结合有含半胱氨酸残基的基序的修饰抗体，含该修饰抗体的修饰抗体-药物缀合物以及其 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗体，其中由包括一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸或肽序列组成的基序结合于亲本抗体的末端，特别是亲本抗体的重链末端。并且，本发明涉及一种包括结合于所述抗体的药物的修饰抗体-药物缀合物（mADC)，以及一种用于制造所述抗体或所述修饰抗体-药物缀合物的方法。由于其对抗原的高度特异性，根据本发明的修饰抗体-药物缀合物能够准确地递送药物至靶细胞，因而能够提高药物的治疗效果。并且，其能够提高药物，特别是抗癌药物的可用性，所述抗癌药物尽管具有高功效，但由于其毒性而使用受到限制。而且，本发明涉及用于治疗疾病，特别是癌症的组合物，所述组合物包括修饰抗体-药物缀合物。
【专利说明】结合有含半胱氨酸残基的基序的修饰抗体，含该修饰抗体 的修饰抗体-药物缀合物以及其制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种修饰抗体，该修饰抗体包括结合于亲本抗体，优选所述亲本抗体 的末端，更优选所述亲本抗体的重链或轻链的末端，最优选所述亲本抗体的重链或轻链的C 末端的含半胱氨酸（Cys)的基序（motif);-种包括结合于所述修饰抗体且用于诊断或治 疗的药物的修饰抗体-药物缀合物（mADC);以及一种用于制造所述修饰抗体或所述修饰抗 体-药物缀合物的方法。
[0002] 由于包括在缀合物中的亲本抗体的高度抗原特异性，根据本发明的修饰抗体-药 物缀合物能够准确地将药物递送至靶细胞，因而能够提高药物的治疗效果。而且，其能够提 高药物，特别是具有高抗癌功效的抗癌药物的效用，所述具有高抗癌功效的抗癌药物由于 毒性而使用受到限制。
[0003] 此外，本发明涉及一种治疗疾病（特别是癌症）的组合物，所述组合物包括所述修 饰抗体-药物缀合物，本发明还涉及一种利用所述修饰抗体-药物缀合物来治疗疾病的方 法。
[0004] 根据本发明的修饰抗体-药物缀合物可含有许多能够用于与药物缀合的半胱氨 酸残基，因为含有一个或多个半胱氨酸残基的基序结合于亲本抗体。因而，其能够包含大 量结合于其上的药物，且该大量的结合药物能够被有效地递送至靶细胞或靶组织。此外， 由于能够容易地控制结合于亲本抗体的半胱氨酸残基的数量，所以能够将包含在该修饰抗 体-药物缀合物（mADC)内的药物的量容易地控制在所希望的水平。
【背景技术】
[0005] 在生物制药当中，对利用抗体的治疗剂被进行了最为积极的研究，该治疗剂特异 性地结合于在特定疾病中特异性地表达的靶标（即抗原）。特别地，正在积极地进行对在癌 细胞表面上表达的肿瘤相关抗原的识别，并且利用结合于所述抗原以抑制细胞生长或诱导 细胞死亡的抗体（即抗癌抗体）来诊断和治疗肿瘤的方法正在被广泛使用，这些方法的领 域也具有非常好的前景。
[0006] 这种抗癌抗体具有非常高的靶特异性，但它们在癌细胞上的细胞毒性效应通常低 于现有的细胞毒性药物（即抗癌药物或抗癌剂）的细胞毒性效果。故在许多情况下，这些 抗癌抗体被用于与细胞毒性药物或其它细胞增殖抑制药物的组合治疗。
[0007] 关于上述组合治疗，对修饰抗体-药物缀合物（mADC)进行了积极的研究，其中结 合的细胞毒性药物的治疗效果提高同时毒性降低。人们认识到，当使用修饰抗体-药物缀 合物时，能够减少药物的全身毒性并且能够增加药物的细胞毒性，尤其是在其中具有过表 达的靶标的细胞中（特别是癌细胞中），从而提高药物的治疗效果。
[0008] 事实上，已经成功地开发出用于治疗非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma) 或急性骨髓性白血病的、包含缀合于抗体的细胞毒性药物或放射性同位素的修饰抗 体-药物缀合物，如 EVALIN?[Witzig 等人，J. Clin. 0ncol，2002,20(15) :3262-3269]或 MYLOTARG?[Drugs of the Future，2000,25(7):686]。此外，已经进行了许多尝试以将高毒 性的美坦新（mertansine)(如莫坎妥单抗美坦新（cantuzumab mertansine) (Immunogen， Inc. [Xie 等人，J. of Pharm. and Exp. Ther. 2004, 308 (3) :1073-1082])或曲妥单抗美坦新 (trastuzumab mertansine) (Roche[Isakoff 等人，J. Clin. Oncol. 2011,29(4) :351-4])) 与抗体缀合，或者将其它的细胞毒性药物，例如多拉司他汀（dolastatin)衍生物，如奥里 斯他汀肽（auristatin peptides)、奥里斯他汀E(auristatin E，AE)、单甲基奥里斯他汀 (MMAE)或MMAF与抗体缀合，所述抗体如cBR96(特异于癌上的Lewis Y)、对血液系统恶 性肿瘤上的⑶30特异的cACIO、或用于治疗表达⑶20癌症的抗⑶20抗体、或针对免疫失 调的Rituxan、用于治疗结肠癌的抗EphB2R抗体、2H9、抗IL-8或E选择素（E-selectin) 抗体（[Klussman 等人，Bioconjugate Chemistry，2004,15(4):765-773] ;[Doronina 等人，Nature Biotechnology，2003,21(7):778-784] ;[Francisco 等人，Blood，2003， 102(4):1458-1465])US2004/0018194Al)W004/032828A3;[Mao 等人，Cancer Research， 2004,64(3):781-788] ;[Bhaskar 等人，Cancer Res，2003,63:6387-6394])。
[0009] 另外，还已经对开发利用道诺霉素（daunomycin)、多柔比星（doxorubicin)、甲氨 蝶呤（methotrexate)或长春地辛（vindesine)的修饰抗体-药物缀合物进行了尝试。已知 诸如白喉毒素的细菌毒素、诸如蓖麻毒素的植物毒素或诸如格尔德霉素（[Mandler等人， J. of the Nat. Cancer Inst，2000,92 (19) :1573-1581] ;[Mandler 等人，Bioorganic&Med. Chem.Letters，2000，10:1025_1028] ;[Mandler 等人，Bioconjugate Chem，2002， 13:786-791])，类美坦素（maytansinoid)([EP1391213Al] ; [Liu 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1996,93:8618-8623])或卡奇霉素（calicheamicin) ([Lode 等人，Cancer Res， 1998,58:2928] ;[Hinman 等人，Cancer Res，1993,53:3336-3342])的小分子可以用作抗 体-药物缀合物中的药物。这些细胞毒性药物通过诸如微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异 构酶抑制之类的机制来表现细胞毒性和细胞增殖抑制效果。
[0010] 当采用用于诱导药物与抗体之间共价键连接的常规工艺来制备如上所述的抗 体-药物缀合物时，药物将结合于抗体中的许多位点，产生非均匀性的混合物。例如细胞毒 性药物很可能通过包含在抗体中的许多赖氨酸残基而结合于抗体，从而产生非均匀性的抗 体-药物缀合物混合物。而且，该非均匀性的混合物根据反应条件可能具有范围从0到大 约8的不同药物结合分布，这意味着每单位抗体所结合的药物分子的数量有所变化。
[0011] 而且，对于具有限定数量的药物结合的抗体药物缀合物而言，根据不同的缀合位 点，还可能有另一种潜在的非均匀性。对这种非均匀性的混合物进行均匀性纯化并不适合 用于药物的大规模生产（[Hamblett 等人，Clin. Cancer Res，2003,10, 7063-7070]，[Wang 等人，Protein Sci. 2005,14, 2436-2446])。
