适用于治疗血友病的化合物的制作方法

适用于治疗血友病的化合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及适用于治疗凝血疾病的VWF化合物以及组合物。
【专利说明】适用于治疗血友病的化合物 技术背景
[0001] 本发明涉及血友病的治疗和/或预防。
[0002] 背景 经静脉内给予凝血因子的蛋白质替代疗法目前用于治疗血友病患者。对于患者的方便 性和依从性而言，血管外（例如，皮下（s. c.)或皮内）给药优于现有的静脉内（i. V.)注射。 血管外给予还具有潜在的安全性优势，因为许多患者能够避免静脉内端口手术以及这类导 管插入相关的感染和凝血风险。
[0003] 在FVIII缺乏的小鼠中经皮下给予FVIII，公开于Shi等人，Haemophilia, 2012， DOI :10. 1111/j. 1365-2516. 2011. 02735. X。FVIII的生物利用度在此文中据报告为低（大 约 1%)。
[0004] 经皮下给予FVIII和VWF另外公开于W008151817,但未公开FVIII剂量和所达到 的循环FVIII浓度间的剂量反应关系。在W0815817中，VWF与FVIII的（单位）比率大于 5:1，相当于VWF蛋白浓度比FVIII浓度有150-250倍摩尔过量。然而，从实践和经济上的 观点看，这种类型的比例并不理想。在W008151817中，进一步证明了当将FVIII与VWF共 同配制时，经皮下给予FVIII的小鼠的免疫原性明显降低。
[0005] 在W010062768中，公开了 FVIII的聚乙二醇化可以改进经皮下注射给小鼠的 FVIII的生物利用度，而与VWF共同配制却没有改进FVIII的生物利用度。
[0006] 本领域需要这样的化合物和/或药物组合物：其适用于经血管外给予，以在有或 无抑制剂时治疗和/或预防患有凝血疾病例如A型血友病的患者，和/或治疗和/或预防 患有冯维勒布兰德氏病的患者，因为这样的给予形式将会减轻经静脉内治疗的负担，这两 者的静脉内治疗都同样涉及到输注并且也涉及到因植入便携式导管所致的感染风险。这样 的化合物和组合物优选是安全的（即具有低的免疫原性风险）和/或具有高生物利用度和 /或优选是在生产和配制过程中容易处理的。
[0007] 概述 本发明涉及包含1200个或更少氨基酸的重组VWF片段，例如，TIL'结构域或TIL' /E' 结构域（Zhou等人.Blood 2012 ;120(2) :449-458)。本发明还涉及包含以下的药物组合 物：⑴本发明的VWF片段，和（ii) FVIII分子（全长/截短的B结构域/缀合的）。本 发明还涉及它们在治疗血友病中的用途，例如经血管外给予。这样的化合物和组合物当经 血管外共同给予FVIII时将优选导致相对高的FVIII生物利用度和/或相对低的FVIII免 疫原性风险。
[0008] 描述 本发明的一方面，与具有延长的体内循环半寿期的FVIII分子共同给予的本发明的 VWF片段在经血管外（例如皮下）给予时具有令人惊奇的高生物利用度。
[0009] 本发明的发明人还惊奇地发现了以下观察结果：在与类似摩尔量的本发明的VWF 片段血管外共同给予后，可以明显改善FVIII分子的生物利用度。或者，可通过血管外共同 给予FVIII分子库，以达到高生物利用度，在所述分子库中，大部分所述FVIII分子与本发 明的VWF片段结合。有趣的是，全长VWF对FVIII的生物利用度没有积极影响。优选地，VWF 应当呈VWF片段的形式，其包含TIL'或TIL' /E'结构域。因此，本发明的化合物和组合物 可在有或无抑制剂时用于治疗和预防血友病患者（尤其是A型血友病患者），以及在有抑制 剂时用于血友病患者的免疫耐受诱导（ITI)。
[0010] 附图简述 图1 :在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7. 7倍摩尔剂量的VWF TIL' /E' /D3/A1 时，在皮下给予10000 U/kg "N8-GP"后，血浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来自 n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。"N8-GP"是如W02009108806的实施例1+2 所述而制备的糖-聚乙二醇化FVIII分子。
[0011] 图2 :在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7. 7倍摩尔剂量的VWF TIL'/E'/D3/ Al时，在皮下给予10000 U/kg N8-GP后，血浆中的FVIII抗原。数据是在每一时间点来自 n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0012] 图3 :在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7. 7倍摩尔剂量的VWF TIL' /E' / D3/A1时，在皮下给予2500 U/kg N8-GP后，血浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来 自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0013] 图4 :在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7. 7倍摩尔剂量的VWF TIL' /E' / D3/A1时，在皮下给予2500 U/kg N8-GP后，血浆中的FVIII抗原。数据是在每一时间点来 自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0014] 图5 :在有或无共同给予相对于FVIII而言的7. 7倍摩尔剂量的VWF TIL' /E' / D3/A1 时，在皮下分别给予 5000 或 20000 IU/kg wt FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血 浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准 差。"N8"/"turocotog alfa"是如W02009108806的实施例1中所述而制备的B结构域截 短的FVIII分子。
[0015] 图6 :在有或无共同给予相对于FVIII而言的7. 7倍摩尔剂量的VWF TIL' /E' / D3/A1 时，在皮下给予 5000 或 20000 IU/kg wt FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血浆中 的FVIII抗原。数据是在每一时间点来自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0016] 图7 :在有或无共同给予相对于FVIII而言的7. 7倍摩尔剂量的VWF TIL' /E' / D3/A1 时，在皮下给予 5000 IU/kg FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血浆中的 FVIII 抗 原。数据是在每一时间点来自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0017] 图8:在有或无共同给予相对于FVIII而言的7. 7倍摩尔剂量的VWF TIL' /E'/ D3/A1 时，在皮下给予 5000 IU/kg FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血浆中的 FVIII 活 性。数据是在每一时间点来自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0018] 图 9 :在 20T 与 FVIII (N8, turoctocog alfa)结合的 VWF 变体（764-865 SEQ ID NO 5)。上图面显示每次滴定后释放热量的原始数据。下图面显示得自积分原始数据的 结合等温线。数据分析表明VWF变体（SEQ ID NO 5)在放热反应中与FVIII结合，其化学 计量学为 1. 14, Λ H 为-5. 82 kcal/mole，Λ S 为 9. 8 cal/mol/deg 和 Kd 为 0· 33 μΜ。"F8/ N8/turoctocog alfa"是如W02009108806的实施例1中所公开而制备的B结构域截短的 FVIII分子。
