多肤由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基 酸序列构成的多肤。
[012引另外，本发明涉及
[0129] 一种FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的诊断方法， 其特征在于，包含下述步骤：
[0130] 检测从受试者得到的试样中的下述（1)?（3)中记载的多肤的存在的步骤，
[0131](1)所述多肤含有与序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的 氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能 力；
[0132] (2)所述多肤含有序列号2的氨基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨 基酸编号461?982 (或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列 号26的氨基酸编号461?1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或 序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肤含有在序列号2的氨 基酸编号461?947 (或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461?982 (或序列号4)、序列 号6的氨基酸编号461?996 (或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461?1043 (或序列 号26)或序列号28的氨基酸编号461?1040 (或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
[0133] (3)所述多肤由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基 酸序列构成。
[0134] 另外，作为其他方案，本发明涉及一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的 癌（特别是肺癌或膀脫癌）的治疗方法，包括对通过上述诊断方法诊断为FGFR3和TACC3 的融合蛋白阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的患者给予抑制上述（1)?（3)中记载的多 肤的物质（在一种方案中为化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398、或化合物 LY287445 巧。
[01巧]Science. 2012S巧 7 ;337化099) :1231-5.化油 2012化 1 26.中报道了 存在显 示出癌化能力的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因、FGFR抑制剂PD173074、AZD4547、 BGJ398抑制FGFR3-TACC3融合基因表达细胞的增殖、并且给出了FGFR3-TACC3融合基因表 达可能有助于FGFR抑制治疗有用的胶质母细胞瘤患者组的鉴定的启示，但是其为本申请 最先的 优先权日:（2012年3月8日）之后的文献。在该文献中记载了使融合点与本发明的 FGFR3-TACC3_vl及FGFR3-TACC3_v2相同的基因片断的序列，但是其全长并未明确，并且其 根本没有公开本发明的FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_v5a、及FGFR3-TACC3_v化或其检测 方法、引物组、探针组、检测试剂盒，也没有给出启示。另外，也没有关于肺癌及膀脫癌的记 载和启示。
[0136]另外，HumMolGenet. 2012.Nov2UHumMolGenet. 2013Febl5 ;22 (4) :795-803)中报道了具有癌化能力的FGFR3和TACC3的融合基因（本发明的FGFR3-TACC3_vl)在膀脫 癌中存在，但是该文献为公开了本发明的FGFR3-TACC3_vl的本申请最先的 优先权日:（2012 年3月8日）及本申请第二 优先权日:（2012年9月5日）之后的文献。在该文献中，根本 没有公开本发明的FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_v5a、及FGFR3-TACC3_ V化或其检测方法、引物组、探针组、检测试剂盒，也没有给出启示。另外，也没有关于肺癌的 记载和启示。
[0137]此外，JClinInvest. 2013February1 ;123(2) ;855_865,中报道了在胶质母细 胞瘤中存在几个具有癌化能力的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因，但是该文献为在公 开了本发明的FGFR3-TACC3_vl及FGFR3-TACC3_v2的本申请最先的 优先权日:（2012年3月 8日）、本申请第二 优先权日:（2012年9月5日）及本申请第H 优先权日:（2012年12月21 日）之后出版的文献。在该文献中，根本没有公开本发明的FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_ v5a、及FGFR3-TACC3_v^或其检测方法、引物组、探针组、检测试剂盒，也没有给出启示。另 夕F，也没有关于肺癌及膀脫癌的记载和启示。
[013引发明效果
[0139] 本发明的检测方法可用作检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3 和TACC3的融合蛋白阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的方法。另外，本发明的检测方法 可用作检测染色体重排的方法。另外，根据本发明的检测方法，可鉴别是否为利用抑制本发 明的多肤的物质的治疗的适用对象。本发明的检测用试剂盒、引物组及探针组可用于本发 明的检测方法。另外，抑制本发明的多肤的物质可用作FGFR3基因和TACC3基因的融合基 因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的治疗用医药组合 物。
【具体实施方式】
[0140] <本发明的检测方法〉
[0141] 本发明的检测方法为检测融合基因或融合蛋白的方法，该方法包含检测从受试者 得到的试样中的特定的多核巧酸或多肤的存在的步骤。作为从受试者得到的试样，使用来 自受试者的采集物（从活体分离的试样），具体而言，使用所采集的任意的组织、体液（优选 血液）、肺泡或支气管清洗液、活检试样、尿中癌细胞、姨试样，优选使用受试者的肺患部或 膀脫患部的活检试样或姨试样。可W从试样中提取基因组DNA来使用，另外，可W使用其转 录产物（将基因组转录及翻译，结果产生的产物；例如mRNA、cDNA、蛋白质）。特别优选制备 并使用mRNA或cDNA。另外，可W使用对试样进行福尔马林固定并包埋于石蜡中而稳定化的 标本（FFP巧。也可W使用将FFPE薄切片后的FFPE切片。如果使用FFPE切片，则可W直接 检测其中存在的多核巧酸或多肤。
[0142] 在融合基因的检测方法中的"检测多核巧酸的存在的步骤"中，作为其检测对象的 多核巧酸（W下称为"检测对象多核巧酸"）为"FGFR3基因和TACC3基因的融合基因"，其 为含有FGFR3基因的一部分和TACC3基因的一部分的基因。
[0143] 作为"FGFR3基因和TACC3基因的融合基因"，可列举该样的融合基因；其具有 编码作为FGFR3的功能域之一的激酶区域的序列和编码作为TACC3的功能域之一的螺旋 卷曲区域的序列。作为引起癌症的融合基因，已知有PTC-RET(Clin.CancerRes. 2009; 7119-7123)、KIF5B-ALK(Clin.CancerRes. 2009 ;3143-3149)、KIF5B-RET(Nature medicine2012;Feb12;Epub址eadofprint、P'JatMed. 2012Feb12:18(3) :375-7)、EML4-ALK(化化re2007 :561-566)等，该些融合基因为在5'末端侧具有螺旋卷曲区域的蛋 白质的基因与在3'末端侧缺损配体结合部位的激酶基因结合而成的融合基因，并且已知 的是如果强制地在NIH3T3细胞中表达，则引起转化。例如，对于使不具有配体结合部位的 KI巧B-RET融合基因表达了的3T3细胞而言，引起第905位的酪氨酸自我磯酸化从而被活 化，其中该第905位的酪氨酸对配体非依赖性地RET激酶活化是重要的。已知该自我磯酸 化被作为RET抑制剂的Vandetanib抑制，引起细胞死亡（化1：11'6medicine2012;Feb12; 化ub址eadofprint、化tMed. 2012Feb12;18(3) ;375-7)。另外已知的是，对于使同样 不具有配体结合部位的EML4-ALK融合基因内源性地表达的细胞株而言，也会引起对于ALK 的激酶活性重要的第1604位的磯酸化，并且通过对ALK具有抑制活性的TAE684来抑制磯 酸化，从而抑制增殖（Clin.CancerRes. 2008:4275-4283)。此外，还教导了作为ALK激酶 抑制剂的化izotinib对于表达了EML4-ALK融合基因的肺癌患者是有效的治疗药值rug Des.Devel.Ther. 2011 ;471-485)。作为该些融合基因所编码的融合蛋白的活化机制，教导 了通过经由螺旋卷曲区域的均二聚化作用，引起融合的激酶区域的配体非依赖性地恒定的 活化。此外，还教导了通过使用融合的激酶的抑制剂，可由此抑制融合蛋白的功能。因此， 关于FGFR3基因和TACC3基因的融合基因，也将FGFR3的激酶区域和TACC3的螺旋卷曲区 域推测为引起癌化的重要的区域。因此，作为上述"检测对象多核巧酸"，例如可列举具有该 样的序列的多核巧酸：该序列编码FGFR3基因和TACC3基因的融合基因当中对应于FGFR3 的激酶区域和TACC3的螺旋卷曲区域的序列，即编码下述（1)?（3)中记载的多肤的多核 巧酸。在某种方案中，即使通过检测该些区域内的一部分，也可W对检测对象多核巧酸的存 在进行检测。
[0144] (1)含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982、 序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043或序列号28的氨 基酸编号461?1040所示的氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤 形成能力的多肤[W下也称为"同源多肤"];
[0145] (2)含有序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982、 序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043或序列号28的氨 基酸编号461?1040所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤；或者含有在序列 号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982、序列号6的氨基酸编号 461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043或序列号28的氨基酸编号461?1040所 示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有 肿瘤形成能力的多肤[W下也称为"功能性等效变体多肤"];或者
[0146] (3)由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构 成的多肤。
[0147] 作为优选的上述检测对象多核巧酸，可列举编码下述（1)?（3)中记载的多肤的 多核巧酸。
[014引 （1)含有与序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序 列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤；
[0149] (2)含有序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列， 并且具有肿瘤形成能力的多肤；或者含有在序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列 号28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并 且具有肿瘤形成能力的多肤；或者
[0150] (3)由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构 成的多肤。
[0151] 作为更优选的上述检测对象多核巧酸，可列举由序列号1、序列号3、序列号5、序 列号25或序列号27所示的碱基序列构成的多核巧酸。
[0152] 由序列号1所示的碱基序列构成的多核巧酸为由从FGFR3基因突变3佑enBank 注册编号；NM_〇〇1163213. 1)的碱基编号257(与外显子2的第一个甲硫氨酸对应）到 2536(与外显子18的3'末端对应））和从TACC3基因（GenBank注册编号；NM_006342. 1) 的碱基编号2050(与外显子11的5'末端对应）到2625(与外显子16的终止密码子对应） 为止的碱基序列所构成的多核巧酸。序列号1所示的碱基序列中，碱基编号1?2280的序 列源自FGFR3基因，碱基编号2281?2856的序列源自TACC3基因。将该融合多核巧酸称为 FGFR3-TACC3_vl。序列号1的碱基编号1?2856为融合蛋白的开放阅读框（ORF)，该ORF 所编码的氨基酸序列示于序列号2。
[0153] 由序列号3所示的碱基序列构成的多核巧酸为由从FGFR3基因突变3佑enBank注 册编号；NM_001163213. 1)的碱基编号257 (与外显子2的第一甲硫氨酸对应）到2536(与 外显子18的3'末端对应）和从TACC3基因佑enBank注册编号；NM_006342. 1)的碱基编 号1945 (与外显子10的5'末端对应）到2625 (与外显子16的终止密码子对应）为止的 碱基序列所构成的多核巧酸。在序列号3所示的碱基序列中，碱基编号1?2280的序列 源自FGFR3基因，碱基编号2281?2961的序列源自TACC3基因。将该融合多核巧酸称为 FGFR3-TACC3_v2。序列号3的碱基编号1?2961为融合蛋白的0RF，将该ORF所编码的氨 基酸序列不于序列号4。
[0154] 由序列号5所示的碱基序列构成的多核巧酸为由从FGFR3基因突变3佑enBank注 册编号；NM_001163213. 1)的碱基编号257 (与外显子2的第一甲硫氨酸对应）到2624(与 外显子19的中部对应）和夹住TACC3基因佑enBank注册编号；NM_006342. 1)的内含子59 碱基并且从碱基编号2050 (与外显子11的5'末端）到2625 (与外显子16的终止密码子对 应）为止的碱基序列所构成的多核巧酸。序列号5所示的碱基序列中，碱基编号1?2368 的序列源自FGFR3基因，碱基编号2369?2427的序列源自TACC3的基因组序列，碱基编号 2428?3003的序列源自TACC3基因。将该融合多核巧酸称为FGFR3-TACC3_v3。序列号5 的碱基编号1?3003为融合蛋白的0RF，将该ORF所编码的氨基酸序列示于序列号6。
[0155] 由序列号25所示的碱基序列构成的多核巧酸为由从FGFR3基因突变3佑enBank 注册编号；NM_〇〇l163213. 1)的碱基编号257到2498(但是，第1980位不是C而是G)和从 TACC3基因佑enBank注册编号；NM_006342. 1)的碱基编号1771到2672为止的碱基序列所 构成的多核巧酸。序列号25所示的碱基序列中，碱基编号1?2242的序列源自FGFR3基 因，碱基编号2243?3144的序列源自TACC3基因。将该融合多核巧酸称为FGFR3-TACC3_ v5a。序列号25的碱基编号1?3144为融合蛋白质的0RF，将该ORF所编码的氨基酸序列 示于序列号26。