[0012] 将药物缀合于抗体的另一种方法是通过还原剂来还原抗体中半胱氨酸残基之间 的二硫键，然后将药物缀合于被还原的半胱氨酸残基的游离巯基基团。这种方法同样具有 缺点，即抗体固有的特性可能失去且产生大量的非均匀性的混合物。具体而言，免疫球蛋白 M是一个二硫键连接的五聚体的实例，而免疫球蛋白G是一个以内部二硫桥将亚基键接在 一起的蛋白质的实例。在这种蛋白质中，用诸如二硫苏糖醇（DTT)或硒醇之类的试剂还原 二硫键会生成反应性游离巯基（[Singh等人，Anal. Biochem. 2002, 304:147-156])。这种途 径可导致抗体三级结构和抗原结合特异性的丧失（[Jagath等人，Nature Biotechnology, 2008,26(8):925-32])〇
[0013] 如上所述的常规的抗体-药物缀合方法的代表性缺点在于难以精确地控制抗体 中的药物缀合位点和缀合药物的数量。在一种为克服这一问题并引入游离巯基基团的尝试 中，特定的氨基酸被半胱氨酸所取代，而取代的半胱氨酸不会损害抗体功能。为此，在预测 抗体中每个可能的突变位点中的巯基基团的反应性之后，开发了针对最佳半胱氨酸突变体 的筛选方法（韩国专利公开第2007-0054682号，"ThioFab technology"）。通过该方法生 产的曲妥单抗美坦新的抗体_药物缀合物在临床试验中用于治疗转移性乳腺癌（[Burris III 等人，J. Clin. 0ncol，2011，29(4) :398-405])。上述 ThioFab 技术具有这样的优点，即 对亲本抗体中二硫键的破坏能够通过将新的半胱氨酸引入抗体而最小化，但是关于结构修 饰和亲本抗体功能的担心仍然存在，因为亲本抗体中的一些氨基酸被半胱氨酸突变。
[0014] 因此，迫切需要开发一种新的抗体-药物缀合物及其制造方法，其中能够准确地 控制缀合于亲本抗体的药物分子的数量和位置，同时保持亲本抗体的结构和功能特征。
【发明内容】
[0015] 为解决上述存在于现有技术中的问题而做出本发明，本发明的一个目标在于提供 一种新抗体（下文中称为"修饰抗体"），该抗体包括含有一个或多个结合于亲本抗体的半 胱氨酸残基以提供多个药物结合位点的基序。本发明的另一目标在于提供一种包含结合于 所述修饰抗体的药物的修饰抗体-药物缀合物。
[0016] 根据本发明的修饰抗体能够高效地缀合与各种药物，同时保留亲本抗体的特征， 因而其具有高度的靶特异性并且提高了所述缀合药物的治疗效果。
[0017] 本发明的修饰抗体具有如下优点：其包括含有一个或多个半胱氨酸残基的基序， 因而药物能够缀合于这些半胱氨酸残基并且缀合的药物能够被有效地递送至靶组织。另 夕卜，能够准确地控制能结合药物的半胱氨酸残基的数量，因而能够控制在修饰抗体-药物 缀合物中药物分子的数量或用量。因此，本发明的修饰抗体-药物缀合物能够用作优异的 药物递送系统，该药物递送系统克服了常规抗体-药物缀合物的问题并能够高效地用于治 疗诸如癌症之类的疾病。
[0018] 另外，由于根据本发明的修饰抗体-药物缀合物对抗原的高度特异性，从而能够 准确地将药物递送至靶细胞，故其能够提高药物的治疗效果，并且还改善了药物，特别是抗 癌药物的效用，所述抗癌药物尽管具有高抗癌功效，但由于毒性而使用受到限制。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是包括含半胱氨酸的曲妥单抗的修饰抗体表达载体的载体图谱。
[0020] 图2示出在曲妥单抗（右边两道）和含半胱氨酸的曲妥单抗变体（HR-Cys，左边两 道）纯化后的HR-Cys的Western印记图像。
[0021] 图3示出进行UV-VIS光谱（A)和SDS-PAGE⑶的结果以证实多柔比星是否缀合 于 HR-Cys。
[0022] 图 4 不出针对 Her_M2 (Cys) _Alexa488,即 Her_M2 (Cys)抗体变体与 Alexa Fluor? 488的缀合物，（A) SDS-PAGE凝胶电泳和（B)结合于重链和轻链每个的Alexa488染料的相 对荧光强度分析的结果。
[0023] 图5示出进行抗增殖MTS测试以检查HR-Cys-DOX与赫赛汀（Here印tin)、赫赛汀 与多柔比星1:2的混合物以及多柔比星相比较在表达HER2的BT-474细胞中的细胞生长抑 制效果的结果。
[0024] 图6示出进行抗增殖测试以检查HER-M(Cys) -MMAE，即赫赛汀-MMAE抗体-药物缀 合物，与赫赛汀（Here印tin)相比较在表达HER2的SK-BR3细胞中的细胞生长抑制效果的 结果。
[0025] 图7示出为检查HR-Cys2-MMAE与赫赛汀相比较在表达HER2的SK-BR-3细胞中的 细胞死亡（细胞凋亡）效果，在各种处理浓度下观察半胱天冬酶（caspase)活性的结果。
[0026] 图8示出为检查缀合于赫赛汀抗体变体的MMAE与赫赛汀相比较在表达HER2的 SK-BR3细胞中的细胞凋亡效果，在各种处理浓度下观察半胱天冬酶活性的结果。
【具体实施方式】
[0027] 下文将描述本发明的进一步细节。
[0028] 本发明提供了一种新的修饰抗体，其包括含有一个或多个结合于亲本抗体的半胱 氨酸残基以提供多个抗体药物位点的基序，以及一种包括所述修饰抗体的修饰抗体-药物 缀合物。这种修饰抗体能够缀合于各种药物，同时保留亲本抗体的特征，因而能够高效地用 作修饰抗体-药物缀合物。
[0029] 如本文所使用，术语"亲本抗体"是指不具有含半胱氨酸的基序的常规"抗体"。任 何对特定抗原具有结合亲和性和特异性的亲本抗体都可无局限性地用于本发明。可用于本 发明的亲本抗体包括单克隆或多克隆抗体，例如来自诸如小鼠之类的动物的抗体、嵌合抗 体、人源化抗体和利用转基因小鼠或噬菌体展示技术开发的人抗体。另外，对于本领域技术 人员而言显然的是，诸如双特异性抗体或抗体片段之类的修饰抗体也可用于本发明。
[0030] 如本文所使用，术语"抗体片段"是指至少保留了对抗原的结合亲和性的抗体。抗 体片段的实例包括单链抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体、Fab片段、F(ab'）2片段、Fd、 scFv、结构域抗体、微抗体（miniantibodies)、单链抗体（scAb)、抗体恒定区的衍生物以及 基于蛋白支架（protein scaffold)的人工抗体。
[0031] 另外，可用于本发明的亲本抗体的实例包括所有类型的免疫球蛋白分子（例如 IgG、IgE、IgM、IgD 和 IgA)及其亚型（IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)。另外，亲本 抗体可以是来自任何物种的抗体。
[0032] 本发明中的亲本抗体具有对以下物质的结合亲和性和特异性：诸如肿瘤相关抗原 (TAAs)的癌症特异性抗原、细胞表面受体蛋白、除受体之外的细胞表面蛋白和分子、跨膜蛋 白、信号蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关（例如已知 或怀疑功能上有助）的分子、淋巴因子、细胞因子、参与细胞周期调节的分子、参与血管发 生（vasculogenesis)的分子和与血管新生（angiogenesis)有关（例如已知或怀疑功能上 有助）的分子。
[0033] 具体而言，本发明中的亲本抗体能够结合的抗体包括但不限于：
[0034] (1)BMPRIB(骨形态发生蛋白受体 IB 型；Genbank 登录号 No. NM_001203);
[0035] (2) E16 (LAT1，SLC7A5 ;Genbank 登录号 No. NM_003486);
[0036] (3) STEAP1 (前列腺六次跨膜上皮抗原；Genbank登录号No. NM_012449);
[0037] (4) 0772P (CA125, MUC16, Genbank 登录号 No. AF361486);
[0038] (5)MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核细胞促进因子，间皮素；Genbank登录号 No. NM_005823)；
[0039] (6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2,溶质携带物家族 34(磷酸钠），成员 2, II 型钠依赖的磷酸盐转运蛋白3b ;Genbank登录号No. NM_006424);
[0040] (7)Sema5b(FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B，SEMAG，壁板蛋白 (Semaphorin) 5b Hlog，sema结构域，七个血小板反应蛋白（thrombospondin)重复（类 型1和类型1样），跨膜结构域（TM)和短胞质结构域，（壁板蛋白）5B ;Genbank登录号 No. AB040878)；