[0019] 图10 :经皮下给予的N8-GP在体内能有效止血。左图面显示在尾巴横切前24小 时经皮下N8-GP或溶媒治疗，或在尾巴横切前5分钟经静脉内治疗的FVIIIKO小鼠中的血 液损失。N8-GP"是如W02009108806的实施例1+2中所述而制备的糖-聚乙二醇化FVIII 分子。右图面显示在来自小鼠离体全血中的凝血时间，使用R0TEM。
[0020] 图 11 :在 25°C，FVIII、TIL，/E，/D3/A1 III、以及 FVIII 和 TIL，/E，/D3/A1 III 的混合物在155 mM NaCl、10 mM乙酸钙、10 %异丙醇中的SEC-UV (280 nm)色谱图。
[0021] 图 12 :在 25°C，FVIII、TIL' /E' /D3 II、以及 FVIII 和 TIL' /E' /D3 II 的混合物 在155 mM NaCl、10 mM乙酸钙、10%异丙醇中的SEC-UV (280 nm)色谱图。
[0022] 定义 本文使用的术语"治这"指任何有需要的人或其他脊椎动物受试者的医学治疗。预期 所述受试者已经历医生或兽医进行的身体检查，医生或兽医已给出试验性或明确的诊断， 表明使用所述特定治疗对治疗所述人或其他脊椎动物的疾病有益。根据受试者健康状况， 所述治疗的时机和目的可因个体的不同而异。因此，所述治疗可以是预防性的、缓和性的、 对症的和/或治愈性的。
[0023] 给药方式:本发明的化合物和药物组合物可经胃肠外给予，例如，经静脉内或血管 外（例如，皮内、肌内、皮下等）给予。本发明的化合物和药物组合物可以是预防性和/或 治疗性地给予和/或按需要给予。根据本发明，血管外给予本发明的化合物/药物组合物 具有若干优势。血管外给予对所有患者的可能益处、尤其是对儿童和小婴儿的特定益处是， 更容易、简单，更少疼痛，更少麻烦和并发症（并因此可能带来较好的依从性）。
[0024] 联合治疗/共同给予：可以以许多不同方式完成两种或更多种活件化合物(例如， FVIII和具有与FVIII结合能力的本发明的VWF/VWF片段）的联合给予。在一个实施方案 中，两种活性化合物可以在单个组合物中一起给予。在另一个实施方案中，两种活性化合物 可以在单独组合物中给予，作为联合治疗的组成部分。例如，第一种化合物可以在第二种 化合物之前、之后或同时给予。在FVIII和VWF片段作为两种单独的药物组合物经血管外 (例如，皮下）给予的情况下，它们优选地是靠近地给予，以便得益于这两种类型的化合物 同时给予时所获得的改进的生物利用度（即注射部位应当间隔不超过5 cm、优选地不超过 4 cm、优选地不超过3 cm、优选地不超过2 cm和最优选地不超过I cm)。两种化合物还应 当优选地在大约1小时内、优选大约30分钟内、优选大约15分钟内、和最优选地大约5分 钟内注射。
[0025] 因子VIII :因子VIII (FVIII)是主要由肝细胞产生的大的复杂糖蛋白。人 FVIII包含2351个氨基酸，包括信号肽，并包含若干个不同的结构域，如通过同源性所 限定。有3个A-结构域、1个唯一的B-结构域和2个C-结构域。结构域顺序可列为 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。通过二价金属离子结合将链连接在一起。A1-A2-B链命名为 重链（HC)，而A3-C1-C2命名为轻链（LC)。Al (al区）和A2 (a2区）的小的酸性区C-末 端和A3结构域的N-末端（a3区）在其与其它凝血蛋白质的相互作用中起到重要作用，所 述其它凝血蛋白质包括凝血酶和冯维勒布兰德因子（von Willebrandt Factor) (VWF)， FVIII的载体蛋白。
[0026] 内源VIII分子以具有不同尺寸的B-结构域的分子库（最短的具有在位置740的 C-末端，即在A2-a2的C-末端，并因此不含B结构域）在体内循环。这些具有不同长度的 B结构域的FVIII分子都具有全部促凝血活性。一旦用凝血酶活化，在位置372的Al-al的 C-末端、在位置740的A2-a2的C-末端、和在位置1689的介于a3和A3之间切割FVIII， 后一切割释放a3区，同时失去对VWF的亲和力。活化的FVIII分子称为FVIIIa。活化允许 FVIIIa与磷脂表面样活化的血小板和活化的因子IX (FIXa)相互作用，即形成tenase复合 物，允许有效活化因子X (FX)。
[0027] 术语"因子VIII (a) "和"FVIII (a) "包括FVIII和FVIIIa两者。同样，术语"因子 VIII"和"FVIII"可包括FVIII和FVIIIa两者。本文使用的"因子VIII"或"FVIII"是指 作为内在凝血途径的成员并对血液凝固必需的人血浆糖蛋白。"野生型（wt)/天然FVIII" 是源自如SEQ ID NO :1 (氨基酸1-2332)所示的全长序列的人FVIII分子。"FVIII (a)"包 括可以在个体之间存在并出现的FVIII (a)的天然等位变体。FVIII (a)可以是血浆衍生的 或经重组产生的，使用众所周知的生产和纯化方法。糖基化、酪氨酸硫酸化和其它翻译后修 饰的程度和位置可以随所选择的宿主细胞及其生长环境的不同而变。
[0028] 本发明的药物组合物可包含这样的天然的或B结构域-截短的FVIII分子：其中 剩余结构域接近相当于如SEQ ID NO :3的氨基酸编号1-740和1649-2332所示的序列。在 这类分子中，以及在包含全长B结构域氨基酸序列的FVIII中，可以引入突变。可将氨基酸 修饰例如取代、插入和缺失引入分子中，以便修饰FVIII与多种其他组分的结合能力，所述 多种其他组分例如低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP)和相关受体、多种其他受体、其他凝 血因子、细胞表面、糖基化位点的引入和/或取消等。不取消FVIII活性的其它突变也可在 本文的FVIII分子中提供。
[0029] 本文的FVIII分子（分子/变体/衍生物/类似物/缀合物）在凝血级联中能够 起作用，其方式在功能上类似于或等同于wt/内源FVIII，导致FXa的形成（经由与活化血 小板上的FIXa相互作用）和支持血凝块的形成。可使用本领域众所周知的技术，在体外评 价FVIII活性。凝血分析、FX活化测定法（通常称为显色测定法）、凝血酶产生测定法和全 血血栓-弹性成像是这类体外技术的实例。本发明的FVIII分子具有的FVIII活性是天然 人FVIII的至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大 约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、100%或甚至超过100%。
[0030] 将内源全长FVIII合成为单链前体分子。在分泌之前，将前体切割为重链和轻链。 可从两种不同的策略产生重组B结构域缺失或截短的FVIII。将无 B-结构域的重链和轻链 单独合成为两条不同的多肽链（两条链策略），或将B-结构域缺失或截短的FVIII合成为 单一前体多肽链（单条链策略），其以与全长FVIII前体相同的方式被切割为重链和轻链。