[0156] 由序列号27所示的碱基序列构成的多核巧酸为由从FGFR3基因突变3佑enBank 注册编号；NM_〇〇1163213. I)的碱基编号257到2498和从TACC3基因佑enBank注册编号：NM_006342. 1)的碱基编号1771到2672为止的碱基序列所构成的多核巧酸。但是，一部分中 存在多核巧酸的缺失和插入。缺失的部分相当于FGFR3基因（NM_001163213. 1)的第690位 到第701位（外显子4的3'侧的序列）。插入的部分相当于FGFR3基因（NM_001163213. 1) 的第1528位和第1529位之间（外显子10和外显子11之间），插入有CAG该样的序列。序 列号27所不的碱基序列中，碱基编号1?2233的序列源自FGFR3基因，碱基编号2234? 3135的序列源自TACC3基因。将该融合多核巧酸称为FGFR3-TACC3_v^。序列号28的碱 基编号1?3135为融合蛋白的ORF，将该ORF所编码的氨基酸序列示于序列号28。
[0157]将FGFR3-TACC3-V1、FGFR3-TACC3-V2、FGFR3-TACC3-V3、FGFR3-TACC3_v5a、 FGFR3-TACC3_v^统称为FGFR3-TACC3融合多核巧酸。
[0158]作为其他方案中的所述检测对象多核巧酸，可列举：与序列号1的碱基编号 1381?2841对应的FGFR3-TACC3_vl的部分序列、与序列号3的碱基编号1381?2946对应 的FGFR3-TACC3_v2的部分序列、与序列号5的碱基编号1381?2988对应的FGFR3-TACC3_ v3等。
[0159] 作为优选的"同源多肤"，可列举；"含有与序列号2、序列号4、序列号6、序列号26 或序列号28所示的氨基酸序列的同源性为90%W上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能 力的多肤"，更优选含有该同源性为95%W上、进一步优选为98%W上的氨基酸序列的多 肤。
[0160] 作为优选的"功能性等效变体多肤"，优选"含有在序列号2、序列号4、序列号6、序 列号26或序列号28所示的氨基酸序列中取代、缺失和/或插入1?10个、优选1?数个、 进一步优选1?7个、最优选1?5个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力 的多肤"，特别优选"含有序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基 酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤"。
[0161] 另夕F，本说明书中的上述"同源性"是指：通过肥邸LEprogram(JMolBiol1970; 48:443-453)检索，采用通过默认值而准备的参数所得到的值Identity。上述参数如下所 述。
[0162]Gappenalty= 10
[0163]Extendpenalty= 0. 5
[0164]Matrix=EMDSUM62
[0165] 某种多肤"具有肿瘤形成能力"可通过后述实施例8中记载的方法来确认。具体 而言，可列举将该融合基因导入到NIH3T3细胞中，使用球形板确认销定非依赖性细胞增殖 作用的方法。另外，也可W是将导入有该融合基因的细胞接种于裸鼠的皮下之后，观察一定 期间，确认肿瘤形成的方法。
[0166] 作为本发明检测方法中的检测对象多核巧酸，优选编码"含有序列号2、序列号4、 序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肤"的多 核巧酸，最优选编码"由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸 序列构成的多肤"的多核巧酸。
[0167] 本发明的融合基因检测方法中的"检测多核巧酸的存在的步骤"该样实施；检测从 受试者得到的试样的基因组中的检测对象多核巧酸（含有融合点的基因组序列）的存在， 制备从受试者得到的试样中所提取的基因组DM的转录产物（例如mRM或cDNA)并检测 与检测对象多核巧酸对应的mRNA或CDNA的存在，或者通过原位杂交检测根据需要进行了 前处理的从受试者所得到的试样中的检测对象多核巧酸的存在。
[0168] 基因组DNA的提取可通过公知的方法来进行，可使用市售的DNA提取试剂盒来简 便地进行。
[0169] 检测步骤可根据公知的基因分析法（例如，作为基因检测法常用的PCR、 LCR(Ligasechainreaction,连接酶链式反应）、SDA(Stranddisplacement amplification,链置换扩增）、NASBA(Nucleicacidsequence-basedamplification,基于 核酸序列的扩增）、ICAN(Isothermalandchimericprimer-initiatedampli円cationof nucleicacids,等温的和嵌合引物起始的核酸扩增）、LAMP法（Loop-mediatedisothermal amplification,环介导恒温扩增）、TMA法（Gen-Probe'sTMAsystem)、原位杂交（ISH)法、 W及微阵列等公知的方法）来实施。例如，利用W与检测对象多核巧酸杂交的核酸作为探 针的杂交技术、或者W与检测对象多核巧酸杂交的DNA作为引物的基因扩增技术等。
[0170] 具体而言，使用源自从受试者得到的试样的核酸（例如mRNA等）进行测定。mRNA 量的测定采用W能够特异性地扩增检测对象多核巧酸的方式所设计的引物并利用基因扩 增反应方法来测定。本发明的检测方法中所使用的引物、或者检测用试剂盒中所含的引物 只要能够特异性地扩增检测对象多核巧酸即可，没有特别限定，可基于检测对象多核巧酸 的碱基序列进行设计。PCR扩增监测法中的引物设计可利用引物设计软件（例如Primer Express; 7才3 ^FW^，厶《公司）等。另外，如果PCR产物的尺寸变大，则扩增 效率变差，因此，适当地设定正义引物和反义引物使得WmRNA或CDNA作为对象扩增时的扩 增产物的大小为化bW下。
[017。 更具体而言，从源自FGFR3基因的部分（例如上述融合多核巧酸（特别是cDNA) 的FGFR3基因区域内的任意部分）设计正义引物（5'-引物），由源自TACC3基因的部分 (例如上述融合多核巧酸（特别是cDNA)的TACC3基因区域内的任意部分）设计反义引物 (3'-引物）。或者，也可WW与含有该融合多核巧酸的融合点（后述）的区域对应的方式 来设计正义引物或反义引物的一者。优选使用本发明的检测用试剂盒中所含的引物组，进 一步优选使用本发明的检测用试剂盒中最优选含有的引物组。在PCR扩增监测法中，也可 W通过惨混与各基因对应的上述正义引物来设计多重PCR(MultiplexPCR)，所述多重PCR 利用一种反应液来测定全部的检测对象多核巧酸。可通过适于各扩增技术的方法来确认目 标基因（整体或其特异性部分）是否被扩增。例如，在PCR法中，可通过琼脂糖凝胶电泳对 PCR产物进行分析，并通过漠化己锭染色等确认是否得到了目标尺寸的扩增片断。当得到了 目标尺寸的扩增片断时，在从受试者得到的试样中存在检测对象多核巧酸。由此可检测出 检测对象多核巧酸的存在。
[0172] 作为本发明的融合基因的检测方法，除了通过基因扩增反应检测从受试者得到的 试样中的特定多核巧酸的存在的步骤W外，优选还包括检测是否得到了目标尺寸的扩增片 断的步骤。
[0173] 利用杂交技术的检测采用（例如）northern杂交、斑点杂交法、DNA微阵列法、RNA 保护法等来进行。作为用于杂交的探针，可W使用含有在严格条件下（优选更严格条件下） 与检测对象多核巧酸或其互补链杂交的连续的至少32个碱基的核酸分子，即由W融合点 为中也在其上游及下游的各16个碱基所构成的序列（具体而言，为序列号I所示的碱基序 列的第2265位?第2296位（第2280位/第2281位）、或序列号3所示的碱基序列的第 2265位?第2296位（第2280位/第2281位）、序列号5所示的碱基序列的第2353位? 第2384位（第2368位/第2369位）、序列号25所示的碱基序列的第2227位?第2258 位（第2242位/第2243位）、或序列号27所示的碱基序列的第2218位?第2249位（第 2233位/第2234位）。需要说明的是，括号内的碱基编号表示融合点。）、或含有它们的互 补链的探针。
[0174] 需要说明的是，本说明书中的融合点是指源自FGFR3基因的部分和源自TACC3基 因的部分融合的点。
[01巧]利用原位杂交技术的检测可W根据公知的FI甜法（化Sionassay,融合方法）来 实施。或者可通过显色原位杂交（CISH)法和银染原位杂交（SISH)法组合的融合检测方法 来头施。
[0176] 利用原位杂交技术的检测可根据公知的RNAFI甜法（J.Mol.Diagn. 2012 ;22-29) 来实施。更具体而言，从源自FGFR3基因的部分（例如，上述融合多核巧酸（mRNA)的FGFR3 基因区域内的任意部分）设计检测探针，从源自TACC3基因的部分（例如，上述融合多核巧 酸（mRNA)的TACC3基因区域内的任意部分）设计其他检测探针。与从受试者得到的试样 进行该探针的杂交。接下来，进行使信号放大的试剂的杂交，从而将信号放大。检测源自 FGFR3基因的部分的信号和源自TACC3基因的部分的信号的信号重叠。通过区别检测上述 由源自FGFR3基因的部分所设计的探针和由源自TACC3基因的部分所设计的探针的英光试 剂或发色试剂，可W观察该来源不同的二种探针是否处于相同场所（同一分子内）。通过 观察到该二种探针处于相同场所（同一分子内），可检测出检测对象多核巧酸的存在。作 为用于放大信号的试剂，可W使用PreAmplifierMixQT(Affymetrix公司），AmplifierMix QT(Affymetrix公司）、LabelProbeMix(Affymetrix公司）、及LabelProbeDiluent QT(Affymetrix公司）。
[0177]另夕b本说明书中的"严格条件"是指：作为用于杂交的条件，为"5XSSPE、 SXDenhar化'S液、0.5%十二焼基硫酸轴（sodiumdode巧1sulfate、SDS)、50% 甲醜胺、 200yg/mL娃鱼精子DNA、42°C过夜"该样的条件，作为用于清洗的条件，为"0. 5XSSC、 0. 1%SDS、42°C"该样的条件。"更严格条件"是指；作为用于杂交的条件，为"5XSS阳、 SXDenhar化'S液、0. 5%SDS、50%甲醜胺、200yg/mL娃鱼精子DNA、42°C过夜"该样的条 件，作为用于清洗的条件，为"0. 2XSSC、0. 1%SDS、65°C"该样的条件。
[0178] 此外，可W利用RT-PCR等基因扩增技术。对于RT-PCR法，通过在基因的扩增过程 中使用PCR扩增监测（实时PCR)法佑enomeRes.，6(10)，986, 1996)，可对检测对象多核巧 酸的存在进一步进行定量的分析。作为PCR扩增监测法，例如可W使用ABIPRISM7900( 7 古义，厶乂'公司）。实时PCR为公知的方法，市售有用于其的装置及试剂盒， 可利用它们简便地进行。
[0179] 本发明中的融合基因或融合蛋白的检测可通过直接检测从受试者得到的试样中 的检测对象多核巧酸所编码的多肤（W下称为"检测对象多肤"）的存在来实施。"FGFR3和 TACC3的融合蛋白"为检测对象多核巧酸所编码的多肤（即，检测对象多肤）。检测对象多 肤中，将由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肤称为FGFR3-TACC3融合多肤VI，将由序 列号4所示的氨基酸序列构成的多肤称为FGFR3-TACC3融合多肤v2,将由序列号6所示的 氨基酸序列构成的多肤称为FGFR3-TACC3融合多肤v3,将由序列号26所示的氨基酸序列 构成的多肤称为FGFR3-TACC3融合多肤v5a，将由序列号28所示的氨基酸序列构成的多肤 称为FGFR3-TACC3融合多肤V化。将FGFR3-TACC3融合多肤vl、FGFR3-TACC3融合多肤v2、 FGFR3-TACC3融合多肤v3、FGFR3-TACC3融合多肤v5a、FGFR3-TACC3融合多肤V化统称为 FGFR3-TACC3 融合多肤（FGFR3-TACC3 融合蛋白）。
[0180] 例如，在对检测对象多肤进行检测的步骤中，检测也可W通过将免疫学测定法及 酶活性测定法组合后的方法等来实施，其中所述免疫学测定法通过制备源自从受试者得到 的试样（例如从受试者得到的癌组织或细胞）的可溶化液，并将其中所含的检测对象多肤 与相对于构成融合多肤的各蛋白质的抗体（例如，相对于FGFR3的抗体和相对于TACC3的 抗体）进行组合来进行。另外，也可W通过免疫组织染色技术来实施检测，其中所述免疫组 织染色技术通过将进行了适宜前处理（例如除去石蜡）的由某受试者得到的试样（例如 FFPE切片）中所含的检测对象多肤与构成融合多肤的各蛋白质的抗体（例如相对于FGFR3 的抗体和相对于TACC3的抗体）进行组合来进行。作为该些方法，可列举：将特异性的单克 隆抗体或多克隆抗体用于检测对象多肤的酶免疫测定法、双抗体夹也化ISA法、英光免疫 测定法、放射免疫测定法、Western印迹法、免疫组织染色等方法。
[0181] 利用免疫组织染色技术的检测可根据W-分子单位特异性地检测目标多肤的公 知的技术ProximityLigationAssay(^t-Met)Iods. 2006 ;995-1000)来实施。更具体而 言，使用识别上述融合多肤的源自FGFR3基因的部分的抗体和识别上述融合多肤的源自 TACC3基因的部分的抗体，并利用上述技术检测该二个抗体识别同一分子，从而对检测对象 多肤的存在进行检测。更具体而言，检测可通过如下步骤实施；i)使识别所述融合多肤的 源自FGFR3基因的部分的抗体（一次抗体）及识别所述融合多肤的源自TACC3基因的部分 的抗体（一次抗体）与从受试者得到的试样相接触的步骤；ii)添加与该一次抗体分别结 合的并且连结有寡核巧酸的二次抗体的步骤；iii)添加溶液从而进行连接反应的步骤，其 中该溶液含有连结有该寡核巧酸的二次抗体所、与该二次抗体所连结的该寡核巧酸部分互 补的二种寡核巧酸、W及在它们接近时使其连接从而在该二次抗体间可形成环状结构的连 接酶；iv)沿所形成的环状结构使核酸伸长的步骤；V)使能够与伸长的核酸杂交的经标记 的寡核巧酸探针杂交的步骤；Vi)检测该标记信号的步骤。作为某种方案，可W使用PLA探 针或DuolinkII试剂试剂盒W及DuolinkIIBri曲tfield试剂试剂盒（Olink公司）中 所含的试剂。
[0182] 在从由受试者得到的试样中检测出本发明检测方法中的检测对象多核巧酸或检 测对象多肤的情况下，该受试者为具有该多核巧酸或该多肤阳性的癌的对象（患者），因此 成为通过抑制本发明多肤的物质（在某种方案中为化合物AZD4547、化合物DovitiniKA 合物BGJ398或化合物LY2874455)进行治疗的适用对象。
[0183] <本发明的检测用试剂盒、本发明的引物组、本发明的探针组〉
[0184] 含有本发明的引物组的检测用试剂盒中至少含有W能够特异性地扩增本发明检 测方法中的检测对象多核巧酸的方式所设计的正义引物及反义引物（也称为引物组）。本 发明的引物组为起到检测对象多核巧酸扩增用的引物作用的多核巧酸组。
[0185] 本发明的引物组包括该样的引物组，其含有根据源自FGFR3基因的部分设计的正 义引物W及根据源自TACC3基因的部分设计的反义引物，并且是用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物组，其中，该反义引物由在严格条件下（优选更严格条件下） 与"检测对象多核巧酸"杂交的核酸分子（优选至少16个碱基的核酸分子）构成，该正义 引物由在严格条件下（优选更严格条件下）与"检测对象多核巧酸"的互补链杂交的核酸 分子（优选至少16个碱基的核酸分子）构成。
[0186] 在本发明的引物组中，也可WW与含有该融合多核巧酸的融合点（上述）的部分 对应的方式来设计正义引物或反义引物的一者。
[0187] 作为本发明的引物组的具体的方案，可列举选自由W下（1)?（5)构成的组中的 引物组：
[018引 （1)由序列号1的碱基编号1到2280间任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸 构成的正义引物W及由与序列号1的碱基编号2281到2856间任意的连续的至少16个碱 基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成的反义引物的引物组；
[0189] (2)由序列号3的碱基编号1到2280间任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸 构成的正义引物W及由与序列号3的碱基编号2281到2961间任意的连续的至少16个碱 基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成的反义引物的引物组；