[0041] (8)PSCA hlg(2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA2700050C12, RIKEN cDNA2700050C12 ;Genbank 登录号 No. AY358628);
[0042] (9) ETBR (内皮素 B 型受体；Genbank 登录号 No. AY275463);
[0043] (10)MSG783 (RNF124,假定蛋白质 FLJ20315, Genbank 登录号 No. NM_017763);
[0044] (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2, STMP，前列腺癌相关基 因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺六次跨膜上皮抗原2，六次跨膜前列腺蛋白，Genbank登录 号 NO.AF455138);
[0045] (12)TrpM4(BR22450, FLJ20041，TRPM4, TRPM4B，瞬时受体电位阳离子通道，M 亚家 族，成员 4 ;Genbank 登录号 No. NM_017636);
[0046] (13) CRIPT0 (CR，CR1，CRGF，CRIPT0, TDGF1，畸胎瘤衍生生长因子；Genbank 登录号 No. NP_003203or NM_003212)；
[0047] (14)CD21(CR2(补体受体 2)或 C3DR(C3d/Epstein Barr 病毒受体）或 Hs. 73792 ; Genbank 登录号 No. M26004);
[0048] (15) CD79b (CD79B，CD79 P，IGb (免疫球蛋白相关 P )，B29, Genbank 登录号 No. NM_000626)；
[0049] (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (含 SH2 结构域磷酸酶锚蛋白 la)，SPAP1B， SPAP1C ;Genbank 登录号 No. NM_030764);
[0050] (17) HER2 (Genbank 登录号 No. Ml 1730);
[0051] (18) NCA (Genbank 登录号 No. M18728));
[0052] (19) MDP (Genbank 登录号 No. BC017023);
[0053] (20) IL20R a (Genbank 登录号 No. AF184971);
[0054] (21) Brevican (Genbank 登录号 No. AF229〇53);
[0055] (22) EphB2R (Genbank 登录号 No. NM_004442);
[0056] (23) ASLG659 (Genbank 登录号 No. AX092328);
[0057] (24) PSCA (Genbank 登录号 No. AJ297436);
[0058] (25) GEDA (Genbank 登录号 No. AY260763);
[0059] (26)BAFF-R(B 细胞活化因子受体，BLyS 受体，BR3, NP_443177. 1);
[0060] (27) CD22 (B 细胞受体 CD22-B 同种型；NP-001762. 1);
[0061] (28)⑶79a(⑶79A，⑶79a，免疫球蛋白相关a，与IgP (⑶79B)共价相互作用 并在表面上与IgM分子形成复合物的B细胞特异性蛋白，转导参与B细胞分化的信号； Genbank 登录号 No. NP_001774. 1);
[0062] (29)CXCR5(Burkitt's淋巴瘤受体1，由CXCL13趋化因子活化的G蛋白偶联受体， 在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥功能，在HIV-2感染中起作用并参与AIDS、淋巴瘤、骨髓 瘤和白血病的发展；Genbank登录No. NP_001707. 1);
[0063] (30)HLA-D0B (与肽结合并将肽递呈到⑶4+T淋巴细胞的MHC II类分子的0亚单 元（la 抗原）；Genbank 登录号 No. NP_002111. 1);
[0064] (31)P2X5 (噪呤能受体（Purinergic receptor)P2X配体门控离子通道5,由细胞 外ATP门控的离子通道，可参与突触传递和神经发生，缺乏可导致特发性逼尿肌不稳定的 病理生理学；Genbank登录号No. NP_002552. 2);
[0065] (32) CD72 (B 细胞分化抗原 CD72, Lyb-2 ;Genbank 登录号 No. NP_001773. 1);
[0066] (33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复（LRR)家族的I型膜蛋白， 调节B细胞活性和细胞凋亡，功能丧失与在系统性红斑狼疮患者中增加的疾病活性相关； Genbank 登录号 No. NP_005573. 1);
[0067] (34)FcRHl (Fc受体样蛋白1，含类C2型Ig免疫球蛋白Fc结构域和ITAM结构域 的假定受体，可在B淋巴细胞分化中起作用；Genbank登录号No. NP_443170. 1);
[0068] (35) IRTA2(免疫球蛋白超级家族受体转运相关蛋白2,在B细胞发育和淋巴瘤发 生中可能起作用的假定免疫受体；通过转运对基因的失调控在一些B细胞恶性肿瘤中发 生；Genbank 登录号 No. NP_112571. 1);和
[0069] (36)TENB2(假定跨膜蛋白聚糖，与生长因子和卵泡抑素的EGF/heregulin家族有 关；Genbank登录号No. AF179274)。另外，抗原的实例包括可用于治疗和诊断的所有抗原。
[0070] 在优选的实施方式中，本发明中的亲本抗体对ErbB受体具有结合亲和性和特异 性，所述ErbB受体选自EGFR、HER2、HER3和HER4以及其它癌症抗原。
[0071] 特别地，用于本发明的亲本抗体包括选自以下抗体组的一种或多种：曲妥单 抗（商品名：赫赛汀）、利妥昔单抗（rituximab，商品名：美罗华（Rituxan))、贝伐单 抗（bevacizumab,商品名：安维（Avastin))、西妥昔单抗（cetuximab,商品名：尔必得舒 (Erbitux))、cBR96、cACIO、抗 CD20 抗体、抗 EphB2 抗体、抗 IL-8、E-选择素抗体、抗 MUC16 抗体和抗CD30抗体，但本发明的亲本抗体并不限于此。
[0072] HER2是指一种表皮生长因子受体（EGFR)家族的成员，是涉及乳腺癌细胞的增殖 和存活的一种重要的信号级联放大。已知EGFR家族的受体酪氨酸激酶是由erbl、erb2/ HER2、erb3和erb4组成，并且除了细胞增殖和增殖之外还涉及细胞的粘附（adhesion)、迁 移和分化。
[0073] 没有与erb家族四个成员中的erb2/HER2相结合的配体，但erb2/HER2已知是 乳腺癌中最可能的癌基因（oncogene)。如果HER2的水平正常，则其涉及正常乳腺组织的 生长和发育，但如果J1ER2非正常地过表达或扩增，则将打破正常细胞调控，从而在乳腺组 织中将形成侵略性的癌细胞。换而言之，如果J1ER2被EGFR家族其他成员的寡聚化而活 化，则它将使许多下游分子磷酸化，这将导致许多信号级联放大的活化。涉及细胞增殖的 SOS-Ras-Raf-MEK-MAPK通路和抑制细胞死亡的PI-3K/Akt通路是与癌细胞增殖相关的代 表性机制。
[0074] 临床前试验和临床试验的结果表明，HER2的过表达是从癌症发展初始状态出现的 重要生物标记物，并且在癌症生长和进程中起着重要作用。已知HER2的过表达出现在约 20-30%的侵润性乳腺癌中，并且还与具较高侵略性和恶性的乳腺癌的不良预后相关。
[0075] 根据本发明，含一个或多个半胱氨酸残基的基序与对生长因子受体具特异性的亲 本抗体结合，所述生长因子受体选自J1ER2受体或EGF受体。并且将常规的抗癌药物与基序 缀合，以获得本发明的修饰抗体_药物缀合物。当将修饰抗体-药物缀合物以有效抑制患 者中肿瘤细胞生长的量施用于患者时，其能够通过抑制过表达所述生长因子受体的肿瘤细 胞的生长同时诱导细胞死亡而表现出优异的治疗癌症效果。