[0031] 在经单条链策略产生的B结构域缺失或截短的FVIII前体多肽中，通常通过接头 分开重链和轻链部分。为了使在B结构域缺失的FVIII中导入免疫原性表位的风险最小化， 接头的序列优选来源于FVIII B结构域。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648 组成该识别位点。在B结构域缺失的FVIII活化时导致接头移除的凝血酶切割位点位于重 链中。因此，接头的尺寸和氨基酸序列不太可能影响通过凝血酶活化将其从残余FVIII分 子中移除。B结构域的缺失/截短对于产生FVIII是有利的。然而，可在接头中包含部分B 结构域而不降低生产能力。B结构域对生产能力的负面效应不能归因于B结构域的任何特 定尺寸或序列。
[0032] SEQ ID NO :1 :wt人FVIII (Ser750残基以黑体和下划线显示） ATRRYYLGAVELSffDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLL GPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMAS DPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASAR AffPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYffHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDL GQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPK TWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEV ⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYS SFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQAS NIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLff ILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPEND IEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLH HSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDT TLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSIS LLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKN MEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKV VVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNL FLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQ NFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIP QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTCDQRE VGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKff NEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAA INEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPR SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAE VEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDL EKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHA INGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWR VECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVD LLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRL HPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKE WLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRY LRlHPQSffVHQIALRMEVLGCEAQDLY FVIII的B结构域跨越SEQ ID NO :1的氨基酸741-1648。B-结构域在若干不同位点 上被切割，在循环的血浆FVIII分子中产生大的异质性。高度糖基化的B-结构域的确切功 能未知。所知道的是B结构域在凝血级联中对FVIII活性是非必要的。因此经常以B结构 域缺失/截短的变体形式产生重组FVIII。在一个优选的实施方案中，由编码包含具有以 下序列的21个氨基酸残基L (接头）序列的FVIII分子的表达载体产生FVIII分子：SEQ ID NO 2:SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (0-聚糖连接到下划线的S)。或者，优选的B结构域接 头序列可以缺乏SEQ ID NO 2所示的一个或多个氨基酸残基，例如SEQ ID NO 2中的C-末 端R。优选的FVIII分子是B结构域缺失/截短的变体，其包含连接到SEQ ID NO 1中所示 的Ser 750残基的0-聚糖，任选经由该0-聚糖缀合到聚合物（半寿期延长）部分上。
[0033] 本发明的发明人惊奇地发现了以下观察结果：与例如具有整个B结构域完整的 FVIII以及没有或仅有少数氨基酸（例如，15-30个氨基酸）完整的FVIII分子相比，本发明 的具有以下长度的B结构域的B结构域缺失FVIII分子当经血管外（例如皮下）给予时，具 有惊人高的生物利用度：大约100至大约400个氨基酸（（优选150-650、更优选150-600、 更优选150-550、更优选150-500、更优选150-450、更优选150-400、更优选150-350、更优 选200-700、更优选200-600、更优选200-500、更优选200-400、更优选200-300、和最优选大 约200-250)。这样的分子可以包含或可以不包含SEQ ID NO 1的Sei750残基。因此提供 了在皮下/皮内给予后具有改善的生物利用度的FVIII的简单而安全的生产方式。通过将 所述变体与半寿期延长部分缀合/融合可延长具有100至大约400个氨基酸的B结构域的 FVIII的体内循环半寿期是似乎合理的。