[0190] (3)由序列号5的碱基编号1到2368间任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸 构成的正义引物W及由与序列号5的碱基编号2369到3003间任意的连续的至少16个碱 基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成的反义引物的引物组；
[0191] (4)由序列号25的碱基编号1?2242中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸 构成的正义引物W及由与序列号25的碱基编号2243?3144中任意的连续的至少16个碱 基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成的反义引物的引物组；
[0192] (5)由序列号27的碱基编号1?2233中任意的连续的至少16个碱基的寡核巧酸 构成的正义引物W及由与序列号27的碱基编号2234?3135中任意的连续的至少16个碱 基的寡核巧酸互补的寡核巧酸构成的反义引物的引物组。
[0193] 在上述引物组中，优选的是，正义引物和反义引物的选择位置的间隔为化bW下， 或者由正义引物和反义引物扩增的扩增产物的大小为化bW下。
[0194] 另外，本发明的引物通常具有15?40个碱基、优选具有16?24个碱基、进一步 优选具有18?24个碱基、特别优选具有20?24个碱基的链长。
[0195] 在本发明的检测方法中，本发明的引物组可用于检测对象多核巧酸的扩增及检 巧1|。另外，本发明的引物组中所含的各引物没有特别限定，例如，可通过化学合成法来制造。
[0196] 含有本发明的探针组的检测用试剂盒中至少含有W能够特异性地与本发明检测 方法中的检测对象多核巧酸杂交的方式设计的、根据源自FGFR3基因的部分（例如，上述融 合多核巧酸（mRNA)的FGFR3基因区域内的任意部分）设计的探针组W及根据源自TACC3 基因的部分（例如，上述融合多核巧酸（mRNA)的TACC3基因区域内的任意部分）设计的探 针组（也称为探针组），W及将杂交后的信号放大的试剂。该探针组为起到与检测对象多核 巧酸杂交的探针组作用的多核巧酸的组。
[0197] 本发明的探针组包括该样的探针组，该探针组含有根据源自FGFR3基因的部分 (例如上述融合多核巧酸（mRNA)的FGFR3基因区域内的任意部分）设计的探针和根据源自 TACC3基因的部分（例如上述融合多核巧酸（mRNA)的TACC3基因区域内的任意部分）设计 的探针，所述探针组用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因，其中各探针由与"检测 对象多核巧酸"杂交的核酸分子构成。
[0198] 在某种方案中，各探针为分支DNA探针化ranchedDNAprobe)，基于序列信息的分 支DNA探针可W从Affymetrix公司获得。
[0199] 作为本发明的探针组的具体的方案，可列举选自由W下（1)?（3)构成的组中的 探针组：
[0200] (1)探针组，其含有：多种由邻接的探针对所构成的探针组（优选含有20种探针 组），其中该邻接的探针对含有与序列号1的碱基编号1?2280中任意的连续的至少16 个碱基互补的寡核巧酸；W及多种由邻接的探针对所构成的探针组（优选含有20种探针 组），其中该邻接的探针对含有与序列号1的碱基编号2281?2856中任意的连续的至少 16个碱基互补的寡核巧酸；
[0201] (2)探针组，其含有：多种由邻接的探针对所构成的探针组（优选含有20种探针 组），其中该邻接的探针对含有与序列号3的碱基编号1?2280中任意的连续的至少16 个碱基互补的寡核巧酸；W及多种由邻接的探针对所构成的探针组（优选含有20种探针 组），其中该邻接的探针对含有与序列号3的碱基编号2281?2961中任意的连续的至少 16个碱基互补的寡核巧酸；
[0202] (3)探针组，其含有：多种由邻接的探针对所构成的探针组（优选含有20种探针 组），其中该邻接的探针对含有与序列号5的碱基编号1?2368中任意的连续的至少16 个碱基互补的寡核巧酸；W及多种由邻接的探针对所构成的探针组（优选含有20种探针 组），其中该邻接的探针对含有与序列号5的碱基编号2369?3003中任意的连续的至少 16个碱基互补的寡核巧酸。
[0203] 在此，由邻接的探针对所构成的探针组多的情况下容易获得信号，故优选。在某种 方案中，可使用20种左右。
[0204] 在本发明的检测方法中，本发明的探针组可用于检测对象多核巧酸的检测。另外， 本发明的探针组中所含的各探针没有特别限定，例如可通过化学合成法来制造。
[0205] <本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌的治疗用医药组合物〉
[0206] 从癌症患者的检体中分离鉴定的融合多核巧酸（实施例1?3)表现为癌的致病 基因（实施例8、实施例11)，在一部分肺癌或膀脫癌症患者中检测到融合多核巧酸的存在 (实施例4?6)。此外，基于本发明人等发现的通过抑制本发明的多肤的活性和/或表达 来抑制销定非依赖性细胞增殖（即显示抗癌作用）该样的新见解（实施例9、实施例12、实 施例13、实施例14、实施例16)可知，抑制本发明的多肤（抑制本发明的多肤的活性和/或 表达）的物质具有治疗本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌的效果。
[0207] 本发明中包括本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌的治疗用医药组 合物，该医药组合物W抑制本发明的多肤的物质（例如，通过任意一种筛选方法从后述的 医药组合物的有效成分所得到的物质[例如双链核酸（包含SiRNA)、蛋白质（包含抗体或 抗体片断）、肤、或除此W外的化合物])为有效成分。
[020引本发明的医药组合物中的有效成分可通过对后述的医药组合物的有效成分进 行筛选的方法来选择。例如，可列举后述的实施例9记载的化合物DovitiniMciinical CancerReserach2011 ;17:7451-7461 中记载的化合物、4-氨基-5-氣-3-[6-(4-甲基 脈嗦-I-基）-IH-苯并[d]咪哇-2-基]唾晰-2(I氨）-丽）、AZD4547 (W02008075068 实施例 154 和AACR2011,海报 3568;标题；"CharacterizationOfAZD4547: Anorallybioavailable,potentandselectiveinhibitorofFGFRtyrosine kinasesl，2and3"中记载的化合物、N-{5-[2-化5-二甲氧基苯基）己基]-2H-化 哇-3-基} -4-[ (3R，5巧-3, 5-二甲基脈嗦-1-基]苯甲醜胺）、及BGJ398(Journal ofMedicinalChemistry2011 ;54;7066-7083 中记载的化合物、3-(2,6-二 氯-3,5-二甲氧基-苯基）-1-{6-[4-(4-己基-脈嗦-1-基）、实施例21中记载的 化合物LY2874455(W02010129509 实施例 1;MolCancerTher, 2011，10,2200-2210 ; (R)-似-2-{4-巧-{5-[1-(3, 5-二氯化巧-4-基）己氧基]-IH-日引哇-3-基}己帰 基]-IH-化哇-1-基}己醇）。另外，可列举；制造例1?5、实施例29及实施例30中所 记载的化合物，即5- [ (2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N- {3-甲氧基-4- [4- (4-甲 基脈嗦-1-基）脈巧-1-基]苯基}嚼巧-2-胺（化合物A)、2-[4-({5-[化6-二 氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-IH-化哇-1-基]己醇（化合物B)、 (2时-3-[4-({5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-把-化 哇-1-基]丙焼-1,2-二醇（化合物C)、5-[化6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧 基]-N-[4-(4-甲基脈嗦-1-基）苯基]嚼巧-2-胺（化合物D)、5-[化6-二氣-3, 5-二 甲氧基予基）氧基]-N-U-甲基-5-[ (4-甲基脈嗦-1-基）甲基]-IH-化哇-3-基}嚼 巧-2-胺（化合物巧。
[0209] 另外，可W将从公知的具有FGFR3抑制活性的低分子化合物（FGFR3抑制剂）中通 过后述的筛选医药组合物的有效成分的方法所选出的化合物用作本发明的医药组合物中 的有效成分。特别是可示出化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398及化合物 LY2874455。
[0210] 作为本发明的医药组合物的有效成分所示出的双链核酸由双链的核酸（RNA或 DNA)部分和优选为正义链及反义链的3'末端的突出（*一八'一八シク）构成，并且衍生 RNAi。RNAi为进化性保存的现象，经由利用RNaseIII内切酶产生的21?23个碱基的双链 核酸而产生佑enesDev. 15, 485-490, 2001)。3'侧的突出分别为1或2个碱基的任意的核 酸，但优选为2个碱基。需要说明的是，上述碱基数（21?23个碱基）为包含突出在内的 正义链或反义链各自的碱基数。另外，正义链及反义链可W为相同的碱基数，也可W为不同 的碱基数，但优选为相同的碱基数。
[021。 作为构成双链核酸的3'侧突出的核糖核酸，例如可W使用U(尿嚼巧）、A(腺嘿 岭）、G(鸟嘿岭）、或C(胞嚼巧），并且作为构成3'侧的突出的脱氧核糖核酸，例如可W使 用dT(脱氧胸腺嚼巧）、dA(脱氧腺嘿岭）、dG(脱氧鸟嘿岭）、或dC(脱氧胞嚼巧）。
[0212] 可用作本发明的医药组合物的有效成分的双链核酸为该样的双链核酸：其双链部 分基于序列号1、序列号3及序列号5中记载的碱基设计，并且具有抑制本发明的多肤表达 的活性。
[0213]W抑制本发明的多肤的物质（例如，通过后述的医药组合物的有效成分筛选的方 法所得到的物质[例如双链核酸、蛋白质（包含抗体或抗体片断）、肤、或除此W外的化合 物])为有效成分的制剂，可W根据上述有效成分的类型，使用它们的制剂化中通常使用的 药理学上容许的载体、赋形剂和/或其他添加剂来制备成医药组合物。
[0214] 作为给药，例如可列举：利用片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、或口服液 体制剂等的经口给药，或者利用静脉注射（包含点滴）、肌肉注射、或者皮下注射等注射剂、 栓剂、经皮给药制剂、或膀脫内注入或经粘膜给药制剂等的非经口给药。特别是对于在胃中 消化的肤来说，优选静脉注射等非经口给药。
[0215] 在用于经口给药的固体组合物中，可W混合1种W上的活性物质和至少一种惰性 的稀释剂，例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、轻丙基纤维素、淀粉、聚己帰基化咯焼 丽、或偏娃酸铅酸镇等。根据常规方法，上述组合物可W含有除惰性稀释剂W外的添加剂， 例如润滑剂、崩解剂、稳定剂、或者溶解剂或助溶剂等。片剂或丸剂可W根据需要用糖衣或 者胃溶性或肠溶性物质等的膜包覆。
[0216] 用于经口的液体组合物可W包括（例如）乳剂、溶液剂、混息剂、糖浆剂、或醜剂， 并且可W含有通常所使用的惰性的稀释剂，例如精制水或己醇。上述组合物可W含有除惰 性稀释剂W外的添加剂，例如湿润剂、混息剂、甜味剂、芳香剂、或防腐剂。
[0217] 作为用于非经口的注射剂，可W包括无菌的水性或者非水性的溶液制剂、混息剂、 或乳剂。水溶性的溶液制剂或混息剂中可W含有（例如）注射用蒸觸水或生理盐水等作为 稀释剂。作为非水溶性的溶液制剂或混息剂的稀释剂，例如可W包括丙二醇、聚己二醇、植 物油（例如橄揽油）、醇类（例如己醇）、或聚山梨醇醋80等。上述组合物可进一步含有湿 润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、溶解剂或者助溶剂、或防腐剂等。上述组合物可利用（例如） 通过细菌截留滤器的过滤、配合杀菌剂、或照射来进行无菌化。另外，在制造无菌的固体组 合物并使用时，也可W溶解于无菌水或其他无菌用注射用介质中来使用。
[021引给药量可考虑有效成分（即通过医药组合物的有效成分的筛选方法所得到的物 质）的活性强弱、症状、给药对象的年龄、或性别等来适宜确定。优选的是，肿瘤附近的血中 浓度或肿瘤内浓度为药剂能够50 %抑制本发明的多肤的活性或表达时的浓度的3?30倍、 例如10倍该样的量，并且给药量可根据途径而算出。例如，在经口给药的情况下，通常对于 成人（W体重60kg计）来说其给药量每天约为0. 1?lOOmg，优选0. 1?50mg。在非经口 给药的情况下，对于注射剂的形态而言，每天为0.Ol?50mg，优选为0.Ol?IOmgD
[0219] 本发明的医药组合物的治疗对象为检测到本发明的多核巧酸和/或本发明的多 肤的存在的受试者（即，本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌症患者）。因本发 明的多核巧酸而癌化的细胞被抑制本发明的多肤的物质杀灭，因此，抑制本发明的多肤的 物质成为本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（特别是肺癌或膀脫癌）的有效 治疗剂。
[0220] W下示出化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、及化合物E的制造方法。需要说 明的是，在本文中，"ESI+"表示质量分析中的m/z值（离子化法ESI、(M+H)+) ,"APCI/ESI+" 表示质量分析中的m/z值（同时测定离子化法APCI和ESI、(M+H)+) ,"NMRl"表示二甲基亚 讽-de中Ih-NMR的 5 (卵m)，"NMR2"表示CDCls中的Ih-NMR的 5 (卵m)。
[0221] 制造例1化合物A的制造
[022引 （1)将3, 5-二甲氧基苯甲酸甲醋（Ig)和己膳（20mL)的混合物冰冷却，加入 N-氣-N' -(氯甲基）H己二胺双（四氣测酸盐）（4. 09g)，在室温下彻夜揽拌。向反应混合 物中加入饱和碳酸氨轴水，用醋酸己醋萃取。有机层用饱和食盐水清洗后，加入无水硫酸轴 及碱性娃胶，揽拌30分钟后过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣用娃胶柱层析（醋酸己醋/ 己焼）精制，得到2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基苯甲酸甲醋（292mg)。
[0223] ESI+ :233.
[0224] 似将2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基苯甲酸甲醋（IOg)和四氨巧喃（50血）的混合物 冰冷却，加入测氨化裡（3.OM四氨巧喃溶液，43mL)后，在室温下揽拌65小时。将反应混合 物再次冰冷却，再加入测氨化裡（3.OM四氨巧喃溶液，14mL)，在室温下揽拌22小时。将反 应混合物冰冷却，缓慢地加入到冰水（300mL)中。再缓慢地加入浓盐酸（25mL)，在室温下揽 拌1小时。用甲苯/醋酸己醋（1 ;1)萃取，将有机层用饱和碳酸氨轴水W及饱和食盐水清 洗后，用无水硫酸轴干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到（2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基苯基） 甲醇（8. 67g)。
[0225] ESI+ :205.
[0226] (3)将化6-二氣-3,5-二甲氧基苯基）甲醇a.71g)、H己胺化57血）及四氨 巧喃（34mL)的混合物冰冷却，加入甲賴醜氯（716UL)后，揽拌1小时。在反应混合物中加 入水，用醋酸己醋萃取。将有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸轴干燥后过滤。将滤液减 压浓缩，得到2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基甲賴酸醋（2. 32g)。
[0227]NMR2 ;3. 04 (3H,S)、3. 88 化H,S)、5.：34 (2H,S)、6.72 (1H,t, J =8. 2Hz).