[0076] 另外，本发明中的亲本抗体优选为曲妥单抗。尽管曲妥单抗被制备成基本上没有 C末端赖氨酸（Lys)，但本发明的修饰抗体-药物缀合物能够应用于含赖氨酸（Lys)的曲妥 单抗或在其C末端区域不含赖氨酸（Lys)的曲妥单抗，其中含半胱氨酸（Cys)的基序可以 与其结合。
[0077] 本发明的氨基酸以其已知的三字母或一字母缩写表示。存在于各种核酸片段中的 核苷酸以本领域通常使用的标准单字母名称来指代。
[0078] 本发明中的含半胱氨酸的基序具有1-100个氨基酸残基，优选为1-50个氨基酸残 基，更优选为1-30个氨基酸残基，最优选为1-10个氨基酸残基，并且含有一个或多个半胱 氨酸残基。特别地，本发明中的含半胱氨酸的基序含有1-20个半胱氨酸残基，更优选1-10 个半胱氨酸残基，甚至更优选1-5个半胱氨酸残基。
[0079] 本发明中的含半胱氨酸的基序可以是不具有特定功能的简单肽基序或者二级或 三级结构，优选为具有特定功能的基序或者二级或三级结构。所述特定功能优选是能够保 持/保护半胱氨酸残基的化学缀合能力的性质，但并不限于此。特别地，含半胱氨酸的基序 由于与特定配体或者肽基序本身的二级或三级结构结合，通过防止或减速半胱氨酸残基的 氧化而能够更加有效地保持半胱氨酸残基的功能。
[0080] 本发明中的含半胱氨酸的基序具有下式1所表示的结构：
[0081] Xa- [ (MCys) n~Xbn] n 式（1)
[0082] 其中（Meys)n表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽 基序或二级或三级结构，Xa和Xbn各独立地表示包括0到20个除半胱氨酸以外的氨基酸残 基的肽，n是1到20范围的整数。
[0083] 式⑴中，（MCys)n，即（MCys)i、（MCys)f (MCys)n，可以彼此相同或不同。同样，Xbn4P Xbp Xb2*"Xbn，可以彼此相同或不同。
[0084] 另外，如果式（1)中的（％丄是简单半胱氨酸残基，则根据本发明的含半胱氨酸的 基序具有下式（2)所表不的结构：
[0085] 式（2)
[0086] Xa- (Cys-Xbn)n
[0087] 其中Xa、XbdPn的定义与式1中相同。
[0088] 同样，如果式（1)中的（MCys)n是含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基序或 二级或三级结构，则（Meys)n可优选为含有半胱氨酸残基的金属离子结合基序。已知含 有半胱氨酸残基的金属离子结合基序能够结合金属离子，以抑制半胱氨酸残基的氧化， 从而有效地保留半胱氨酸残基的烧基化反应性（Van Horn等人（2003) J. Biol. Inorg. Chem. 8:601-610)。
[0089] 可用于本发明的含有半胱氨酸残基的金属离子结合基序包括但不限 于，用于控制体内金属离子浓度的金属离子螯合剂（Zhang等人（2012) Biochem. Genet. 50(7-8) :585-599),作用为将金属离子传递到细胞外或内的特定位置的分子伴侣 (Ansbacher 和 Shurki，J.Phys.Chem.B(2012) 116(15) :4425-4432 ;Allen 等人（2012) Biochemistry51 (7): 1439-48 ;Click 等人（2012)H.Comput.Chem. 33(11) :1142-51), 根据金属离子浓度调节转录的转录调节因子（Gunther等人（2012)Biochim.Biophys. Acta. 1823 (2) : 476-483 ;Sitthisak 等人（2012) FEMS Microbiol. Lett. 327 (2) : 126-133)， 广泛地存在于许多蛋白质中并参与蛋白质与蛋白质相互作用或蛋白质与DNA相互作用的 锋指基序（MacPherson 等人（2006) Microbiol. Mol. Bio. Rev. 70 (3) : 583-604 ;Schaeffer 等人（2012)Nucleic Acids Res. 40(18) :9298-9307),和来自各种酶的基序（Zielazinski 等人（2012) Biochemistry51 (40) :7891-7900 ;Zhou 等人（2012) FEBS J. 279 (2): 285-298; Cochran 等人（2011)Nat. Struct. Mol. Biol. 19(1): 122-127)。金属离子结合基序包含半 胱氨酸残基作为其必要的结合基团，这种金属离子结合基序可用于生产本发明的修饰抗 体-药物缀合物。
[0090] 本发明中的金属离子结合基序优选实例包括但不限于，锌指蛋白的C2H2组 (Cys2His2 类：Cys-X2_4-Cys-X12-His-X3_ 5-His)，C4 组（C4 类：Cys-XfCys-Xn-Cys-XfCys-X^ -CyS-X2-CyS-Xn-CyS-X 2-CyS)或 C6 组（C6 类：CyS-X2-CyS-X6-CyS-X 5_12-CyS-X2-Cys-X6_ 8-C ys，诸如Cys-X-X-Cys或Cys-X-Cys的Cys-Xm_Cys基序，频繁地发现于转录调节蛋白中的 C-Q-C-Q-C-A-C基序或Met-X-Cys-X-X-Cys基序，金属螯合蛋白，金属离子转运蛋白，超氧 化物歧化酶或类似物，膜蛋白ATP酶的Ser-Pro-Cys基序等等。在上述金属结合肽基序中， X表示除Cys之外的氨基酸残基；m是1到10范围的整数，优选1到5范围的整数；Xm或Xm_ q表示除Cys之外的氨基酸残基，其数量由m或m到q所标明。
[0091] 更具体而言，能够用于本发明的锌指蛋白的金属离子结合基序的实例包括但不限 于：
[0092] YKCKQCGKAFGCPSNLRRHGRTH(SEQ ID N0:1),
[0093] YQCNICGGKCFSCNSNLHRHQRTH(SEQ ID NO :2),
[0094] YSCGICGKSFSDSSAKRRHCILH(SEQ ID NO:3),
[0095] YTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTH(SEQ ID NO :4),
[0096] YRCKYCDRSFSDSSNLQRHVRNIH(SEQ ID N0:5)，
[0097] YKCKECGKAFNHSSNFNKHHRIH(SEQ ID NO :6),
[0098] FKCPVCGKAFRHSSSLVRHQRTH(SEQ ID NO :7),
[0099] YRCKYCCDRSFSISSNLQRHVRNIH(SEQ ID N0:8)，
[0100] YECDHCGKAFSIGSNLNVHRRIH(SEQ ID N0:9)，
[0101] YGCHLCCKAFSKSSNLRRHEMIH(SEQ ID NO:10),
[0102] YKCKECGQAFRQRAHLIRHHKLH(SEQ ID NO:11),
[0103] YKCHQCGKAFIQSFNLRRHERTH(SEQ ID NO:12),
[0104] FQCNQCGASFTQKGNLNRHIKLH(SEQ ID NO:13),
[0105] YTCSYCGKSFTQSNTLKQHTRIH(SEQ ID NO:14),
[0106] YACHLCGKAFTQSSHRRHEKTH(SEQ ID NO:15),
[0107] YKCGQCGKFYSQVSHLTRHQKIH(SEQ ID NO:16),
[0108] YACHLCGKAFTQCSHLRRHEKTH(SEQ ID NO:17),
[0109] YACHLCAKAFIQCSHLRRHEKTH(SEQ ID NO:18),
[0110] YVCRECGRGFRQHSHLVRHKRTH(SEQ ID NO:19)，
[0111] YKCEECEGKAFRQSSHLTTHKIIH(SEQ ID NO:20)，
[0112] YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTH(SEQ ID N0:21)，
[0113] YMCSECGRGFSQKSNLTIHQRTH(SEQ ID NO:22)，
[0114] YKCEECGKAFTQSSNLTKHKKIH(SEQ ID NO:23)，