包含226个氨基酸的B结构域的FVIII分子的实 例见 SEQ ID NO 3 : SEQ ID NO 3 : (226个氨基酸的B结构域变体）： atrryylgavelswdymqsdlgelpvdarfpprvpksfpfntsvvykktIfveftdhlfniakprppwmgll gptiqaevydtvvitlknmashpvsIhavgvsywkasegaeyddqtsqrekeddkvfpggshtyvwqvlkengpmas dpicltysylshvdlvkdlnsgligallvcregslakektqtlhkfilIfavfdegkswhsetknslmqdrdaasara wpkmhtvngyvnrslpgligchrksvywhvigmgttpevhsifleghtflvrnhrqaslei spitfltaqtllmdlg qfllfchisshqhdgmeayvkvdscpeepqlrmknneeaedydddltdsemdvvrfdddnspsfiqirsvakkhpktw vhyiaaeeedwdyaplvlapddrsyksqylnngpqrigrkykkvrfmaytdetfktreaiqhesgiIgpIIygevgd tlliifknqasrpyniyphgitdvrplysrrlpkgvkhlkdfpilpgeifkykwtvtvedgptksdprcltryyssf vnmerdlasgligpllicykesvdqrgnqimsdkrnvilfsvfdenrswylteniqrflpnpagvqledpefqasni mhsingyvfdslqlsvclhevaywyilsigaqtdflsvffsgytfkhkmvyedtltlfpfsgetvfmsmenpglwiI gchnsdfrnrgmtallkvsscdkntgdyyedsyedisayIlsknnaieprsfsqnsrhpstrqkqfnattipendie ktdpwfahrtpmpkiqnvsssdlImllrqsptphglslsdlqeakyetfsddpspgaidsnnslsemthfrpqlhhs gdmvftpesglqlrlneklgttaatelkkldfkvsstsnnlistipsdnlaagtdntsslgppsmpvhydsqldttl fgkksspltesggplsiseenndskllesglmnsqesswgknvshhhhhhsqnppvlkrhqreitrttlqsdqeeid yddtisvemkkedfdiydedenqsprsfqkktrhyfiaaverlwdygmsssphvlrnraqsgsvpqfkkvvfqeftdg sftqplyrgeInehIgllgpyiraevednimvtfrnqasrpysfysslisyeedqrqgaeprknfvkpnetktyfwk vqhhmaptkdefdckawayfsdvdlekdvhsgligpllvchtntlnpahgrqvtvqefalfftifdetkswyftenm erncrapcniqmedptfkenyrfhaingyimdtlpglvmaqdqrirwyIlsmgsnenihsihfsghvftvrkkeeyk malynlypgvfetvemlpskagiwrvecligehlhagmstIflvysnkcqtplgmasghirdfqitasgqygqwapk larlhysgsinawstkepfswikvdllapmiihgiktqgarqkfsslyisqfiimysldgkkwqtyrgnstgtlmvff gnvdssgikhnifnppiiaryirlhpthysirstIrmelmgcdlnscsmplgmeskaisdaqitassyftnmfatws pskarlhlqgrsnawrpqvnnpkewlqvdfqktmkvtgvttqgvksIltsmyvkeflisssqdghqwtlffqngkvk vfqgnqdsftpvvnsIdppIItrylrihpqswvhqialrmevlgceaqdly 冯维勒布3德因子（VffF)是渉及到Ih血的一种血液糠蛋白。在最常见的遗传性出血障 碍冯维勒布兰德氏病中该因子缺乏或有缺陷。VWF是存在于血浆中的大的多聚体糖蛋白， 在内皮、巨核细胞和内皮下结缔组织中组成型地产生。基本VWF单体是2050个氨基酸的蛋 白。每个单体含有具有特定功能的许多特定结构域，包括与FVIII结合的TIL'或TIL' /E' 结构域（Zhou等人.Blood 2012 ;120 (2) :449-458)。FVIII与VWF结合，同时在循环中失 活并通过凝血酶作用从VWF中释放。不与VWF结合的FVIII (a)被快速清除和/或降解。本 文证明了，全长VWF没有显著增加血管外共同给予的FVIII的生物利用度的能力，尽管它具 有固有的FVIII保护作用。
[0034] 因此全长VWF分子是非常复杂的蛋白质。前原VWF (pr印ro VWF)由2813个氨基 酸残基（SEQ ID NO 22)组成。在分泌期间，氨基酸残基1-22的信号肽和氨基酸残基23-763 的前肽被切割，得到2050个氨基酸残基的成熟VWF。因此氨基酸编号通常是根据前原VWF， 因此氨基酸S764是成熟分子中的第一个氨基酸。认为成熟分子含有12个Asn-连接的和 10个Thr/Ser连接的寡糖侧链。此外该分子可以形成二聚体、三聚体等，多聚体分子量至多 达几百万道尔顿。在人体中已发现不同的等位VWF变体，因此可以理解，本发明的VWF片段 可以源自这些天然发生的变体的任一个。
[0035] 对于VWF的药物组合物而言，全长分子的糖基化异质性，以及多聚体形成性能，使 得构建表达系统和下游纯化过程颇具挑战性。
[0036] 对VWF中的组织和结构域边界的理解尚未完成。仅仅所谓A结构域被良好表征并 测定了它们的晶体结构。VWF内的二硫化物的化学安排是有限的。然而，近期对VWF中的结 构域与其它蛋白中的结构域的同源性的研究表明可以形成若干二硫键。Zhou等人.Blood 2012 ; 120，449-458所述的VWF的结构域定义用于本文中。
[0037] 本发明涉及VWF片段，其优选比全长分子更容易产生。本文的VWF片段还更优选地 具有增加经皮下共同给予的FVIII的生物利用度的能力。本发明的VWF片段包含TIL'结构 域/亚结构域（跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-778)或TIL'结构域/亚结构域（跨越 SEQ ID NO 22 的氨基酸 764-828 或 SEQ ID NO 22 的氨基酸 764-829)或 TIL'/E'结构域 / 亚结构域（跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-865)的至少15个N-末端氨基酸并且尺寸小 于1500个氨基酸、优选小于1400个氨基酸、优选小于1300个氨基酸、优选小于1200个氨 基酸、优选小于1100个氨基酸、优选小于1000个氨基酸、优选小于900个氨基酸、优选小于 800个氨基酸、优选小于700个氨基酸、优选小于600个氨基酸、优选小于500个氨基酸、优 选小于400个氨基酸、优选小于300个氨基酸、优选小于275个氨基酸、优选小于250个氨基 酸、优选小于225个氨基酸、优选小于200个氨基酸、优选小于175个氨基酸、优选小于150 个氨基酸、优选小于125个氨基酸、优选小于100个氨基酸、优选小于95个氨基酸、优选小 于90个氨基酸、优选小于85个氨基酸、或优选小于80个氨基酸、或优选小于75个氨基酸、 或优选小于70个氨基酸、或优选小于65个氨基酸、或优选小于60个氨基酸、或优选小于55 个氨基酸、或优选小于50个氨基酸、或优选小于45个氨基酸、或优选小于40个氨基酸、或 优选小于35个氨基酸、或优选小于30个氨基酸、或优选小于25个氨基酸、或优选小于20个 氨基酸、或优选小于15个氨基酸。本发明的VWF片段优选地包含TIL' /E' /D3结构域（其 中D3分为亚结构域VWD3-C8-3-TIL-3-E3)，其跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-1250或氨 基酸764-1261或氨基酸764-1268。本发明的VWF片段优选地包含TIL'、TIL'或TIL' /E' 结构域（SEQ ID NO 22的氨基酸764-778、764-828或氨基酸764-865)的至少15个N-末 端氨基酸。本发明的VWF片段还可以含有较少潜在抗原性区。本发明的VWF片段二聚体的 分子量可以自然是单体片段的大约两倍（本发明的二聚体因此可包含至多大约2400个氨 基酸，如果单体尺寸是1200个氨基酸的话）。