[022引（4)在2-氯-5-轻基嚼巧（4.38g)、碳酸钟化27g)及N，N-二甲基甲醜胺 (79血）的混合物中加入2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基甲賴酸醋（7. 89g)，之后在6(TC下揽拌1小时。在反应混合物中加入水，滤取所产生的固体，用水清洗后，减压干燥，得到 2-氯-5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧巧.53g)。
[0229] APCI/ESI+ :317.
[0230] (5)在氮气氛下，在室温下向2-氯-5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基] 嚼巧（l.〇3g)、3-甲氧基-4-[4-(4-甲基脈嗦-1-基）脈巧-1-基]苯胺（1.29g)、l，r-联 蔡-2, 2' -二基双（二苯基麟H609mg)、碳酸飽化19g)及二嗯焼（20. 6血）的混合物中 加入醋酸把（146mg)，在IOOC下揽拌4小时。在反应混合物中加入水，用醋酸己醋萃取。 将有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸镇干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣用娃胶 柱层析（氯仿/甲醇/浓氨水）精制、接着用碱性娃胶柱层析（醋酸己醋）精制后，用醋 酸己醋、接着用己醇重结晶，得到5-[(2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N-{3-甲氧 基-4-[4-(4-甲基脈嗦-1-基）脈巧-1-基]苯基}嚼巧-2-胺（化合物A ;830mg)。 [023。ESI+:585.
[023引醒Rl :1.45-1. 60 (2H，m)、1.73-1. 84 (2H，m)、2. 14 (3H，s)、2. 17-2. 58 (llH，m)、 3. 24-3. 36 (2H, m)、3. 75(3H, s)、3. 87(6H, s)、5. 16(2H, s)、6. 79(1H，d, J = 8. 8Hz)、7.07(lH，t，J = 8.4Hz)、7.24(lH，dd，J = 8.8、2.4Hz)、7. 32(lH，d，J = 2. 4Hz)、 8. 29(2H, s)、9. 21(1H, s).
[0233] 制造例2化合物B的制造
[0234] (I)在氮气氛下，在室温下向通过与制造例1(4)同样的方法所制造的 2-氯-5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧巧OOmg)、2-(4-氨基-IH-化 哇-1-基）己醇化42mg)、1，1' -联蔡-2, 2' -二基双（二苯基麟）（472mg)、碳酸飽（2. 47g) 及二嗯焼（16mL)的混合物中加入醋酸把（113mg)，在lOCrC下揽拌6小时。在反应混合物 中加入水和氯仿，通过娃藻±过滤滤除不溶物后，利用氯仿对滤液进行萃取。有机层用饱 和食盐水清洗，用无水硫酸镇干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣用娃胶柱层析（氯仿 /甲醇）精制，得到2-[4-(巧-[化6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨 基）-IH-化哇-1-基]己醇（化合物B; 139mg)。
[0235]ESI+ :408.
[023引 醒Rl;3. 69(2H,dd,J=11. 0、5. 6Hz)、3. 87 化H,S)、4. 07(2H,t,J=5. 6Hz)、 4. 83(lH，t，J= 5. 4Hz)、5. 14(2H，s)、7. 07(lH，t，J= 8. 4Hz)、7. 45(lH，d，J= 0. 6Hz)、 7. 88 (IH,d,J= 0. 6Hz)、8. 26 (2Hs)、9. 20 (IH,s)。
[0237] 制造例3化合物C的制造
[023引 （1)在氮气氛下，在室温下向通过与制造例1 (4)同样的方法制造的 2-氯-5-[化6-二氯-3,5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧（1.33g)、l-(四氨-2H-化 喃-2-基）-lH-化哇-4-胺巧13mg)、1，1' -联蔡-2, 2' -二基双（二苯基麟）（785mg)、碳 酸飽（4.Ilg)及二嗯焼（26. 6mL)的混合物中加入醋酸把（189mg)，在IOOC下揽拌4小时。 在反应混合物中加入水，用醋酸己醋萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸轴干燥后 过滤。将滤液减压浓缩，将残渣用娃胶柱层析（醋酸己醋/己焼）精制，得到5-[(2, 6-二 氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-[l-(四氨-2H-化喃-2-基）-lH-化哇-4-基]嚼 巧-2-胺（1.73g)。
[023引 APCI/ESI+ :448.
[0240] 似在5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N-[l-(四氨-2H-化 喃-2-基）-IH-化哇-4-基]嚼巧-2-胺化59g)及甲醇（20血）的混合物中加入4M氯化氨 /二嗯焼溶液（40mL)，在室温下揽拌6小时。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中加入饱和 碳酸氨轴水。滤取所产生的固体，用二己離清洗后，减压干燥，得到5-[(2,6-二氣-3, 5-二 甲氧基予基）氧基]-N-(1H-化哇-4-基）嚼巧-2-胺（2. 9g)。
[024"APCI/ESI+:364.
[024引 做在5-[化6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-QH-化哇-4-基）嚼 巧-2-胺巧Omg)、碳酸钟巧7mg)及N,N-二甲基甲醜胺（ImL)的混合物中加入4-甲基苯 賴酸[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲醋（118mg)，在6(TC下揽拌1小时，然 后在Iicrc下揽拌4天。在反应混合物中加入水，用醋酸己醋萃取。有机层用饱和食盐水 清洗，用无水硫酸镇干燥后过滤。将滤液减压浓缩后，将得到的残渣用娃胶柱层析（醋酸己 醋/己焼）精制，得到5- [ (2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N- (1- {[ (4R) -2, 2-二 甲基-1，3-二氧戊环-4-基]甲基} -IH-化哇-4-基）嚼巧-2-胺（39mg)。
[024引APCI/ESI+ :478.
[0244] (4)在5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-a-{[(4R)-2,2-二甲 基-1，3-二氧戊环-4-基]甲基} -IH-化哇-4-基）嚼巧-2-胺（45mg)及四氨巧喃（2mL) 的混合物中加入IM盐酸（ImL),在5(TC下揽拌3小时。在反应混合物中加入饱和碳酸氨轴 水，用氯仿萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸轴干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将 残渣用娃胶柱层析（氯仿/甲醇）精制后，用醋酸己醋固化，得到（2时-3-[4-({5-[(2,6-二 氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-IH-化哇-1-基]丙焼-1,2-二醇 (化合物C;25mg)。
[024引 ESI+ :438.
[0246] NMRl ;3. 23-3. 38(2H，m)、3. 72-3. 80(lH，m)、3. 84-3. 96(7H，m)、4. 15(lH，dd，J = 13. 8、4. IHz)、4. 67 (IH, t, J = 5.細z)、4. 91 (IH, d, J = 5. 3Hz)、5. 14 (2H, s)、7. 06 (IH, t, J = 8. 4Hz)、7. 45 (IH, d, J = 0. 6Hz)、7. 87 (IH, d, J = 0. 6Hz)、8. 26 (2H, s)、9. 21 (IH, s)。
[0247] 制造例4化合物D的制造
[024引（1)与制造例1(5)同样地将4-(4-甲基脈嗦-1-基）苯胺、W及通过与制造例 1 (4)同样的方法制造的2-氯-5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧用作原料， 得到5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-[4-(4-甲基脈嗦-l-基）苯基]嚼 巧-2-胺（化合物D)。
[024引 ESI+ :472.
[0250]匪Rl :2. 21 (3H, S)、2. 41-2. 48 (4H, m)、2. 98-3. 08 (4H, m)、3. 87 (6H, S)、5. 15 (2H, S)、6. 81-6. 90 (2H, m)、7. 07 (1H, t, J = 8. 4Hz)、7. 47-7. 55 (2H, m)、8. 26 (2H, S)、 9.15(1H,S)。
[0巧1] 制造例5化合物E的制造 邮閲（1)在（1-甲基-3-硝基-IH-化哇-5-基）甲醇（398mg)、3, 4-二氨-2H-化喃(459 uL)及醋酸己醋巧血）的混合物中加入对甲苯賴酸一水合物巧6mg)，在室温下揽拌 1. 5小时。再加入3, 4-二氨-2H-化喃（459 y L)及对甲苯賴酸一水合物巧6mg)，在室温下 揽拌1.5小时。在反应混合物中加入水，用醋酸己醋萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无 水硫酸轴干燥后过滤。将滤液减压浓缩，然后将残渣用娃胶柱层析（己焼/醋酸己醋）精 制，得到1-甲基-3-硝基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲基]-IH-化哇（487mg)。
[0巧引APCI/ESI+ :242.
[0254] (2)在氮气氛下，在1-甲基-3-硝基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲 基]-IH-化哇（487mg)、四氨巧喃（4. 9血）及己醇（4. 9血）的混合物中加入10%把-碳 巧Omg)。在氨气氛下揽拌12小时后，通过娃藻±过滤除去不溶物。将滤液减压浓缩，得到 1-甲基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲基]-IH-化哇-3-胺（426mg)。
[0巧引APCI/ESI+ :212.
[0256] (3)与制造例3(1)同样地将1-甲基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲 基]-IH-化哇-3-胺、W及通过与制造例1(4)同样的方法制造的2-氯-5-[化6-二 氯-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧用作原料，得到5-[(2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基） 氧基]-N- {1-甲基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲基]-IH-化哇-3-基}嚼巧-2-胺。 [0巧7] APCI/ESI+ :492.
[0巧引 （4)在5-[(2,6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N-U-甲基-5-[(四氨-2H-化 喃-2-基氧基）甲基]-IH-化哇-3-基}嚼巧-2-胺（706mg)和甲醇巧血）的混合物中加 入4M氯化氨/二嗯焼溶液巧血)，在室温下揽拌3小时。将反应混合物减压浓缩后，在残 渣中加入饱和碳酸氨轴水，用氯仿萃取。有机层用无水硫酸轴干燥后过滤。将残渣用娃胶 柱层析（醋酸己醋/己焼）精制，获得3-({5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]嚼 巧-2-基}氨基）-1-甲基-IH-化哇-5-基]甲醇（444mg)。
[0巧引ESI+ :408.
[0260] (5)将巧-(巧-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-1-甲 基-IH-化哇-5-基]甲醇（350mg)、H己胺（359 uL)、二氯甲焼（7血）及四氨巧喃（7血） 的混合物冰冷却，加入甲賴醜氯（120yL)后，在室温下揽拌3小时。向反应混合物中加入 水及醋酸己醋，滤取所产生的固体后，减压干燥，得到甲賴酸巧-(巧-[化6-二氣-3, 5-二 甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-1-甲基-IH-化哇-5-基]甲醋（218mg)。
[026。NMR2 ;2. 96 (3H,S)、3. 85 (3H,S)、3. 89 (6H,S)、5. 16 (2H,S)、5. 25 (2H,S)、6.68(1H,t,J=8.OHz)、6. 91 (1H,S)、7. 63 (1H,brs)、8. 24 (2H,S).
[02間 做在甲賴酸巧-(巧-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨 基）-1-甲基-IH-化哇-5-基]甲醋（795mg)和N-甲基化咯焼丽（15. 9血）的混合物中加 入1-甲基脈嗦巧OlUL)，在8(TC下揽拌2小时。在反应混合物中加入水W及饱和碳酸氨 轴水，滤取所产生的固体后，将滤液用氯仿萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸轴 干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣与之前滤取的固体合并后，利用娃胶柱层析（氯仿/ 甲醇）精制，接着利用碱性娃胶柱层析（醋酸己醋/甲醇）精制后，用己醇/二异丙離固化， 得到5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-{l-甲基-5-[(4-甲基脈嗦-l-基） 甲基]-IH-化哇-3-基}嚼巧-2-胺（化合物E; 168mg)。
[026引 ESI+ :490.