[0115] FECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:24)，
[0116] YVCRECRRGFSQKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:25)，
[0117] YECEKCGKAFNQSSNLTRHKKSH(SEQ ID NO :26),
[0118] YECVQCGKSYSQSSNLFRHQRRH(SEQ ID NO:27)，
[0119] YECVQCGKGFTQSSNLITHQRVH(SEQ ID NO:28)，
[0120] YECNTCRKTFSQKSNLIVHQRTH(SEQ ID NO :29),
[0121] YVCSKCGKAFTQSSNLTVHQKIH(SEQ ID NO:30)，
[0122] YKCDECGKNFTQSSNLIVHKRIH(SEQ ID N0:31)，
[0123] YECDVCGKTFTQKSNLGVHQRTH(SEQ ID N0:32)，
[0124] YKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTH(SEQ ID NO:33),
[0125] YECQDCGRAFNQNSSLGRHKRTH(SEQ ID NO :34),
[0126] YECNECGKFFSQSSSLIRHRRSH(SEQ ID NO:35),
[0127] YKCEECGKAFNQSSTLTRHKIVH(SEQ ID NO :36),
[0128] YECNECGKAFAQNSTLRVHQRIH(SEQ ID NO :37),
[0129] YEVHDCGKSFRQSTHTLTQHRRIH(SEQ ID NO :38),
[0130] YECHDCGKSFRQSTHLTRHRRIH(SEQ ID NO :39),
[0131] HKCLECGKCFSQNTHLTRHQRTH(SEQ ID NO :40),
[0132] YVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRH(SEQ ID N0:41)，
[0133] YHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(SEQ ID N0:42)，
[0134] YRCSWEGCEWRFARSDELTRHFRKH(SEQ ID NO :43),
[0135] FSCSWKGCERRFARSDELSRHRRTH(SEQ ID NO :44),
[0136] FACSWQDCNKKFARSDELARHYRTH(SEQ ID NO :45),
[0137] YHCNWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(SEQ ID NO :46),
[0138] FLCQYCAQRFGRKDHLTRHMKHSH(SEQ ID NO :47),
[0139] CRCNECGKSFSRRDHLVRHQRTH(SEQ ID NO :48),
[0140] FQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTH(SEQ ID NO :49),
[0141] FACEVCGVRFTRNDKLKIHMRKH(SEQ ID NO:50)，
[0142] YVCDVEGCTWKFARSDKLNRHKKRH(SEQ ID N0:51)，
[0143] YKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIH(SEQ ID NO :52),
[0144] YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:53),
[0145] YECKECGKAFSSGSNFTRHQRIH(SEQ ID NO :54),
[0146] FHCGYCEKSFSVKDYLTKHIRTH(SEQ ID NO :55),
[0147] YECDHCGKAFSVSSNLNVHRRIH(SEQ ID N0:56)，
[0148] YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH(SEQ ID NO :57),
[0149] YECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIH(SEQ ID NO:58),
[0150] YRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIH(SEQ ID NO :59),
[0151] FACDICGRKFARSDERKRHTKIH(SEQ ID N0:60)，
[0152] CPVESCDRRFSRSDELTRHIRIH(SEQ ID N0:61)，
[0153] CDICGRKFARSDERKRHTKIH(SEQ ID N0:62)，
[0154] 等。锋指蛋白的金属离子结合基序可以是选自描沭于http://www. zincfingers. org, http://www. genenames. org/genefamilies/ZF, http://www. scripps.edu/mb/ barbas/zfdesign/zfdesignhome. php, https://zifdb. msi. umn. edu:8444/ZiFDB/, 或 Macpherson 等人（2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70 (3)，583-604 中的锋指蛋白的金属离 子结合基序的任何一种，上述文献符合本发明的技术特征。
[0155] 能够用于本发明的转录调节蛋白、金属螯合蛋白或类似物的金属离子结合基序的 实例包括但不限于以下序列：
[0156] CadC 蛋白：
[0157] CEIFCYDEEKVNRIQGDLQTVDISGVSQILKAIADENRAKITYALCQDEELCVC(SEQ ID NO:63),
[0158] AztR蛋白：DTHLVHLDNVRSSQAQILPTDKAQQMAEIFGVLADTNRIRLLSALASSELCVC(SEQ ID NO :64),
[0159] ZiaR 蛋白：
[0160] CDQPLVHLEQVRQVQPEVMSLDQAQQMAEFFSALADPSRLRLMSALARQELCVC(SEQ ID N0:65)，
[0161] BxmR 蛋白：
[0162] CDRAHLVDCSRVGDIQTQVLNTAKAQRMAEFFSLLGDANRLRVVSVLAKQELCVC(SEQ ID NO :66),
[0163] ArsR 蛋白：
[0164] LSDETRLGIVLLLREMGELCVCDLCM(SEQ ID N0:67)， CCTLATGPLSSDESEHYADLFKVLGDPV RLRILSQLAAGGC(SEQ ID NO:68), YRAAMPVVRALVAYLTENCCHGTRDC(SEQ ID NO :69),
[0165] CmtR 蛋白：
[0166] CLRGCGLVVATYEGRQVRYALADSHLARALGELVQVVLAVDTDQPC(SEQ ID NO :70),
[0167] LRDCGLVVTVPDGRRSRYELADERLGHALDDLRAAVVAVDADRTCPDADELECC (SEQ ID NO:71) 等。
[0168] 存在于膜蛋白中的参与细菌信号传导的锌（Zn)结合蛋白具有由一个半胱氨酸 残基和三个组氨酸残基组成的固有金属离子结合基序（Draper等人，J.Bacteriol. 2011， 193 (17)，4338-4345)。这里，金属离子结合基序具有 HXXWFYLX21_28CXLFMVIGXWFLVIX18_ 27HXX H的结构，其中X表示任何氨基酸，而表示除Cys之外的氨基酸残基，其数量由m到q所 标明。另外，迄今为止报道的150个或更多个锌结合蛋白可用作本发明中的金属离子结合 基序。
[0169] 已知的金属离子转运蛋白包括助阳离子扩散蛋白，Zrt、Irt样蛋白、阳离子 交换蛋白、铜转运蛋白、重金属P型ATP酶、ATP结合盒转运蛋白等（Hanikenne等人， Plant Physiology2005,137,428-446 ;Hall 和 Williams, J.Experimental Botany,2003, 54 (393) 2601-2613)，并且在本发明中可优选使用以下M-X-C-X-X-C基序，但不限于此：