[0038] 优选地，本发明的VWF片段包含至少氨基酸764-828 (SEQ ID NO 4)，或至少氨 基酸764-865 (SEQ ID NO 5)，或至少氨基酸764-1035 (SEQ ID NO 6)，或至少氨基酸 764-1041 (SEQ ID NO 7)，或至少氨基酸 764-1045 (SEQ ID NO 8)，或至少氨基酸 764-1128 (SEQ ID NO 9)，或至少氨基酸 7M-Il98 (SEQ ID no 10)，或至少氨基酸 764-125〇 (SEQ ID NO 11)，或至少氨基酸 764-1261 (SEQ ID NO 14)，或至少氨基酸 764-1268 (SEQ ID NO 22)。
[0039] 在一个实施方案中，在本发明的VWF片段中的C1099和/或Cl 142半胱氨酸可以突 变。这些半胱氨酸残基据信负责VWF蛋白的寡聚化/二聚化。具有这两个半胱氨酸的VWF 片段可以形成二聚体和同型寡聚物。这两个半胱氨酸的修饰可以导致产生由单体VWF片段 组成的产物，而一个或另一个的缺失可以导致二聚体VWF片段或可能导致寡聚物VWF片段。 以上两种情况都可导致比全长蛋白更简单的产物纯化过程。
[0040] 在另一个实施方案中，C1099和C1142半胱氨酸两者都保持完整，其可以导致优选 的二聚体VWF片段。包括C1099和Cl 142半胱氨酸的天然序列可具有安全性优势。
[0041] 惊奇的是，与FVIII和全长VWF分子的共同配制相比，本发明的FVIII和VWF片段 的共同配制显示了改进的生物利用度。本发明的共同配制显示了经皮下注射的因子VIII 的增加的生物利用度。本发明的VWF片段包含D'结构域（跨越SEQ ID NO :22的氨基酸 764-865/866)，其被认为是主要的FVIII结合部位，其中FVIII可以通过静电偶极-偶极样 相互作用停靠在D'。本发明的VWF片段优选地包含D'结构域和/或D3-结构域（D3结构 域跨越SEQ ID NO: 15的氨基酸865/866-1250/1261/1268)。根据本文的发现，可能D'和 D'D3结构域两者都具有与FVIII结合的能力。本发明的VWF片段没有任何明显程度地（即 优选小于5%、更优选小于4%、优选小于3%、优选小于2%、更优选小于1%)形成多聚体（即具 有超过两个单元，例如寡聚物），因为多聚体装配所必需的半胱氨酸（C1099和C1142)不存 在或已经突变/取代。本发明的一些VWF片段在任何明显程度上不再形成二聚体，尤其是 其中C1099和/或Cl 142半胱氨酸不存在的那些。
[0042] 然而，在某些情况下，形成二聚体的VWF片段也可用于本发明，TIL' /E' /D3/A1二 聚体例如已经证明具有比单体更高的FVIII亲和力。VWF片段二聚体还可以是相对同质的 产物，其可被相对容易地生产。
[0043] 本发明的VWF片段的一个优势就是在工业规模上更容易生产作为相对同质产物 的所述化合物，因为低程度的多聚化和因为以下事实：与全长VWF相比，所述化合物是具有 较少的翻译后修饰的较小的化合物。这意味着更容易达到高表达水平和/或因分子更简单 而导致纯化方法将会更简单。另外，与在哺乳动物细胞系中的生产相比，在简单生物体例如 酵母中的重组肽和蛋白质的产生是更快和更便宜的生产方法，本发明的某些VWF片段可以 在酵母中生产。
[0044] 本发明的VWF片段可以呈单链VWF片段的形式（例如，跨越SEQ ID NO 22的氨基 酸764-1459的完整TIL' /E' /D3/A1区）或呈多组来自VWF的连续氨基酸融合在一起并因 此缺失中间片段的形式（例如，跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-828+764-865的TIL'和 TIL'/E'结构域的"融合物")。另一实例可以是SEQ ID NO 22的氨基酸764-828+1127-1197。 本发明的VWF片段或者还可以呈重复序列的形式。可将同源或异源"间隔基（spacer) "序列 引入融合的VWF片段/序列之间（例如，TIL'/E'结构域的多重融合物，例如TIL'/E'TIL'/ E' TIL' /E'）。本发明的VWF片段还可以在VWF衍生的序列中包含一个或多个氨基酸交替 (alternation)(例如，取代、缺失、添加）。
[0045] 可以通过将FVIII与至少一个半寿期延长部分缀合而进一步改进经血管外共同 给予FVIII和本发明的VWF片段时的FVIII的生物利用度。因此，包含TIL'和/或TIL'/ E'结构域的VWF片段和与至少一个半寿期延长部分缀合的FVIII分子的血管外共同给予与 相对高的FVIII生物利用度有关。
[0046] 本发明的VWF片段的实例（使用来自Zhou等人的结构域注释）如以下SEQ ID NO 4-21 中所示。TIL' /E' /VWD3 I、TIL' /E' /VWD3 II 和 TIL' /E' /VWD3 III 表示 3 种形式 (不同长度）的TIL' /E' /VWD3。
[0047] SEQ ID NO 4 :氨基酸 764-828 (TIL，）： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCP SEQ ID NO 5 :氨基酸 764-865 (TIL，/E'）： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEY APGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDA SEQ ID NO 6 :氨基酸 764-1035 (TIL，/E' /VWD3 I): SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTR SEQ ID NO 7 :氨基酸 764-1041 (TIL，/E' /VWD3 II): SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHP SVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRY11LLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDS SEQ ID NO 8 :氨基酸 764-1045 (TIL，/E，/VWD3 III): SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPAT SEQIDN0 9:氨基酸 764-1128 (TIL'/E'/VWD3/C8-3)-半胱氨酸 1099 用黑体标明。 