[0264] 醒Rl;2. 14(3H，s)、2. 18-2. 53 巧H，m)、3.45(2H，s)、3.67(3H，s)、3.87WH，s)、 5. 15 (2H,S)、6. 46 (1H,S)、7. 06 (1H,t,J=8. 4Hz)、8. 26 (2H,S)、9. 42 (1H,S)。
[0265] <医药组合物的有效成分的筛选方法〉
[0266] 医药组合物的有效成分的筛选方法包括[1]抑制本发明的多肤的物质的筛选方 法和[2]本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（优选肺癌或膀脫癌）的治疗剂 的筛选方法。
[0267] [1]抑制本发明的多肤（抑制本发明的多肤的活性和/或表达）的物质的筛选方 法
[026引抑制本发明的多肤的物质的筛选方法只要包括下述步骤（i)?（iii)即可，没有 特别限定：
[0269] (i)使试验物质与本发明的多肤或表达本发明的多肤的细胞接触的步骤；
[0270] (ii)分析该多肤是否被抑制了的步骤；W及
[0271] (iii)选择抑制该多肤的物质的步骤。
[0272] 本筛选方法包括W下的方法。
[0273] (a)体外（invitro)型筛选方法；
[0274] 抑制本发明的多肤的活性的物质筛选方法，其特征在于，包含；（1)使试验物质与 本发明的多肤接触的步骤；(2)分析该多肤的活性是否被抑制了的步骤；W及（3)选择抑制 该多肤的活性的物质的步骤。
[0275] 化）细胞型筛选方法；
[0276] 抑制本发明的多肤的活性的物质筛选方法，其特征在于，包含；（1)使试验物质与 表达本发明的多肤的细胞接触的步骤；（2)分析该多肤的活性是否被抑制了的步骤；W及 (3)选择抑制该多肤的活性的物质的步骤。
[0277] (C)表达抑制型筛选方法
[027引抑制本发明的多肤的表达的物质筛选方法，其特征在于，包含；（1)使试验物质与 表达本发明的多肤的细胞接触的步骤；（2)分析该多肤的表达是否被抑制了的步骤；W及 (3)选择抑制该多肤的表达的物质的步骤。
[0279] W下对各筛选方法进行说明。表达本发明的多肤的细胞包括天然表达本发明的多 肤的细胞、W及通过用含有本发明的多核巧酸的载体对细胞进行转化从而表达了本发明的 多肤的细胞，但是作为表达本发明的多肤的细胞，优选通过用含有本发明的多核巧酸的载 体对细胞进行转化从而使本发明的多肤得W表达的细胞。
[0280] (a)体外型筛选方法
[0281] 体外型筛选方法包括该样的方法；在精制后的本发明的多肤中添加试验物质使其 接触（接触步骤）、与未接触试验物质时的本发明的多肤的活性进行比较从而分析通过该 试验物质是否抑制了本发明的多肤的活性（分析步骤）、选择抑制本发明的多肤的活性的 物质（即本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（优选肺癌或膀脫癌）的治疗 剂）。
[0282] 具体而言，在医药组合物的有效成分的筛选方法中，各步骤（例如）可如下实施。 在精制后的本发明的多肤中添加试验物质使其接触后，添加ATP并测定该多肤的活性。作 为对照，使该精制后的多肤与试验物质的溶剂（例如DMSO)混合接触后，添加ATP并测定该 多肤的活性。作为背景对照，可W设定未添加ATP的条件。分析本发明的多肤的活性是否 通过试验物质受到抑制。本发明的多肤的活性（即自我磯酸化活性）是否通过试验物质受 到抑制，可通过分析由试验物质引起的本发明的多肤的酪氨酸磯酸化水平的变化来判定。 目P，与添加（即接触）溶剂对照时比较，在添加（即接触）试验物质时本发明的多肤的活性 (即自我磯酸化活性）受到抑制的情况下，将该试验物质选择为抑制本发明的多肤的活性 的物质（即本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（优选肺癌或膀脫癌）的治疗 剂）。在上述步骤中，在添加ATP之前添加肤基质并混合、W及将相对于该肤基质的磯酸化 活性作为本发明的多肤的活性进行分析（即，通过分析由本发明的多肤引起的肤基质的磯 酸化水平的变化来判定通过试验物质本发明的多肤的活性是否受到抑制），除此W外，按照 与上述同样的方式进行的筛选方法也包含在本发明的体外型筛选方法中。在上述方法中， 将抑制50% W上活性时的浓度为10 y M W下、优选为1 y M W下、进一步优选为0. 1 y M W下 的物质选择为抑制本发明的多肤的活性的物质。例如，可W将实施例21的方法用作本发明 的体外型筛选方法。
[0283] 化）细胞型筛选方法
[0284] 细胞型筛选方法包括该样的方法；将表达本发明的多肤的细胞与试验物质混合 (即添加）使其接触（接触步骤）、与未接触试验物质时的本发明的多肤的活性进行比较从 而分析通过该试验物质是否抑制了本发明的多肤的活性（分析步骤）、选择抑制本发明的 多肤的活性的物质（即本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（优选肺癌或膀脫 癌）的治疗剂）。具体而言，例如可如下实施。
[02财首先，使表达本发明的多肤的细胞与试验物质或溶剂对照（例如DMSO)分别接触。 将细胞培养一定时间后，使用将培养的细胞溶解而制备的细胞溶解液，通过使用了公知的 SDS电泳法及抗磯酸化FGFR3抗体（例如Cell Si即aling Technology公司）的免疫印迹 来测定本发明的多肤的活性（即自我磯酸化活性），由此分析通过试验物质是否抑制了本 发明的多肤的活性（即自我磯酸化活性）。通过试验物质是否抑制了本发明的多肤的活性， 可通过分析由试验物质引起的本发明的多肤的酪氨酸磯酸化水平的变化来判定。目P，与添 加（即接触）溶剂对照时进行比较，在添加（即接触）试验物质时抑制了本发明的多肤的 活性的情况下，选择该试验物质作为抑制本发明的多肤的活性的物质（即本发明的多核巧 酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（优选肺癌或膀脫癌）的治疗剂）。
[0286] (C)表达抑制型筛选方法
[0287] 表达抑制型筛选方法包括该样的方法；将表达本发明的多肤的细胞与试验物质混 合（即添加）使其接触（接触步骤）、与未接触试验物质时的本发明的多肤的表达进行比较 从而分析通过该试验物质是否抑制了本发明的多肤的表达（分析步骤）、选择抑制本发明 的多肤的表达的物质（即本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（特别是肺癌或 膀脫癌）的治疗剂）。具体而言，例如可如下实施。
[028引使表达本发明的多肤的任意细胞与试验物质或溶剂对照（例如DMSO)分别接触。 培养后，制备细胞的提取物，接着，使用提取物分析通过试验物质是否抑制了本发明的多肤 的表达。是否抑制了本发明的多肤的表达可通过是否抑制了本发明的多肤的mRNA或蛋白 质的表达来分析。更具体而言，通过公知的表达量分析方法、例如nodhern印迹法、定量的 PCR法或免疫印迹法、ELISA法等来鉴定存在于上述细胞提取液中的本发明的多肤的mRNA 或蛋白质的量。通过试验物质是否抑制了本发明的多肤的表达可通过分析由试验物质引起 的本发明的多肤的表达量的变化来判定。目P，与溶剂对照接触时比较，在试验物质接触时本 发明的多肤的表达量（mRNA或蛋白质量）降低的情况下，将该试验物质选择为抑制本发明 的多肤的表达的物质（即本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（优选肺癌或膀 脫癌）的治疗剂）。
[0289] [2]本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌治疗剂的筛选方法
[0290] 抑制本发明的多肤（抑制本发明的多肤的活性和/或表达）的物质的筛选方法可 用作本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（优选肺癌或膀脫癌）的治疗剂的筛 选方法。目P，本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌的治疗剂的筛选方法包括上 述[1]中抑制本发明的多肤的物质的筛选方法中的i)、ii)及iii)。
[0291] 在本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌的治疗剂的筛选方法中，优选 还包括W下步骤：分析试验物质是否抑制了本发明的多肤、并选择抑制本发明的多肤的物 质，然后确认所选试验物质具有本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（特别是 肺癌或膀脫癌）治疗活性。
[0292] 确认所选试验物质具有本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌治疗活 性的步骤；
[0293]作为确认所选物质具有本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（特别 是肺癌或膀脫癌）治疗活性的步骤，可列举实施公知的评价方法或其改良后的方法的步 骤，例如实施对表达了本发明的多肤的培养细胞或肿瘤模型动物用所选物质进行处置并分 析的方法（临床肿瘤学第二版、癌和化学疗法公司）。
[0294]作为确认所选物质具有本发明的多核巧酸阳性或本发明的多肤阳性的癌（特别 是肺癌或膀脫癌）治疗活性的步骤，优选的是，（1)使用源自人类癌症（特别是肺癌或膀脫 癌）的内源性地表达本发明的多肤的癌细胞，确认所选试验物质具有该细胞的增殖抑制作 用和/或细胞调亡诱导作用的步骤、（2)确认所选试验物质对表达了本发明的多肤的转化 细胞的销定非依存性增殖具有抑制作用的步骤、和/或（3)确认所选试验物质对将表达本 发明的多核巧酸的细胞接种于裸鼠而形成的肿瘤增殖具有抑制作用的步骤。
[0295] 在上述的使用裸鼠的方法中，可W使用将内源性地表达本发明的多肤的癌细胞、 或通过本发明的多肤的表达而转化的细胞移植于皮下、皮内、腹腔或各脏器而得到的肿瘤 模型动物，即荷癌模型动物（例如移植了NIH3T3细胞的裸鼠等，该NIH3T3细胞表达了本发 明的多肤）。
[0296] 作为医药组合物的有效成分的筛选方法中所使用的试验物质，没有特别限定，例 如可列举市售的化合物（包括肤）、化学文件中所登记的各种公知化合物（包括肤）、通过 组合化学技术（N.Terrettetal.,DrugDiscov.Today, 4(1) :41,1999)得到的化合物组、 微生物的培养上清液、源自植物或海洋生物的天然成分、动物组织提取物、双链核酸、抗体 或抗体片断、或者对通过医药组合物的有效成分的筛选法所选择的化合物（包括肤）进行 化学或生物学修饰后的化合物（包括肤）。
[0297] 实施例
[029引下面，通过实施例对本发明进行详述，但本发明并不受限于该实施例。另外，在没 有特别说明的情况下，可依据公知的方法进行实施。另外，在使用市售的试剂或试剂盒等的 情况下，可根据市售品的指导书进行实施。
[0299] [实施例l]FGFR3-TACC3_vl的分离
[0300] 对于肺癌临床检体（美国7ス，3シK公司）200检体，使用逆转录酶 (SuperScriptIII,Iifetechnologies公司）及随机引物（随机引物，Iifetechnologies公 司）并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合成cDNA。
[0301] 接着，使用序列号7所示的FGFR3_TACC3_RT_F及序列号8所示的FGFR3_TACC3_ RT_R的引物，W上述得到的cDNA为模板，使用DNA聚合酶（TaKaRaEx化9Jakara-Bio株 式会社）进行PCR(将98C10砂、55°C15砂、68C1分钟30砂进行30次循环）。然后，W 10倍稀释后的上述PCR产物为模板，使用序列号9所示的FGFR3_TACC3_nested_F及序列 号10所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98°C15 砂、55°C15砂、68°C1分钟进行30次循环）。PCR反应后，进行电泳，结果仅在样品Lg344 中得到约500个碱基对化P)的PCR产物。
[030引然后，通过双脱氧测序法对PCR产物进行序列确定炬i曲yeTerminator v3.I切cleSequencingKit;lifetechnologies公司）。结果可知，约 500bp的PCR产物为 NCBI中所注册的FGFR3基因（NMJ)Ol163213. 1)的编码序列（W下CD巧的外显子18的3' 末端与TACC3基因（NM_006342. 1)的CDS的外显子11的5'末端融合的序列。
[0303] 对于源自扁平上皮肺癌患者肺癌组织的RNA(美国7义，3シF公司）Lg344检 体RNA,使用逆转录酶（SuperScriptIII、Iifetechnologies公司）及oligo(dT)引物 (oligo(dT) 20引物、Iifetechnologies公司）并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合 成cDNA。
[0304] 接着，使用序列号11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列号12所示 的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，W上述得到的CDNA作为模板，使用DNA聚合酶 〇(OD-plus-Ver. 2 ;东洋纺织株式会社）进行PCR(将98C15砂、6(TC15砂、68C3分钟30 砂进行25次循环）。然后，W10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号13所示的 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列号 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引 物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98°C15砂、55°C15砂、68°C3分钟30砂进行25 次循环）。PCR反应后，进行电泳，结果得到约2. 9化P的PCR产物。将PCR产物克隆到克隆 载体（TOPOXLPCRCloningKit;lifetechnologies公司）中。插入物通过双脱氧测序法 来石角定序列炬igDyeTerminatorv3.!CycleSequencingKit;lifetechnologies公司）。 结果可知，在约2.她bp的PCR产物中，存在NCBI中所登记的FGFR3基因（NM_001163213.I) 的从CDS的5'末端到外显子18的3'末端与TACC3基因（NM_006342. 1)的从CDS的外显 子11的5'末端到CDS的3'末端融合的转录产物（FGFR3-TACC3_vl)(序列号1)。将由序 列号1编码的多肤示于序列号2。
[0305] 另外，为了将FGFR3-TACC3_vl的ORF全长表达为蛋白质，将上述克隆载体用限制 酶BamHI进行37°C、3小时的酶反应，从而对经限制酶处理了的DNA片断进行精制，再用 EcoRI进行37C、3小时的酶反应，从而对经限制酶处理了的DNA片断进行精制。将含有该 ORF的DNA片断克隆到存在于表达载体（pMXs-puro;Cosmobio公司）的多克隆位点中的 BamHI及EcoRI位点中，从而构建表达质粒（FGFR3-TACC3_vl/pMXs-puro)。
[0306][实施例 2]FGFR3-TACC3_v2 的分离
[0307] 对于膀脫癌临床检体（美国7ス，3シF公司）59检体，使用逆转录酶 (SuperScriptni、lifetechnologies公司）及随机引物（随机引物、Iifetechnologies公 司）并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合成cDNA。
[030引接着，使用序列号7所示的FGFR3_TACC3_RT_F及序列号8所示的FGFR3_TACC3_ 尺1'_1?的引物，W上述得到的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶（TaKaRaExTaqJakara-Bio 株式会社）进行PCR(将98C10砂、55C15砂、68C1分钟30砂进行30次循环）。然 后，W10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号9所示的FGFR3_TACC3_nested_F 及序列号10所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将 98C15砂、55C15砂、68C1分钟进行30次循环）。PCR反应后，进行电泳，结果可知，在 样品Bdioe检体中得到约6(K)bp的PCR产物。
[0309] 然后，通过双脱氧测序法对PCR产物进行序列确定炬i曲ye Terminator v3. I切cle Sequencing Kit;lifetechnologies公司）。结果可知，约600bp的PCR产物为 NCBI中所注册的FGFR3基因（NMJ)Ol 163213. 1)的CDS的外显子18的3'末端与TACC3基 因（NM_006342. 1)的CDS的外显子10的5'末端融合的序列。
[0310] 对于源自膀脫癌患者膀脫癌组织的RNA(美国7义，3シF公司）Bdioe检 体RNA,使用逆转录酶（SuperScriptlll、Iifetechnologies公司）及oligo(dT)引物 (oligo(dT) 20引物、Iifetechnologies公司）并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，从 而合成cDNA。
[0311] 接着，使用序列号11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列号12所示 的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，W上述得到的CDNA作为模板，使用DNA聚合酶 化OD-plus-Ver. 2 ;东洋纺织株式会社）进行PCR(将98C15砂、6(TC15砂、68C3分30砂 进行25次循环）。然后，W10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号13所示的 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列号 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物 并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98C15砂、55C15砂、68C3分30砂进行25次循 环）。PCR反应后，进行电泳，结果可知得到约3. 0化P的PCR产物。将PCR产物克隆到克隆 载体（TOPOXLPCRCloningKit;lifetechnologies公司）中。插入物通过双脱氧测序法 来石角定序列炬igDyeTerminatorv3.!CycleSequencingKit;lifetechnologies公司）。 结果可知，在约3. 0化P的PCR产物中，存在NCBI中所注册的FGFR3基因（NM_001163213.I) 的从CDS的5'末端到外显子18的3'末端与TACC3 (NM_006342. 1)的从CDS的外显子10 的5'末端到CDS的3'末端融合的转录产物（FGFR3-TACC3_v2)(序列号3)。将由序列号3 编码的多肤示于序列号4。
[0312]另外，为了将FGFR3-TACC3_v2的ORF全长表达为蛋白质，将上述克隆载体用限制 酶进行37〇C、3小时的酶反应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制，再用EcoRI进 行37C、3小时的酶反应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制。将含有该ORF的DNA片 断克隆到存在于表达载体（pMXs-puro;Cosmobio公司）的多克隆位点中的BamHI及EcoRI 位点中，从而构建表达质粒（FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro)。
[031引[实施例3]FGFR3-TACC3_v3的分离
[0314] 对于膀脫癌临床检体（美国7ス，3シF公司）59检体，使用逆转录酶 (SuperScriptni、lifetechnologies公司）及随机引物（随机引物、Iifetechnologies公 司）并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，从而合成cDNA。