[0170] E.coli ZntA:VSGMDCAACARKVENAVRQLAGVNQVQVLFA(SEQ ID NO:72)
[0171] Tn501MerP:VPGMTCSACPITVKKAISEVEGVSKVDVTFE(SEQ ID NO:73)
[0172] Tn501MerA:ITGMTCDSCAAHVKEALEKVPGVQSALVSY(SEQ ID N0:74)
[0173] S. aureus CadA:VQGFTCANCAGKFEKNVKKIPGVQDAKVNFG(SEQ ID NO :75)
[0174] Human Menkes:VEGMTCNSCVWTIEQQIGKVNGEHHIKVSLE(SEQ ID NO:76)
[0175] Yeast Atxl:VVMTCSGCSGAVNKVLTKLEPDVSKIDIS(SEQ ID NO:77)
[0176] Rat Wilsons:GMTCASCVANIERNLRREEGIYSV(SEQ ID NO:78)
[0177] Hum ffiIsons:YEGMTCQSCVSSIEGKYRKLQGVVRYKVSL(SEQ ID NO:79)
[0178] Rice Cu ATPase:GMSCQGCAGAVRRVLTKMEGVETFDIDME(SEQ ID NO:80)
[0179] H. pylori Cu ATPase:VPSITCSHCVDKIEKFVGEIEGVSFIDANVE(SEQ ID N0:81)
[0180] Rani:VTGMTCAACSNSVEAALMNVNGVDVGGMTCGGCSASVKKLLESQPCVASASV(SEQ ID NO :82)
[0181] Cpx89:VSGMVCAACSTAVENALLSCSGV(SEQ ID NO :83)
[0182] Paal:DVGGMTCGGCSASVKKILESQP(SEQ ID NO:84)
[0183] Cpxll84:DVGGMKCGGCVEHVKKILEEQFGVTSAS(SEQ ID N0:85)。
[0184] 另外，基于体内发现的野生型金属离子结合基序而人工设计的各种金属离子结合 基序可用于根据本发明的修饰抗体_药物缀合物中。这些金属结合基序的实例包括但不限 于：基于来自锌指蛋白的不含半胱氨酸残基的GGH基序设计的CGH基序（Van Horn等人， (2003) J. Biol. Inorg. Chem. 8:601-610)，和通过用其他氨基酸残基如苏氨酸、丝氨酸或组 氨酸来取代肽基序中的一个或多个半胱氨酸残基而获得的金属离子结合基序（Jancso等 人，（2011)Metallomics3 (12) :1331-1339)。CGH基序具有以下化学式1表示的结构，且优 选具有在C末端和N末端都有ACGHA的结构：
[0185] 化学式1
[0186]
【权利要求】
1. 一种修饰抗体，包括在抗体末端处的含半胱氨酸的基序，所述含半胱氨酸的基序具 有下式1的代表性结构： Xa- [ (MCys) n~Xbn] n 式（1) 其中以_)"表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基序 或二级或三级结构，Xa和Xbn各独立地表示包括0到20个除半胱氨酸以外的氨基酸残基的 肽；n是1到20范围的整数。
2. 权利要求1所述的修饰抗体，其中具有由上式1表示的结构的含半胱氨酸的基序结 合到亲本抗体的重链末端。
3. 权利要求2所述的修饰抗体，其中具有由上式1表示的结构的含半胱氨酸的基序结 合到亲本抗体的重链的C末端。
4. 权利要求1所述的修饰抗体，其中所述具有特定功能的肽基序或二级或三级结构是 选自由以下物质构成的组中的任何一种或多种： 锌指蛋白的 C2H2 组（Cys2His2 类：Cys-X2_4-Cys-X12-His-X3_ 5-His)，C4 组（C4 类：Cys_X2-Cys-Xn-Cys-X2-Cys-Xm-Cys-X 2-Cys-Xn-Cys-X2_Cys)或 C6 组（C6 类：Cys-X2-Cys-X6-Cys_X5_12-Cys-X2-Cys-X6_8-Cys)； 基于锌指基序或金属离子结合蛋白基序而人工设计的金属离子结合基序； 转录调节蛋白、金属螯合蛋白，金属离子转运蛋白或超氧化物歧化酶中的CyS-Xm-Cy S基序、Met-X-Cys-X-X-Cys 基序或 C-Q-C-Q-C-A-C 基序； 膜蛋白ATP酶的Ser-Pro-Cys基序； 具有环状结构的金属离子结合肽基序；和 CGH或HGC基序， (其中在上述具有特定功能的所述肽基序的结构中或所述二级或三级结构中，X表示 除Cys之外的氨基酸残基;m是1到10范围的整数，优选1到5范围的整数；Xm或Xm_ q表示 m个或m到q个除Cys之外的氨基酸残基。）
5. 权利要求4所述的修饰抗体，其中所述锌指蛋白的C2H2组、C4组或C 6组是选自由以 下序列组成的组中的任何一种：
YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:53),
YECKECGKAFSSGSNFTRHQRIH(SEQ ID NO :54), FHCGYCEKSFSVKDYLTKHIRTH(SEQ ID NO :55), YECDHCGKAFSVSSNLNVHRRIH(SEQ ID NO:56)， YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH(SEQ ID NO :57), YECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIH(SEQ ID NO:58), YRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIH(SEQ ID NO :59), FACDICGRKFARSDERKRHTKIH(SEQ ID N0:60)， CPVESCDRRFSRSDELTRHIRIH(SEQ ID NO:61)，和 CDICGRKFARSDERKRHTKIH(SEQ ID NO:62); 所述基于锌指基序或金属离子结合蛋白基序而人工设计的金属离子结合基序是选自 由以下序列组成的组中的任何一种：
PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTC(SEQ ID NO:86), PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTM(SEQ ID NO :87), PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHT(Me-C)(SEQ ID NO :88), PYK(Me-C)PECGKSFSQKSALVKHQRTHTH(SEQ ID NO :89), PYKCPE(Me-C)GKSFSQKSALVKHQRTHTH(SEQ ID NO :90), PYKCPE(Me-C)GKSFSQKSALVKHQR(SEQ ID N0:91), GLKALEEKCKALEEKLKALEEKLKALEEKG(SEQ ID NO :92), GLKALEEKLKALEEKLKACEEKLKALEEKG(SEQ ID NO :93), GLKALEEKCKALEEKLKACEEKLKALEEKG(SEQ ID NO :94), GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKALEEKG(SEQ ID NO :95), GLKALEEKLKALEEKLKALEEKCKALEEKG(SEQ ID NO :96), GLKALEEKLKALEEKLKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(SEQ ID NO :97), GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(SEQ ID NO :98), ELYALEKELGALEKELACLEKELGALEKELYALEK(SEQ ID NO :99), KLYALKEKLGALKEKLACLKEKLGALKEKLYALKE(SEQ ID NO:100), ELYALEKELGALEKELACLKEKLGALKEKLYALKE(SEQ ID NO:101), 和 KLYALKEKLGALKEKLACLEKELGALEKELYALEK(SEQ ID N0:102); 所述转录调节蛋白、金属螯合蛋白，金属离子转运蛋白或超氧化物歧化酶中的 Cys-Xm_Cys基序、Met-X-Cys-X-X-Cys基序或C-Q-C-Q-C-A-C基序是选自由以下序列组成 的组中的任何一种：