该半胱氨酸可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQ SEQ ID NO 10:氨基酸 764-1198 (TIL'/E'/VWD3/C8-3/TIL-3)-半胱氨酸 1099 和 1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHP SVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRY11LLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPV SEQ ID NO 11:氨基酸 764-1250 (TIL，/E'/D3 I)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑体标 明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDA SEQ ID NO 12:氨基酸864-1250 (D3 I)-半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个 半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： ATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIEL FDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQ VEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCS CESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPV QCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGL VVPPTDA SEQ ID NO 13:氨基酸864-1268 (D3 II)-半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两 个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： ATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIEL FDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQ VEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCS CESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPV QCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLV VPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHD SEQ ID NO 14:氨基酸 764-1261 (TIL，/E'/D3 II)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑体标 明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVED SEQ ID NO 15:氨基酸 764-1264 (TIL，/E'/D3 III)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑体 标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEP SEQ ID NO 16:氨基酸 764-1268 (TIL，/E'/D3 IV)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑体 标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHD SEQ ID NO 17:氨基酸 764-1459 (TIL，/E'/D3/A1 I)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑 体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLK AFVVDMMERLRISQKffVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDR PEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRD EI VSYLCD SEQIDN0 18:氨基酸 764-1463 (TILVE'/D3/AlII)-半胱氨酸 1099 和1142用黑 体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLK AFVVDMMERLRISQKffVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDR PEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRD EI VSYLCDLAPE SEQ ID NO 19:氨基酸 764-1464 (TIL，/E'/D3/A1 III)-半胱氨酸 1099 和 1142 用 黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLK AFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDR PEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRD EI VSYLCDLAPEA SEQ ID NO 20:氨基酸 764-1683 (TIL'/E'/D3/A1/A2)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑 体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTY QEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILT SDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYE CEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPS DPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEF EVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIF SKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDE LEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFM EEVIQRMDVGQD SIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSK⑶ILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQ⑶R EQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLP⑶IQWPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGE GLQIPTLSPA SEQ ID NO 21:氨基酸 764-1873 (TIL'/E'/D3/A1/A2/A3)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLK AFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDR PEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRD EIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRM DVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVY MVTGNPASDEIKRLP⑶IQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSP APDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVD VMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGAS KAWILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGI⑶RYDAAQ LRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCS SEQ ID NO 22:根据 UniProtKB/Swiss-Prot 数据库的野生型人 VWF (登录 P04275) -位置1099和1142的半胱氨酸残基用黑体标明： MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSMYSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSI I⑶FQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNGTVTQ⑶QRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVL LSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWCERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQ LLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGMEYRQ CVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICS NEECPGECLVTGQSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPGLHNSLVK LKHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDD FLTPSGLAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVSPLPYLRNCRYD VCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCF CPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSL SCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETV KIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSV KCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLC GNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNK LVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCA PACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHC DVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMM ERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRIT LLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLC DLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSI HVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPA SDEIKRLP⑶IQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQP LDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGG PSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGI⑶RYDAAQLRILAGPA GDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRP⑶VWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVNCD RGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGA RQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSP KTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILEEQCLVPDSSHCQVLLLPLFAECH KVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEVIASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCAMSCPPSLVYNHCEHGCPRHCDGNVSSCG DHPSEGCFCPPDKVMLEGSCVPEEACTQCIGEDGVQHQFLEAWVPDHQPCQICTCLSGRKVNCTTQPCPTAKAPTCG LCEVARLRQNADQCCPEYECVCDPVSCDLPPVPHCERGLQPTLTNPGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPT LRKTQCCDEYECACNCVNSTVSCPLGYLASTATNDCGCTTTTCLPDKVCVHRSTIYPVGQFWEEGCDVCTCTDMEDA VMGLRVAQCSQKPCEDSCRSGFTYVLHEGECCGRCLPSACEVVTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCLINECVRV KEEVFIQQRNVSCPQLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVIGPGKTVMIDVCTTCRCMVQVGVIS GFKLECRKTTCNPCPLGYKEENNTGECCGRCLPTACTIQLRGGQMTLKRDETLQDGCDTHFCKVNERGEYFWEKRV TGCPPFDEHKCLAEGGKMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYCQGKCASKAMYSIDINDV QDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSVVYHEVLNAMECKCSPRKCSK FVIII分子/夺体/衍牛物/类似物：本用的术语" FVIII "意图指具有FVIII活性 的任何FVIII分子，包括wt FVIII、B结构域缺失/截短的FVIII分子、表现出与wt FVIII 基本相同的或改进的生物活性的FVIII变体和FVIII相关多肽，其中已经通过例如以下方 式对母肽的一个或多个氨基酸进行了化学修饰：蛋白：蛋白融合、烷基化、聚乙二醇化、HES 化、PAS化、PSA化、酰化、酯形成或酰胺形成等（缀合到半寿期延长部分）。