[0315] 接着，使用序列号7所示的FGFR3_TACC3_RT_F及序列号8所示的FGFR3_TACC3_ 尺1'_1?的引物，W上述得到的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶（TaKaRaExTaqJakara-Bio 株式会社）进行PCR(将98C10砂、55C15砂、68C1分钟30砂进行30次循环）。然后，W 10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号9所示的FGFR3_TACC3_nested_F及序列 号10所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98C15 砂、55C15砂、68C1分钟进行30次循环）。PCR反应后，进行电泳，结果可知在样品B加21 检体中得到约65化P的PCR产物。
[031引然后，通过双脱氧测序法对PCR产物进行序列确定炬i曲ye Terminator v3. I切cle Sequencing Kit;lifetechnologies公司）。结果可知，约650bp的PCR产物为 NCBI中所注册的FGFR3基因（NM_001163213. 1)的CDS的外显子19的中间序列与TACC3基 因（NM_006342. 1)的内含子10-11的一部分融合，再与TACC3基因的CDS的外显子11的5' 末端融合的序列。
[0317]对于源自膀脫癌患者膀脫癌组织的RNA(美国7ス，3シF公司）B加21检 体RNA,使用逆转录酶（SuperScriptlll、Iifetechnologies公司）及oligo(dT)引物 (oligo(dT) 20引物、Iifetechnologies公司）并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合 成cDNA。 防31引接着，使用序列号11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列号12所示 的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，W上述得到的CDNA作为模板，使用DNA聚合酶 〇(OD-plus-Ver. 2 ;东洋纺织株式会社）进行PCR(将98°C15砂、60°C15砂、68°C3分钟30 砂进行25次循环）。然后，W10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号13所示的 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列号 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物 并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98C15砂、55C15砂、68C3分钟30砂进行25次 循环）。PCR反应后，进行电泳，结果可知得到约3.0化P的PCR产物。将PCR产物克隆到克 隆载体（TOPOXLPCRCloningKit;lifetechnologies公司）中。插入物通过双脱氧测序 法石角定序列炬igDyeTerminatorv3.!CycleSequencingKit;lifetechnologies公司）。 结果可知，在约3. 0化P的PCR产物中，存在NCBI中所注册的FGFR3基因（NM_001163213.I) 的从CDS的5'末端到外显子19的中间序列与TACC3基因（NM_006342. 1)的内含子10-11 的一部分融合，再与TACC3的从CDS的外显子11的5'末端到CDS的3'末端融合的转录产 物（FGFR3-TACC3_v3)(序列号5)。将由序列号5编码的多肤示于序列号6。
[0319] 另外，为了将FGFR3-TACC3_v3的ORF全长表达为蛋白质，将上述克隆载体用限制 酶进行37〇C、3小时的酶反应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制，再用EcoRI进 行37C、3小时的酶反应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制。将含有该ORF的DNA片 断克隆到存在于表达载体（pMXs-puro;Cosmobio公司）的多克隆位点中的BamHI及EcoRI 位点中，从而构建表达质粒（FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro)。
[0320][实施例 4]FGFR3-TACC3_vl的检测
[032。从源自肺癌临床检体的RNA(美国7义，3シF公司）200样品制作cDNA，W cDNA作为基质，W序列号15所示的FGFR3-TACC3 (F18T11)_qPCR_F及序列号16所示 的FGFR3-TACC3(F18Tll)_qPCR_R作为引物组，使用定量PCR试剂盒（PowerSYBRGreen PCRMasterMix;lifetechnologies公司），通过应用生物系统7900HT系统进行定量 PCR(95C10分钟之后，将95C15砂、59C60砂进行45次循环），测定基因表达量。结果，在 肺癌检体中，仅在上述的样品L的44中确认到扩增。另外，由源自膀脫癌临床检体的RNA(美 国7ス，3シF公司）59样品制作cDNA，WCDNA作为基质按同样方式实施，结果从多个检 体确认到扩增。
[032引[实施例5]FGFR3-TACC3_v2的检测
[032引 由源自膀脫癌临床检体的RNA(美国7义，3シF公司）59样品制作cDNA， WcDNA作为基质，W序列号17所示的FGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_F及序列号18所示 的FGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_R作为引物组，使用定量PCR试剂盒（PowerSYBRGreen PCRMasterMix;lifetechnologies公司），通过应用生物系统7900HT系统进行定量 PCR(95°C10分钟之后，将95C15砂、59C60砂进行45次循环），测定基因表达量。结果， 在膀脫癌检体中，从多个检体确认到扩增。
[0324][实施例 6]FGFR3-TACC3_v3 的检测
[032引由源自膀脫癌临床检体的RNA(美国7义，3シF公司）59样品制作cDNA，WcDNA作为基质，W序列号19所示的FGFR3-TACC3(F19Tll)_qPCR_F及序列号20所示 的FGFR3-TACC3(F19Tll)_qPCR_R作为引物组，使用定量PCR试剂盒（PowerSYBRGreen PCRMasterMix;lifetechnologies公司），通过应用生物系统7900HT系统进行定量 PCR(95C10分钟之后，将95C15砂、59C60砂进行45次循环），测定基因表达量。结果， 在膀脫癌检体中，从多个检体确认到扩增。
[0326][实施例7]FGFR3-TACC3_vl的逆转录酶病毒溶液的制作
[0327]使用FGFR3-TACC3_vl/pMXs-puro(实施例 1) 9yg、转染试剂（FUGE肥（注册商 标）皿、Roche公司）对Platinum-E细胞实施转染。转染24小时后，交换含有10%牛血清 (NICHIREIBI0SCIENCE公司）的D-MHM培养基值U化ecco'SModifiedEagleMedium培养 基；Invitrogen公司），进一步采集24小时的培养基上清液，W制作逆转录酶病毒溶液。 [032引[实施例引FGFR3-TACC3_vl的销定非依赖性增殖亢进作用的研究
[0329] 在实施例7中的使用FGFR3-TACC3_vl/pMXs-puro制作的病毒溶液中W4yg/mL 的浓度添加化Iybrene任olybrene;SIGMA-ALDRICH公司）后，添加到NI册T3细胞中使其感 染。添加6小时后，交换为含有10%牛血清（NICHIREIBI0SCIENCE公司）的D-MEM培养基， 感染1天后，交换为含有10 %牛血清（NICHIREIBI0SCIENCE公司）及1yg/mL的嘿岭霉素 (SIGMA-ALDRICH公司）的D-MBl培养基（Invitrogen公司），在 5%C〇2存在下、在 37°C下 继续培养4周，获得稳定表达FGFR3-TACC3_vl的NI册T3细胞。（命名为FGFR3-TACC3_vl 表达/NI册T3细胞。）
[0330] 为了研究FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞的销定非依赖性增殖亢进能力， 将FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞及感染有作为空载体的pMXs-puro的NI册T3细胞 (Mock/NI册T3细胞）分别W每一个孔为IXIO3个的方式用含有10%牛血清（NICHIREI BIOSCIENCE公司）的D-MEM培养基（Invitrogen公司）接种到96孔球形板（Sumilon Cellti曲t Spheloi贴6U;住友Bakelite公司）中。在5%C〇2存在下、在37°C下培养后， 使用细胞数测定试剂（CEIXTITER-Glo? Luminescent Cell Vi油ility Assay ;Promega公 司）并依据手册的方法测定次日值ayl)及四日后值ay4)的细胞数。检测时使用了发光 测定装置。从化yl到化y4为止，Mock/NI册T3细胞的细胞数的计数未增加，与此相对，从 化yl到化y4为止，确认到FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞的细胞数的计数增加约3. 1 倍。由上可知，FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞显示销定非依赖性细胞增殖。
[033。[实施例9]融合多肤抑制剂对于FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞的销定非依 赖性细胞增殖抑制作用
[0332] 销定非依赖性细胞增殖的测定（菌落法等）已知作为研究化合物抗癌作用（药理 效果）的体系（临床肿瘤学第二版，癌和化学疗法公司）。作为代替菌落法的测定细胞非粘 接性增殖的方法，有使用如上所述的球形板的方法。
[0333] 将FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞W每一个孔为lX103个的方式用含有10% 牛胎儿血清的DMEM培养基接种于96孔球形板（SumilonCellti曲tSpheloi贴6U;住友 Bakelite公司）中。另外，作为阳性对照用，准备了仅添加有培养基的孔。在5% (?存在 下、在37°C下培养一晚后，添加Dovitinib、AZD4547及BGJ398使最终浓度为lOOnM。作为 阴性对照，W与化合物添加时浓度（0. 1%)相同的方式添加化合物的溶剂即DMS0。然后，在 5%C〇2存在下、在37°C下培养4天，添加细胞数测定试剂（CellTiter-Glo?Luminescent CellVi油ilityAssay;Promega公司）并揽拌20分钟后，使用发光测定装置测定。将阳 性对照、阴性对照的值分别设为100%抑制值、0%抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。结 果，Dovitinib、AZD4547 及BGJ398 的抑制 ％ 分别为 40 %、74 %、92 %。
[0334] W上的结果说明，FGFR3-TACC3融合多肤的抑制剂能够抑制表达FGFR3-TACC3_vl 的癌细胞或肿瘤的增殖。
[0335] 该说明，可通过本发明的检测方法辨别适用对象来实行定制医疗，其中，该适用对 象预期利用本发明的多肤抑制剂进行治疗是有效的。
[0336][实施例10]FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的逆转录酶病毒溶液的制备
[0337]使用实施例2及3中制作的FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro及FGFR3-TACC3_v3/ pMXs-puro并依据实施例7的方法制备逆转录酶病毒溶液。
[033引[实施例11]FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的销定非依赖性增殖亢进作用的 研究
[0339]使用实施例 10 中的利用FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro及FGFR3-TACC3_v3/ pMXs-puro制备的病毒溶液，依据实施例8的方法获得稳定表达FGFR3-TACC3_v2及 FGFR3-TACC3_v3的NI册T3细胞。（分别命名为FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞及 FGFR3-TACC3_v3 表达 /NI册T3 细胞。）
[0340]为 了研究FGFR3-TACC3_v2 表达 /NI册T3 细胞及FGFR3-TACC3_v3 表达 /NI册T3 细 胞的销定非依赖性增殖亢进能力，通过与实施例8同样的方法进行研究。从化yl到化y4 为止，Mock/NI册T3细胞的细胞数的计数未增加，与此相对，从化yl到化y4为止，确认到 FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞的细胞数的计数增加约2. 8倍。另外，从化yl到化y4 为止，确认到FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞的细胞数的计数增加约2. 3倍。由上可知， FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞表现出销定非依 赖性细胞增殖。
[034。[实施例12]本发明的多肤抑制剂对于FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞及 FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的销定非依赖性细胞增殖抑制作用
[0342]通过与实施例9同样的方法进行FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞及 FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞增殖抑制作用的评价。结果，Dovitinib、AZD4547及 BGJ398对FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞的抑制％分别为21 %、60 %、90 %。另外， Dovitinib、AZD4547 及BGJ398 对FGFR3-TACC3_v3 表达 /NI册T3 细胞的抑制 ％分别为 32 %、 51%、87%。
[034引 W上结果说明，FGFR3-TACC3融合多肤抑制剂能够抑制表达FGFR3-TACC3_v2及 FGFR3-TACC3_v3的癌细胞或肿瘤的增殖。
[0344] 该说明，可通过本发明的检测方法辨别适用对象来实行定制医疗，其中，该适用对 象可预期利用FGFR3-TACC3融合多肤抑制剂进行治疗是有效的。
[0345][实施例13]FGFR3-TACC3融合多肤抑制剂对FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞、 FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞的抗肿瘤试验
[0346] 将息浮于磯酸缓冲生理盐水（Phosphatebufferedsaline、PB巧中的 FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞3XIO6个注射移植于4周岁的雄性cann.Cg-FoxnlNu/ 化Icrlj(Nu/Nu)裸鼠（日本化arlesRiver公司）的背部皮下。移植3天后，开始给予作 为FGFR3-TACC3融合多肤抑制剂的AZD4547及BGJ398。溶剂组及化合物组W各4只到5只 进行试验，将AZD4547及BGJ398息浮在0. 5%甲基纤维素（methylCELLULOSE、信越化学工 业株式会社）/99. 5%蒸觸水组成的溶剂中，分别经口给药30mg/kg。给药在11天内1天进 行1次，从第二天开始每3天测定体重及肿瘤直径。使用下式计算肿瘤体积。
[0347][肿瘤体积（mm3)]=[肿瘤的长径（mm) ]X[肿瘤的短径（mm) ] 2X0. 5
[034引将化合物给药开始日W及给药结束日的溶剂组的肿瘤体积分别设为100%抑制、 0%抑制，算出AZD4547 及BGJ398 的抑制率。结果，AZD4547 及BGJ398 将FGFR3-TACC3_vl 表达/NIH3T3细胞（肿瘤）的增殖分别抑制了 51%、90%。
[0349]同样地研究了对于FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞的抗肿瘤作用。结果，AZD4547及BGJ398将FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细 胞（肿瘤）的增殖分别抑制了61%及90%。另外，将FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞 (肿瘤）的增殖分别抑制了 73%及88%。
[0350][实施例14]通过FGFR3-TACC3融合多肤抑制剂给药对FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞肿瘤 的激酶抑制作用
[0巧。除了下述W外，与实施例13同样地观察AZD4547及BGJ398的激酶抑制作用。移植FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞3XIO6个，在移植3天后开始给予AZD4547及BGJ398。 溶剂组及化合物组各W5只进行试验，在最终给药4小时后解剖，摘出肿瘤。然后，使用溶 角军液（CellLysisBuffer；CellSignalingTechnology公司、PhosphataseInhibitor Cocktail;ThermoScientific公司、Complete;Roche公司）迅速地制备肿瘤的蛋白质提取 液，使用ELISA试剂盒（R&D公司）实施肿瘤内的总FGFR3及磯酸化FGFR3的测定。ELISA依 据随附的步骤书来实施，但是检测改为利用化学发光试剂炬M化学发光化ISA基质；Roche 公司）及发光测定装置（ARVOferki址Imer公司）进行的化学发光检测。
[0巧2] 将用总FGFR3值对磯酸化FGFR3值进行修正后的值（磯酸化FGFR3/总FGFR3)设 为磯酸化水平，将溶剂组的磯酸化水平设为0%抑制、W绝对值0作为100%抑制，从而算出 各化合物组的酪氨酸自我磯酸化抑制率。结果，与溶剂组相比，AZD4547及BGJ398组中肿 瘤内的FGFR3-TACC3融合多肤Vl的酪氨酸自我磯酸化分别减少了 58%、77%。
[0巧3] 对于FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞也 同样地进行了研究，结果，与溶剂组相比，AZD4547及BGJ398组中肿瘤内的FGFR3-TACC3_v2 的酪氨酸自我磯酸化分别减少了 54%、66%。另外，肿瘤内的FGFR3-TACC3_v3的酪氨酸自 我磯酸化分别减少了 78%、85%。
[0巧4] 由该些结果可确认，上述动物模型中的AZD4547及BGJ398的抗肿瘤作用是基于抑 制肿瘤内的FGFR3-TACC3融合多肤的激酶活性的作用。
[0巧引[实施例切从源自膀脫癌患者的细胞株RT-112中分离FGFR3-TACC3_vl防356] 对于由源自膀脫癌患者的细胞株RT-112(从Leibniz-InstitutDSMZ-Deutsche SammlungvonMikroorganismenundZeHkulturenGmbH购入）精制的RNA,使用逆转录 酶（SuperScriptlll、Iifetechnologies公司）及oligo(dT)引物（oligo(dT) 20 引物、 Iifetechnologies公司）并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合成cDNA。 防357] 接着，使用序列号11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列号12所示 的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，W上述得到的CDNA作为模板，使用DNA聚合酶 〇(OD-plus-Ver. 2 ;东洋纺织株式会社）进行PCR(将98°C15砂、60°C15砂、68°C3分钟30 砂进行25次循环）。然后，W10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号13所示的 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列号 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引 物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98C15砂、55C15砂、68C3分30砂进行25次 循环）。PCR反应后，进行电泳，结果得到约2. 9化P的PCR产物。将PCR产物克隆到克隆载 体（TOPOXLPCRCloningKit;lifetechnologies公司）中，通过双脱氧测序法（Bi曲ye Terminatorv3. 1 切cleSequencingKit;lifetechnologies公司）确定插入物的序列，结 果可知，与NCBI中所注册的FGFR3基因（NM_001163213. 1)的从CDS的5'末端到外显子18 的3'末端和TACC3基因（NM_006342. 1)的从CDS的外显子11的5'末端到CDS的3'末端 融合的转录产物（FGFR3-TACC3_vl)(序列号1)相同。