CEIFCYDEEKVNRIQGDLQTVDISGVSQILKAIADENRAKITYALCQDEELCVC(SEQ ID NO:63), CDTHLVHLDNVRSSQAQILPTDKAQQMAEIFGVLADTNRIRLLSALASSELCVC(SEQ ID N0:64))， CDQPLVHLEQVRQVQPEVMSLDQAQQMAEFFSALADPSRLRLMSALARQELCVC(SEQ ID N0:65)， CDRAHLVDCSRVGDIQTQVLNTAKAQRMAEFFSLLGDANRLRWSVLAKQELCVC(SEQ ID N0:66)， LSDETRLGIVLLLREMGELCVCDLCM(SEQ ID N0:67)， CCTLATGPLSSDESEHYADLFKVLGDPVRLRILSQLAAGGC(SEQ ID NO :68), YRAAMPVVRALVAYLTENCCHGTRDC(SEQ ID NO :69),
HXXWFYLX21_28CXLFMVIGXWFLVIX18_ 27HXXH(其中 X 表示任何氨基酸，而 表示除 Cys 之 外的任何氨基酸残基，其数量由m到q标明），
所述具有环状结构的金属离子结合肽基序是环[K1，12] (QCGVCGKCIACK);以及 所述CGH基序具有由以下化学式1表示的结构： 化学式1
其中M表示金属离子，R表示除半胱氨酸之外的氨基酸残基。
6. 权利要求1所述的修饰抗体，其中所述亲本抗体是选自由单克隆抗体、双特异性抗 体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体组成的组中的一种或多种。
7. 权利要求1所述的修饰抗体，其中所述亲本抗体是选自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM 组成的组中的一种或多种。
8. 权利要求1所述的修饰抗体，其中所述亲本抗体具有对癌症特异性抗原、细胞表面 受体蛋白、细胞表面蛋白、跨膜蛋白、信号蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与 组织进化或分化相关的分子、淋巴因子、细胞因子、参与细胞周期调节的分子、参与血管发 生的分子和与血管新生有关的分子的结合亲和性和特异性。
9. 权利要求8所述的修饰抗体，其中所述对一种或多种蛋白质具有结合亲和性的亲本 抗体选自由以下物质组成的组： (1)BMPRIB(骨形态发生蛋白受体IB型；Genbank登录号No. NM_001203); (2) E16(LAT1，SLC7A5 ;Genbank 登录号 No. NM_003486); (3) STEAP1 (前列腺六次跨膜上皮抗原；Genbank登录号No. NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUC16, Genbank 登录号 No. AF361486); (5) MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核细胞促进因子，间皮素；Genbank 登录号 No. NM_005823); (6) Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2,溶质携带物家族34(磷酸钠），成员2, II型钠 依赖的磷酸盐转运蛋白3b ;Genbank登录号No. NM_006424); (7) Sema5b(FLJl〇372，KIAA1445，Mm. 42〇15, SEMA?，SEMAG，壁板蛋白 5b Hlog，sema 结 构域，七个血小板反应蛋白重复（类型1和类型1样），跨膜结构域（I'M)和短胞质结构域， (壁板蛋白）5B ;Genbank 登录号 No. AB040878); (8) PSCA hlg(2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA2700050C12, RIKEN cDNA2700050C12 ;Genbank 登录号 No. AY358628); (9) ETBR(内皮素 B 型受体；Genbank 登录号 No. AY275463); (10) MSG783(RNF124,假定蛋白质 FLJ20315, Genbank 登录号 No. NM_017763); (11) STEAP2(HGNC_8639, IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2, STMP，前列腺癌相关基因 1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白，Genbank登录号 No.AF455138)； (12) TrpM4 (BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，瞬时受体电位阳离子通道，M亚家族，成 员 4 ;Genbank 登录号 No. NM_017636); (13) CRIPT0(CR，CR1，CRGF，CRIPTO, TDGF1，畸胎瘤衍生生长因子；Genbank 登录号 No. NP_003203or NM_003212)； (14) CD21(CR2(补体受体 2)或 C3DR(C3d/Epstein Barr 病毒受体）或 Hs.73792; Genbank 登录号 No. M26004); (15) CD79b(CD79B，CD79P，IGb(免疫球蛋白相关 ￠), B29, Genbank 登录号 No. NM_000626)； (16) FcRH2(IFGP4, IRTA4, SPAP1A (含 SH2 结构域磷酸酶锚蛋白 la)，SPAP1B，SPAP1C ; Genbank 登录号 No. NM_030764); (17) HER2 (Genbank 登录号 No. Ml 1730); (18) 选自 EGFR、HER3 和 HEIM 的 ErbB 受体； (19) NCA (Genbank 登录号 No. M18728); (20) MDP(Genbank 登录号 N〇.BC017023); (21) IL20Ra (Genbank 登录号 No.AF184971); (22) fcevican (Genbank 登录号 No. AF229053); (23) EphB2R (Genbank 登录号 No. NM_004442); (24) ASLG659 (Genbank 登录号 No. AX092328); (25) PSCA (Genbank 登录号 No. AJ297436); (26) GEDA (Genbank 登录号 No. AY260763); (27) BAFF-R(B 细胞活化因子受体，BLyS 受体，BR3, NP_443177. 1); (28) CD22(B 细胞受体 CD22-B 同种型；NP-001762. 1); (29) ⑶79a (⑶79A，⑶79a，免疫球蛋白相关a，与Ig0 (⑶79B)共价相互作用并在表 面上与IgM分子形成复合物的B细胞特异性蛋白，转导参与B细胞分化的信号；Genbank登 录号 No. NP_001774. 1); (30) CXCR5(Burkitt' s淋巴瘤受体1，由CXCL13趋化因子活化的G蛋白偶联受体，在淋 巴细胞迁移和体液防御中发挥功能，在HIV-2感染中起作用并参与AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和 白血病的发展；Genbank登录No. NP_001707. 1); (31) HLA-D0B(与肽结合并将肽递呈到⑶4+T淋巴细胞的MHC II类分子的0亚单元 (la 抗原）；Genbank 登录号 No. NP_002111. 