[0巧引[实施例16]FGFR3-TACC3融合多肤抑制剂对源自膀脫癌患者的细胞株RT-112的 销定非依赖性细胞增殖抑制作用
[0359] 将RT-112细胞W每一个孔为2XIO3个的方式用含有10 %牛胎儿血清的RPMI1640 培养基接种于96孔球形板（SumilonCellti曲tSpheloi贴6U;住友Bakelite公司）中。 另外，作为阳性对照用，准备了仅添加有培养基的孔。在5% (?存在下、在37C下培养一晚 后，分别添加Dovitinib、AZD4547及BGJ398使得最终浓度为lOOnM。作为阴性对照，W与化 合物添加时的浓度（0. 1% )相同的方式添加化合物的溶剂即DMS0。然后，在5% (?存在下、 在37°C下培养5天，添加细胞数测定试剂（CellTiter-Glo?LuminescentCellVi油ility Assay;Promega公司）并揽拌20分钟后，使用发光测定装置测定。将阳性对照、阴性对照 的值分别设为100%抑制值、0%抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。结果，Dovitinib、 AZD4547 及BGJ398 的抑制 ％ 分别为 80 %、90 %、90 %。
[0360][实施例17]FGFR3-TACC3融合多肤的检测
[036。 如下构建检测细胞中的FGFR3-TACC3融合多肤的方法。培养FGFR3-TACC3_vl 表达/NI册T3细胞W及作为阴性对照的NIH3T3细胞。用PBS清洗1次后，将细胞用溶 角军液（CellLysisBuffer；CellSignalingTechnology公司、PhosphataseInhibitor Cocktail;ThermoScientific公司、Complete;Roche公司）在冰上溶解 10 分钟。离也后 向得到的上清液中添加抗FGFR3抗体（SIGMA-ALDRICH公司），在4°C下反应一晚。然后，添 加蛋白G微珠（ProteinGSe地aroseAhstFlow;GEHealthcare公司）并进行 4 小时 免疫沈降。离也后用清洗液（组成与上述的溶解液相同）将沉降物清洗4次，添加SDS溶 液后煮沸5分钟从而使沉淀物息浮。离也后对该上清液进行了使用抗TACC3抗体巧and Dsystems公司）的免疫印迹。结果，在FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞的免疫沈降物 中检测到了FGFR3-TACC3融合多肤VI，但在NI册T3细胞中没有检测到。对FGFR3-TACC3_ v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞也同样地进行了研究，结果，在 FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞的免疫沈降物中， 分别检测到FGFR3-TACC3融合多肤v2及FGFR3-TACC3融合多肤v3。另外，还通过同样的方 法对RT-112细胞进行研究，结果检测到FGFR3-TACC3融合多肤Vl。
[0362] 由W上的结果可知，通过组合使用抗FGFR3抗体及抗TACC3抗体，可检测在表达 FGFR3-TACC3融合多肤的癌细胞或癌组织中的本发明的多肤的存在，并且可判定本发明的 多肤阳性的癌症患者。
[0363][实施例1引利用原位杂交（ISH)法检测FGFR3-TACC3_vl表达/NI册T3细胞、 FGFR3-TACC3_v2表达/NI册T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞的福尔马林固定 石蜡包埋（FFP巧切片中的FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA)
[0364]将FGFR3-TACC3_vl表达 /NI册T3 细胞、FGFR3-TACC3_v2 表达 /NI册T3 细胞或 FGFR3-TACC3_v3表达/NI册T3细胞W3XIO6个移植于4周岁雄性裸鼠（CAnN.Cg-Foxnlnu/ 化1化Ij(nu/nu)、日本化arles化ver)的皮下，15天后，确认细胞块的增殖，从而制作荷癌 小鼠。
[0365] 从所制作的荷癌小鼠中切出含有增殖的癌细胞的组织，用生理盐水清洗后，用 10%中性缓冲福尔马林（SIGMA-ALDRICH公司）在室温下固定48?144小时，使用自动包 埋装置（Tissue-TekVIP、SakuraFinetekJapan株式会社）依据常规方法脱水后，包埋于 石蜡（TissuePrep、株式会社化lma)中。将石蜡包埋后的组织样品切成Sum厚的FF阳切 片。
[0366] 将准备的FF阳切片在微量恒温仪化eatblock) (MG-2200 ;东京理化器械株式会 社）上在6(TC下加热15分钟后，用10%福尔马林（和光纯药工业株式会社）在室温下固定 30分钟。用PBS(Invitrogen公司）清洗3次，完全干燥，用二甲苯（和光纯药工业株式会 社）在室温下处理10分钟。接着，将FF阳切片用PBS清洗3次，用预处理液（Affymetrix 公司）在IOOC下煮沸10分钟。进而用精制水清洗2次，用PBS清洗1次，用蛋白酶溶液 (Affymetrix公司）在培养器化ybEZHybridizationSystem；AdvancedCellDiagnostics 公司）内在4(TC下处理20分钟。然后，用PBS清洗3次，用4%福尔马林（和光纯药工业 株式会社）在室温下固定5分钟，用PBS清洗3次。将相对于FGFR3基因佑enBank注册 编号；NM_000142. 3)的碱基序列中与全部突变共通的碱基编号2851?4281为特异性的 brance曲NA探针（QuantiGeneViewRNAProbeSetType4;Affymetrix公司）、W及相对 于TACC3基因（GenBank注册编号；NM_006342. 1)的碱基序列中碱基编号2200?2838为 特异性的brancedDNA探针（QuantiGeneViewRNAProbeSetTypel;Affymetrix公司） 用ProbeSetDiluentQT(Affymetrix公司）稀释 40 倍，制作ProbeSetSolution。将 本溶液添加至FFPE切片，在培养器内在4(TC下反应2小时，使其与多核巧酸（mRNA)杂 交。然后，将FFPE切片用WashBuffeHAffymetrix公司）清洗 3 次，用PreAmplifierMix QT(Affymetrix公司）在培养器内在40°C下反应25分钟。进而将FF阳切片用WashBuffer 清洗3次，用AmplifierMixQT(Affymetrix公司）在培养器内在40°C下反应15分钟。用 WashBuffer清洗3次，用含有25分之1容量的L油elProbeMix(Affymetrix公司）的 L油elProbeDiluentQT(Affymetrix公司）在细胞培养器内在40°C下反应30分钟。接 着，用WashBuffer清洗2次，用PBS清洗1次，用含有英光色素DAPI(Affymetrix公司）的 PBS在室温下反应15分钟。用PBS清洗2次后，用封入剂EcoMount(BiocareMedical公 司）封入，用共聚焦激光显微镜（LSM700;CarlZeiss公司）进行英光观察。FGFR3-TACC3_ Vl表达 /NI册T3 细胞、FGFR3-TACC3_v2 表达 /NI册T3 细胞及FGFR3-TACC3_v3 表达 /NI册T3 细胞的FFPE切片的任意一者中均检测到FGFR3的信号及TACC3的信号，而且，FGFR3的信 号和TACC3的信号几乎共位（共局在）。由此说明，在含有强制地表达了FGFR3-TACC3融合 基因的细胞的FFPE切片中，FGFR3的信号和TACC3的信号共位。
[0367][实施例19]利用I甜法检测RT-112细胞中的FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA) [036引按与实施例18同样的步骤制作源自人膀脫癌患者的细胞株RT-112细胞及源自人 胃癌患者的细胞株服C-39细胞的FF阳标本，利用I甜法进行FGFR3-TACC3融合多核巧酸 (mRNA)的检巧IJ。采用实施例18中利用微量恒温仪的处理之后的方法进行处理，并英光观察 封入后的标本。利用INCellAnalyzer2000(GEHealthcare公司）对获得的图像进行解 析，结果，在表达FGFR3-TACC3_vl的RT-112细胞（实施例15)的FF阳切片中检测到多个 共位的FGFR3的信号和TACC3的信号，与此相对，在通过实施例23记载的RT-PCR确认到未 表达FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA)的服C-39细胞的FF阳切片中，几乎未检测到共位 的FGFR3的信号和TACC3的信号。由此说明，在含有内源性地表达FGFR3-TACC3融合基因 的细胞的FF阳切片中，FGFR3的信号和TACC3的信号共位，而在未表达FGFR3-TACC3融合 基因的细胞中未共位，因此，通过测定该样的共位信号，可W判定有无FGFR3-TACC3融合基 因。
[036引[实施例20]利用I細法检测源自膀脫癌患者的FFPE切片中的FGFR3-TACC3融合 多核巧酸（mRNA)
[0370] 将源自购自美国7ステクシF公司的膀脫癌患者组织的FF阳切片通过实施例18 中的利用微量恒温仪的处理之后的方法进行处理，并且英光观察封入后的切片。利用IN CellAnalyzer2000(GEHealthcare公司）对获得的图像进行分析，结果，与通过实施例 23记载的RT-PCR法确认到未表达FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA)的源自膀脫癌患者组 织的FF阳切片相比，在通过实施例23记载的RT-PCR法确认了表达FGFR3-TACC3_v2的源 自膀脫癌患者组织的FFPE切片中，共位的FGFR3的信号和TACC3的信号数量明显较多。
[0371] 对于购自英国TissueSolutions公司的多个源自膀脫癌患者组织的FFPE切片， 也通过同样的方法研究FGFR3的信号和TACC3的信号的共位。结果，与通过实施例23记载 的RT-PCR法确认到未表达FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA)的源自膀脫癌患者组织的 FF阳切片相比，在通过前述实施例记载的RT-PCR法确认了表达FGFR3-TACC3融合多核巧 酸（mRNA)的源自膀脫癌患者组织的FFPE切片中，共位的FGFR3的信号和TACC3的信号数 明显较多。
[0372] 由此说明，在源自膀脫癌患者组织的FFPE切片中，通过观察共位的信号，也可判 定有无FGFR3-TACC3融合基因。
[037引[实施例川化合物对FGFR3-TACC3融合多肤的体外激酶活性的抑制作用
[0374] (1)FLAG标签融合表达质粒
[0375] (FGFR3-TACC3-V1 (N-FLAG) /pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3-V2 (N-FLAG)/ pcDNA3.l/Zeo(+)及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))的构建
[0376] 为了获得在5'末端融合有FLAG标签的FGFR3-TACC3融合多核巧酸，使用实施 例1、2及3中克隆的载体作为模板，实施在5'末端附加FLAG标签的PCR。使用序列号 21 所示的FGFR3_N_FLAG_BamHI及序列号 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的 引物W及DNA聚合酶化OD-plus-Ver. 2 ;东洋纺织株式会社）进行PCR(将98C15砂、 55C15砂、68C3分钟30砂进行12次循环）。将PCR产物克隆到克隆载体（TOPOXL PCRCloningKit;lifetechnologies公司）中。通过双脱氧测序法确定插入物的序列 (BigDyeTerminatorv3.!CycleSequencingKit;lifetechnologies公司）。结果石角认 了；PCR产物为在序列号1、序列号3及序列号5中所记载的序列中删除了编码第一甲硫 氨酸的3个碱基（ATG)并在5'末端附加有编码起始密码子和FLAG标签的核酸序列（序 列号22)而得到的核酸序列。将由此编码的多肤分别称为FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融 合多肤、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多肤及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多肤，并将 它们总称为FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合多肤。另外，为了构建将附加有该些FLAG序列的 FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)的ORF全 长表达为蛋白质的表达载体，将上述克隆载体用限制酶BamHI在37C下进行3小时的酶反 应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制，再用EcoRI在37C下进行3小时的酶反应，并 对经限制酶处理了的DNA片断进行精制。将含有该ORF的DNA片断克隆到存在于表达载体 (PCDNA3.l/Zeo(+) ;lifetechnologies公司）的多克隆位点中的BamHI及EcoRI位点中，从 而构建表达质粒（FGFR3-TACC3_vl(N-化AG) /pcDNA3. 1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2 (N-化AG) / pcDNA3. 1/Zeo(+)及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3. 1/Zeo(+))。
[0377] (2)FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合多肤的获得
[037引在实施转染前一天，将每张涂布有胶原的15cm盘中的0. 5XIO7个肥K293细胞用 含有10%牛胎儿血清的D-MEM培养基培养10张。转染当天，FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)/ PCDNA3. 1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3. 1/Zeo(+)及FGFR3-TACC3_ v3 (N-FLAG) /pcDNA3. 1/Zeo(+)分别在每张盘中为27yg、并使用转染试剂（FUGE肥（注 册商标）皿；Roche公司）81iiL，对肥K293细胞实施转染。转染24小时后，去除培养 基，用PBS清洗3次，加入1血的PBS，利用细胞刮伊（Corning公司）剥离细胞后，回 收于聚丙帰制管中。W120化pm离也5分钟后，去除上清液，加入150yL的细胞溶解 液巧01111化13肥1(口服.0)、1501111化(：1、1%^-40、11111邸14、蛋白酶抑制剂。0。1^311 complete(Roche-Diagnostics株式会社））并在冰上培养30分钟使细胞溶解。将离也 后得到的上清液中存在的FGFR3-TACC3_v1 (N-FLAG)融合多肤、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG) 融合多肤及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多肤分别使用M2抗体亲和凝胶（ANTI-FLAG M2A巧nityGel;SIGMA-ALDRICH公司）并依据制品信息中所记载的方法进行精制。清洗 及溶出分别使用清洗液巧01111化13肥1(口服.0)、1501111化(：1、1%^-40、11111邸14、蛋 白酶抑制剂cocktailcomplete(Roche-Dia即OStics株式会社））、溶出液（20mMTris 肥l(pH7.4)、10mMMgCl2、10mMMnCl2、0.5mg/mL化AGP巧tide),得到IOOyL的溶出液。 对于溶出液进行使用了抗FGFR3抗体（CellSi即alingTechnology公司）及抗FLAGM2 抗体（SIGMA-ALDRICH公司）的免疫印迹W及银染色，从而确认了可得到FGFR3-TACC3_ Vl(N-FLAG)融合多肤、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多肤及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融 合多肤。
[0379] (3)FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合多肤的体外激酶活性的检测
[0380] 使用激酶活性检测试剂盒（HTRFKinEASE-TK;Cisbio公司）对相对于上述精制的 FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多肤、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多肤及FGFR3-TACC3_ v3 (N-FLAG)融合多肤的肤基质的磯酸化活性进行研究。使用384孔的Low-volumeBlack plate(Corning公司），W上述溶出液的I倍稀释溶液、3倍稀释溶液或10倍稀释溶液各 1yL作为酶源，向试剂盒随附的SXKinasebuffer中分别W最终浓度为ImM及SmM的方 式添加DTT及Mg",作为反应溶液。进行添加使得作为基质的试剂盒随附的TKSubstrate 的最终浓度为2.0uM、并且未添加ATP或者ATP的最终浓度为IOOyM，最终容量为 5. 0yL，并分别在室温下反应1小时。反应后，依据试剂盒推荐的方法制备Sa-XL665及TK Antibody-Eu(K)溶液，分别添加2. 5yL在室温下反应1小时后，检测HTRF的计数（即肤基 质的磯酸化）。结果可知，相对于未添加ATP而言，添加ATP时，HTRF的计数在添加含有上述 FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多肤、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多肤或FGFR3-TACC3_ v3 (N-FLAG)融合多肤的各溶出液1倍稀释溶液1yL时，分别增加了约38倍、约40倍及约 38倍；在添加上述溶出液3倍稀释溶液1yL时，分别增加了约27倍、34倍、31倍；在添加 上述溶出液10倍稀释溶液1yL时，分别增加了 5倍、18倍、11倍。
[0381] 如上所述，通过使用激酶活性检测试剂盒，可W检测FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合 多肤的体外激酶活性。
[0382] (4)化合物对FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合多肤的体外激酶活性的抑制作用