1); (32) P2X5 (嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5,由细胞外ATP门控的离子通道，可参 与突触传递和神经发生，缺乏可导致特发性逼尿肌不稳定的病理生理学；Genbank登录号 No. NP_002552. 2)； (33) CD72(B 细胞分化抗原 CD72, Lyb-2 ;Genbank 登录号 No. NP_001773. 1); (34) LY64 (淋巴细胞抗原64 (RP105)，富含亮氨酸重复（LRR)家族的I型膜蛋白，调节B 细胞活性和细胞凋亡，功能丧失与在系统性红斑狼疮患者中增加的疾病活性相关；Genbank 登录号 No. NP_005573. 1); (35) FcRHl (Fc受体样蛋白1，含类C2型Ig免疫球蛋白Fc结构域和ITAM结构域的假 定受体，可在B淋巴细胞分化中起作用；Genbank登录号No. NP_443170.1); (36) IRTA2(免疫球蛋白超级家族受体转运相关蛋白2,在B细胞发育和淋巴瘤发生 中可能起作用的假定免疫受体；通过转运对基因的失调控在一些B细胞恶性肿瘤中发生； Genbank 登录号 No. NP_112571. 1);和 (37) TENB2(假定跨膜蛋白聚糖，与生长因子和卵泡抑素EGF/heregulin家族有关； Genbank 登录号 No. AF179274); (38) MAGE-C1/CT7(睾丸癌中过表达的蛋白）； (39) 雄性激素受体，PTEN，人胰舒血管素相关肽3 (前列腺癌中过表达的蛋白）； (40) CD20 ; (41) CD30 ; (42) CD33 ; (43) CD52 ; (44) EpCam ； (45) CEA ； (46) gpA33 ； (47) 粘液素； (48) TAG-72 ； (49) 碳酸酐酶IX ; (50) PSMA ； (51) 叶酸结合蛋白； (52) 神经节糖苷（⑶2、⑶3、GM2); (53) 水合物 / 糖 Lewis-Y ; (54) VEGF ； (55) VEGFR ； (56) aVb3 ； (57) a5bl ； (58) ERB3 ； (59) c-MET ； (60) EphA3 ； (61) TRAIL-R1, TRAIL-R2 ； (62) RANKL ； (63) FAP ;和 (64) 细胞粘合素。
10. 权利要求8所述的修饰抗体，其中所述亲本抗体包括选自由以下物质组成的组中 的一种或多种：曲妥单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗（panitumumab)、 易普利姆玛（ipilimumab)、阿仑单抗（alemtuzumab)、奥法木单抗（ofatumumab)、吉姆单抗 (gemtuzumab)、贝伦妥单抗（brentuximab)、9°Y_ 替伊莫单抗（9°Y_ibritumomab)、1311_ 托西 莫单抗（131I_tositumomab)、cBR96、cAC10、抗⑶20 抗体、抗 EphB2 抗体、抗 IL_8、E_ 选择素 抗体、抗MUC16抗体、抗⑶30抗体、抗⑶33抗体和抗⑶52抗体。
11. 一种修饰抗体-药物缀合物，包括结合于权利要求1到10中任一项的修饰抗体的 药物，其中所述药物缀合于所述基序中的半胱氨酸残基的巯基上，所述基序结合于亲本抗 体并具有上式1所表示的结构。
12. 权利要求11所述的修饰抗体-药物缀合物，其中所述药物通过接头缀合于所述基 序中的半胱氨酸残基，具有由上式1表示的结构的所述基序结合于所述亲本抗体上。
13. 权利要求12所述的修饰抗体-药物缀合物，其中所述接头是选自由以下物质组成 的组中的一种或多种：含卤代乙酰基基团的烷基卤化物衍生物、含马来酰亚胺基团的衍生 物、环乙亚胺衍生物、丙烯酰基衍生物和含氟代苯的芳基齒化物衍生物或类似物。
14. 权利要求13所述的修饰抗体-药物缀合物，其中所述衍生物包括烷基化反应基团、 芳基化反应性基团、马来酰亚胺基团、环乙亚胺基团、丙烯酰基基团、或含吡啶基二硫化物 和硫硝基苯甲酸的-硫键受换反应基团，所述基团与所述基序中的半胱；氣酸残基的疏基基 团反应并共价结合于其上。
15. 权利要求11所述的修饰抗体-药物缀合物，其中所述药物为选自由以下物质组 成的组中的一种或多种：微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或能够起到 DNA嵌入剂作用的化学治疗剂、抗癌剂、能够起到酶作用的蛋白质毒素、能够抑制特定癌基 因表达的微小RNA(miRNA)、siRNA或shRNA以及放射性同位素。
16. 权利要求11所述的修饰抗体-药物缀合物，其中所述药物为选自由以下物 质组成的组中的一种或多种：类美坦素、奥里斯他汀、氨基蝶呤、放线菌素、博来霉素 〇31601115^；[11)、他利霉索（^11801115^；[11)、喜树碱（^11^1：〇1：116(3；[11)、1^ 8-乙酰基亚精胺、 1-(2氯乙基）-1，2-二甲基甲苯磺酰肼、紫杉醇、埃斯培拉霉素（esperamicin)、依托泊 苷（etoposide)、6_巯基嘌呤、多拉司他汀、单端孢霉烯、CC1065(细胞毒性化合物）、卡奇 霉素及其它烯二炔抗生素、紫杉烧（taxane)、蒽环类（anthracycline)、甲氨蝶呤、阿霉素 (adriamycin)、长春地辛、长春花碱、长春新碱、长春碱、依托泊苷、多柔比星、美法仑、丝裂 霉素C、苯丁酸氮芥、正定霉素、道诺霉素及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物，核 水解酶、抗生素，细菌、植物或动物来源的毒素，以及诸如顺钼、CPT-11，多柔比星、紫杉醇和 多西他赛。
17. -种制造修饰抗体-药物缀合物的方法，包括： (a) 将所述修饰抗体与接头反应剂反应形成抗体-接头中间产物，其中所述修饰抗体 带有由下式1所表不的结构的基序；和 (b) 使所述中间产物与活性药物部分反应以生成修饰抗体-药物缀合物： Xa- [ (MCys) n~Xbn] n 式（1) 其中以_)"表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基序 或二级或三级结构，Xa和Xbn各独立地表示包括0到20个除半胱氨酸以外的氨基酸残基的 肽，n是1到20范围的整数。
18. -种制造修饰抗体-药物缀合物的方法，包括： (a) 将药物部分的亲核基团与接头试剂反应以形成药物-接头中间产物； (b) 使所述中间产物与亲本抗体反应，所述亲本抗体包括结合于其上的基序， 并且其中所述基序具有由下式表示的结构： Xa- [ (MCys) n_Xbn] n 式（1) 其中以_)"表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基序 或二级或三级结构，Xa和Xbn各独立地表示包括0到20个除半胱氨酸以外的氨基酸残基的 肽，n是1到20范围的整数。
19. 一种制造修饰抗体的方法，所述修饰抗体包括结合于亲本抗体的基序，所述方法包 括如下步骤： (a) 构建表达载体，所述表达载体包括多核苷酸序列，其中编码所述基序的多核苷酸基 序和编码所述亲本抗体的多核苷酸序列重组地彼此连接； (b) 使用宿主细胞在培养物中表达所构建的表达载体；和 (c) 从所述培养物中分离和纯化所述修饰抗体， 其中所述基序具有由下式表示的结构： Xa- [ (MCys) n~Xbn] n 式（1) 其中以_)"表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基序 或二级或三级结构，Xa和Xbn各独立地表示包括0到20个除半胱氨酸以外的氨基酸残基的 肽，n是1到20范围的整数。
20. 权利要求19所述的方法，其中所述宿主细胞选自由以下物质组成的组：猴肾细胞 7(COS7)、NSO细胞、SP2/0细胞、中国仓鼠卵巢（CHO)细胞细胞、W138、幼仓鼠肾（BHK)细胞、 Madin-Darby犬肾（MDCK)细胞、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞和HEK293细胞。
21. -种治疗组合物，包括权利要求11至16中任何一项所述的修饰抗体-药物缀合 物。
【文档编号】A61K39/395GK104220458SQ201380017477
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月24日
【发明者】朴淳宰, 郑惠信, 权善勳, 李善培, 柳善儿, 金容模 申请人:阿特根公司