[0383] 使用上述激酶活性检测试剂盒及同样的384孔板来研究化合物Dovitinib、 AZD4547、BGJ398 及LY2874455 对FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多肤、FGFR3-TACC3_ v2 (N-FLAG)融合多肤及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多肤的体外激酶活性的抑制作用。 将1.OyL的各化合物溶液WDMSO的最终浓度为0. 1 %、化合物的最终浓度中Dovitinib 为luMUOOnMUOnM、AZD4547 及BGJ398 分另Ij为 100nM、10nM、lnM、LY2874455 为lOnM、 lnM、0.InM的方式进行添加，或者作为对照，添加DMSO使其为0. 1 %，对于FGFR3-TACC3_ Vl(N-FLAG)融合多肤，添加上述溶出液2倍稀释溶液1yL;对于FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG) 融合多肤，添加上述溶出液3倍稀释溶液1yL;W及对于FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多 肤，添加上述溶出液3倍稀释溶液1yL。接着，W最终浓度为2. 0yM的方式添加作为基质 的试剂盒随附的TKSubstrate,在室温下反应15分钟。接着，W未添加ATP或者ATP的最 终浓度为100yM的方式添加，最终容量为5. 0yL，并分别在室温下反应一小时。此外，分 别添加2. 5yL的与上述（3)的方法同样制备的Sa-XL665及TKAntibody-Eu(K)溶液，在 室温下反应1时间后，检测HTRF的计数。将不存在化合物下（将DMSO设为与添加化合物 时的浓度相同即0. 1% )的未添加ATP及添加ATP时的磯酸化的计数分别设为100%抑制、 0%抑制，由下式算出由化合物引起的FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多肤、FGFR3-TACC3_ v2 (N-FLAG)融合多肤及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多肤的激酶活性的抑制％。
[0384][化合物的激酶活性抑制（％)] = (1-[添加化合物且添加ATP时的磯酸化的计 数-未添加化合物且未添加ATP时的磯酸化的计数]/ [未添加化合物但添加ATP时的磯酸 化的计数-未添加化合物且未添加ATP时的磯酸化的计数])X100
[0385] 结果，发现化合物Dovitinib、AZD4547、BGJ398及LY2874455抑制 了精制 FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多肤、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多肤及FGFR3-TACC3_ v3 (N-FLAG)融合多肤对于肤基质的磯酸化活性。各化合物的各个最终浓度下的对于肤基质 的抑制比例（％)示于表1。
[0386] [表 1]
[0387]
【权利要求】
1. 纤维母细胞生长因子受体3 (FGFR3)基因和转化酸性卷曲螺旋含蛋白3 (TACC3)基因 的融合基因或者FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法，其特征在于，包括检测从受试者得 到的试样中的、编码下述多肽的多核苷酸或该多肽的存在的步骤， 所不多肽含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982、 序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043或序列号28的氨 基酸编号461?1040所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤 形成能力。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽是含有序列号2的氨基酸编号461? 947、序列号4的氨基酸编号461?982、序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨 基酸编号461?1043或序列号28的氨基酸编号461?1040所示的氨基酸序列，并且具有 肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸 编号461?982、序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043 或序列号28的氨基酸编号461?1040所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10 个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽是含有与序列号2、序列号4、序列号6、 序列号26或序列号28所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序列，并且具有肿 瘤形成能力的多肽。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽是含有序列号2、序列号4、序列号6、序 列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列 号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入 1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中,所述多肽为由序列号2、序列号4、序列号6、序列 号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽。 6. FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的检测用试剂盒，其含有以能够特异性地扩增 编码下述多肽的多核苷酸的方式设计的正义引物及反义引物： 所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982、 序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043或序列号28的氨 基酸编号461?1040所示的氨基酸序列的同源性为90 %以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤 形成能力。
7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述多肽是含有序列号2的氨基酸编号461? 947、序列号4的氨基酸编号461?982、序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨 基酸编号461?1043或序列号28的氨基酸编号461?1040所示的氨基酸序列，并且具有 肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸 编号461?982、序列号6的氨基酸编号461?996、序列号26的氨基酸编号461?1043 或序列号28的氨基酸编号461?1040所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10 个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述多肽是含有与序列号2、序列号4、序列号 6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序列，并且具有 肿瘤形成能力的多肽。
9. 根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述多肽是含有序列号2、序列号4、序列号6、 序列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序 列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插 入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
10. 根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述多肽为由序列号2、序列号4、序列号6、 序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽。
11. 一种用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物组，选自由下述a)?e) 构成的组： a) 引物组，其含有由在严格条件下与由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸杂交 的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸分 子所构成的正义引物； b) 引物组，其含有由在严格条件下与由序列号3所示的碱基序列构成的多核苷酸杂交 的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸分 子所构成的正义引物； c) 引物组，其含有由在严格条件下与由序列号5所示的碱基序列构成的多核苷酸杂交 的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸分 子所构成的正义引物； d) 引物组，其含有由在严格条件下与由序列号25所示的碱基序列构成的多核苷酸杂 交的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸 分子所构成的正义引物； e) 引物组，其含有由在严格条件下与由序列号27所示的碱基序列构成的多核苷酸杂 交的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸 分子所构成的正义引物。
12. 正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号1的碱基编号1?2280 中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号1的碱基编号 2281?2856中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
13. 正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号3的碱基编号1?2280 中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号3的碱基编号 2281?2961中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
14. 正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号5的碱基编号1?2368 中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号5的碱基编号 2369?3003中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
15. 正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号25的碱基编号1?2242 中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号25的碱基编号 2243?3144中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
16. 正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号27的碱基编号1?2233 中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号27的碱基编号 2234?3135中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
17. 用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的探针组，选自由下述a)?c)构成 的组： a) 探针组，其包含由含有与序列号1的碱基编号1?2280中任意的连续的至少16个 碱基互补的寡核苷酸的邻接的探针对构成的多种探针组、以及由含有与序列号1的碱基编 号2281?2856中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的邻接的探针对构成的多 种探针组； b) 探针组，其包含由含有与序列号3的碱基编号1?2280中任意的连续的至少16个 碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组、以及由含有与序列号3的碱基编 号2281?2961中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成 的探针组； c) 探针组，其包含由含有与序列号5的碱基编号1?2368中任意的连续的至少16个 碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组、以及由含有与序列号5的碱基编 号2369?3003中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成 的探针组。
18. 根据权利要求1?5中任一项所述的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的检测 方法，其特征在于，所述检测多核苷酸的存在的步骤包括：使用从受试者得到的试样以及权 利要求17所述的探针组进行原位杂交的步骤；将杂交的信号放大的步骤；以及检测所述信 号重叠的步骤。 19. FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的检测用试剂盒，其含有用于检测FGFR3基因 和TACC3基因的融合基因的权利要求17所述的探针组以及将杂交后的信号放大的试剂。
20. 根据权利要求1?5中任一项所述的FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法，其特 征在于，所述检测多肽的存在的步骤包括：i)使识别源自该多肽的FGFR3基因的部分的抗 体（一次抗体）以及识别源自该多肽的TACC3基因的部分的抗体（一次抗体）与从受试者 得到的试样接触的步骤；ii)添加与该一次抗体分别结合、并且连结有寡核苷酸的各自的 二次抗体的步骤；iii)添加连接溶液从而进行连接反应的步骤，其中该连接溶液含有与该 二次抗体所连结的所述寡核苷酸部分互补的二种寡核苷酸、以及在它们接近时使其连接从 而在该二次抗体间能够形成环状结构的连接酶；iv)沿所形成的环状结构使核酸伸长的步 骤、v)将能够与伸长后的核酸杂交的经标记的寡核苷酸探针杂交的步骤；以及vi)检测该 标记信号的步骤。 21. FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测用试剂盒，其用于权利要求1?5中任一项所述 的FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法中，并且含有：识别源自所述融合多肽的FGFR3基 因的部分的抗体（一次抗体）以及识别源自所述融合多肽的TACC3基因的部分的抗体（一 次抗体），与该一次抗体分别结合并且连结有寡核苷酸的二次抗体，与该二次抗体所连结的 该寡核苷酸部分互补的二种寡核苷酸，在它们接近时使其连接从而在该二次抗体间能够形 成环状结构的连接酶，以及经标记的寡核苷酸探针。 22. FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或者FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌 的治疗用医药组合物，含有抑制下述多肽的物质： 所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982 或序列号6的氨基酸编号461?996所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序 列、并且具有肿瘤形成能力。
23. 根据权利要求22所述的医药组合物，其中，所述多肽是含有序列号2的氨基酸编 号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982或序列号6的氨基酸编号461?996所不 的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列号2的氨基酸编号461? 947、序列号4的氨基酸编号461?982或序列号6的氨基酸编号461?996所不的氨基酸 序列中缺失、取代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能 力的多肽。
24. 根据权利要求22所述的医药组合物，其中，所述多肽为由序列号2的氨基酸编号 461?947、序列号4的氨基酸编号461?982或序列号6的氨基酸编号461?996所不的 氨基酸序列构成的多肽。
25. 根据权利要求22所述的医药组合物，其中，所述多肽是含有与序列号2、序列号4 或序列号6所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力 的多肽。
26. 根据权利要求22所述的医药组合物，其中所述多肽是含有序列号2、序列号4或序 列号6所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列号2、序列号 4或序列号6所示的氨基酸序列中含有缺失、取代和/或插入1?10个氨基酸而得到的氨 基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
27. 根据权利要求22所述的医药组合物，其中，所述多肽为由序列号2、序列号4或序 列号6所示的氨基酸序列构成的多肽。
28. 根据权利要求22?27中任一项所述的癌治疗用医药组合物，其中，所述抑制多肽 的物质为Dovitinib、AZD4547、BGJ398 或LY2874455。
29. 根据权利要求22?27中任一项所述的癌治疗用医药组合物，其中，所述癌为肺癌 或膀胱癌。
30. 抑制下述多肽的物质用于制造FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3 和TACC3的融合蛋白阳性的癌治疗用医药组合物的应用： 所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982 或序列号6的氨基酸编号461?996所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力。
31. 抑制下述多肽的物质用于治疗FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3 和TACC3的融合蛋白阳性的癌的应用： 所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982 或序列号6的氨基酸编号461?996所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力。 3 2.抑制下述多肽的物质，其用于治疗FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌： 所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982 或序列号6的氨基酸编号461?996所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力。 33.FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌的 治疗方法，包括给对象施予有效量的抑制下述多肽的物质： 所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461?947、序列号4的氨基酸编号461?982 或序列号6的氨基酸编号461?996所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序 列，并且具有肿瘤形成能力。
【文档编号】A61K45/00GK104379740SQ201380012774
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年3月7日 优先权日:2012年3月8日
【发明者】铃木淳, 浅海真, 角山和久, 西村耕一, 森中绍文, 山内智弘, 吉野正康, 吉崎浩亮 申请人:安斯泰来制药株式会社