[0048] 半寿其月延长部分/延长基（protractive group):术语"半寿其月延长部分"在本文 中理解为是指经由例如-SH、-OH、-C00H、-C0NH2、-NH2或一个或多个N-和/或0-聚糖结 构与FVIII共价连接的一个或多个化学基团，例如亲水聚合物，例如PEG和/或多糖，所述 基团当与这些蛋白缀合时可以增加体内循环半寿期。适合与本发明的FVIII缀合的延长基 /半寿期延长部分的实例包括：生物相容性的脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉（HAS)例如 羟基乙基淀粉（HES)、聚乙二醇（PEG)、聚（Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸（HA)、Ifeparosan 聚合物（HEP)、基于磷酸胆碱的聚合物（PC聚合物）、FleXimerS、葡聚糖、聚唾液酸（PSA) 等）、Fc结构域、Fc受体、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽、XTEN聚合物、白蛋白结合肽、CTP 肽及其任意组合。一般而言，与无半寿期延长部分的FVIII相比，FVIII与一个或多个半寿 期延长部分（例如，亲水性聚合物）的缀合当与本发明的VWF片段经皮下/皮内共同给予 时通常具有更好的生物利用度。
[0049] 本发明的聚乙二醇化FVIII分子可具有连接到FVIII蛋白包括任何氨基酸残基或 碳水化合物部分的任何部分上的一个或多个聚乙二醇（PEG)分子。可以使用化学和/或酶 促方法将PEG或其它聚合物基团(半寿期延长部分)与FVIII上的聚糖缀合。酶促缀合过程 的实例描述于例如W003031464。聚糖可以是天然发生的，或者可使用本领域众所周知的方 法，通过例如插入N-连接的和/或0-连接的聚糖而将聚糖插入。本发明的"半胱氨酸-聚 乙二醇化FVIII"具有缀合到FVIII中存在的半胱氨酸的巯基上的一个或多个PEG分子。本 发明的"半胱氨酸-酰化的FVIII"具有缀合到FVIII中的半胱氨酸的巯基上的一个或多 个疏水性半寿期延长部分（例如，脂肪酸），可通过遗传工程引入该半胱氨酸残基或者该半 胱氨酸可以是天然氨基酸序列的一部分。还有可能将半寿期延长部分与其它氨基酸残基连 接。
[0050] 融合蛋白：本发明的融合蛋白是通过将两个或更多个最初编码FVIII和融合配偶 体的DNA序列的框内连接而产生的蛋白。该融合蛋白DNA序列的翻译将产生具有来源于各 最初蛋白或肽的功能性质的单一蛋白序列。编码融合蛋白的DNA序列可通过标准生物学方 法（例如重叠 PCR或DNA连接）经人工产生，并进行装配，不包括最初5'-端DNA序列的终 止密码子而保留3'端DNA序列的终止密码子。可将所得融合蛋白DNA序列插入到合适的 表达载体中，所述载体支持异源融合蛋白在标准宿主生物体中的表达。
[0051] 融合蛋白可含有将限定融合蛋白的蛋白或肽部分分隔开的接头或间隔基肽序列。 接头或间隔基肽序列可促进单个蛋白或肽部分的正确折叠并且使得单个蛋白或肽部分保 留其各自的功能性更加成为可能。可在组成完整融合蛋白DNA序列的单个DNA片段的框内 装配期间即在重叠 PCR或DNA连接期间将接头或间隔基肽序列插入到融合蛋白DNA序列。 包含FVIII和融合配偶体的融合蛋白的实例参见W02011101284。
[0052] Fc融合蛋白：术语"Fc融合蛋白"在本文中是指包含与源自任何抗体同种型的Fc 结构域融合的FVIII。由于IgG抗体的相对长的循环半寿期，通常将优选IgG Fc结构域。 此外，为了调节某些效应子功能（例如补体结合和/或与某些Fc受体结合），可修饰Fc结 构域。FVIII与具有与FcRn受体结合的能力的Fc结构域的融合，通常将导致延长的体内 循环半寿期。IgG Fc结构域中的位置234、235和237的突变通常将导致与Fe γ RI受体 (亦可为Fe γ RIIa和Fe γ RIII受体）的结合降低。这些突变不改变与FcRn受体的结合， FcRn受体通过内吞再循环途径促进长的循环体内半寿期。优选地，本发明融合蛋白的修饰 的IgG Fc结构域包含一种或多种下述突变，所述突变将分别导致与某些Fc受体的亲和力 降低（L234A、L235E和G237A)和Clq介导的补体结合降低（A330S和P331S)。或者，Fc结 构域可以是IgG4 Fc结构域，优选地包含S241P/S228P突变。
[0053] (FVIII的）牛物利用度：术语"牛物利用度"描述了在血管外给予后吸收到血液 中的化合物百分率，计算为经血管外给予化合物后浓度时间曲线下面积。这是根据相对于 经静脉内给予后浓度曲线下面积除以同样的FVIII化合物的剂量，经皮下给予后FVIII浓 度曲线下面积除以剂量而计算。按照本发明，FVIII分子的生物利用度（经皮下/皮内共 同给予FVIII和本发明的VWF片段）为至少3%、优选地至少5%、优选地至少6%、优选地至少 7%、优选地至少8%、优选地至少9%、优选地至少10%、优选地至少11%、优选地至少12%、优选 地至少13%、优选地至少14%、优选地至少15%、优选地至少16%、优选地至少17%、优选地至少 18%、优选地至少19%、优选地至少20%、优选地至少21%、优选地至少22%、优选地至少23%、优 选地至少24%、优选地至少25%、优选地至少26%、优选地至少27%、优选地至少28%、优选地 至少29%、优选地至少30%、优选地至少31%、优选地至少32%、优选地至少33%、优选地至少 34%、优选地至少35%、优选地至少36%、优选地至少37%、优选地至少38%、优选地至少39%、 优选地至少40%、优选地至少41%、优选地至少42%、优选地至少43%、优选地至少44%、优选 地至少45%、优选地至少46%、优选地至少47%、优选地至少48%、优选地至少49%、优选地至 少50%、优选地至少55%、优选地至少60%、优选地至少65%、优选地至少70%、和最优选地至少 75%。生物利用度可以如本文所述地测定。优选地，本发明制剂的FVIII生物利用度（FVIII 抗原和/或活性）将会足够高，以在正常活性条件下发挥预防作用，当所述制剂经血管外 (例如，皮下或皮内）给予例如每天1次或2次或每周1、2或3次时。优选地，FVIII剂量 可比得上经静脉内给予FVIII所用的剂量，优选是后者的2倍，更优选3倍、更优选4倍、更 优选大约10倍、更优选大约15倍、更优选大约20倍、和最优选大约25倍。对于剂量的确 定，可以考虑安全性和成本上的考虑。
[0054] FVIII对本发明VWF片段的饱和:FVIII对VWF片段的饱和/与VWF结合或复合的 FVIII的相对量/与VWF结合的FVIII的量除以FVIII的总量。该计算是基于FVIII与所 述蛋白之间结合的KD值。对于FVIII与VWF片段的结合，所测KI值用作KD。
[0055] 以下（二次）方程式可用于根据总浓度[A]t [B]t计算FVIII (A)与另一蛋白 (B)结合的浓度。
【权利要求】
1. 包含至多1200个氨基酸的VWF片段，其中所述VWF片段包含TIL'结构域。
2. 权利要求1的VWF片段，其中所述片段包含TIL'和E'结构域。
3. 前述权利要求中任一项的VWF片段，其中所述VWF片段包含1099和/或1142半胱 氨酸中的一个或两个氨基酸取代。
4. 前述权利要求中任一项的VWF片段，其中小于5%的所述VWF片段呈寡聚物和/或多 聚体的形式。
5. 前述权利要求中任一项的VWF片段，其中所述VWF片段是二聚体的一部分。
6. 前述权利要求中任一项的VWF片段，其中所述VWF片段是单体。
7. 前述权利要求中任一项的VWF片段，其中所述片段包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO 4.SEQ ID NO 5.SEQ ID NO 6.SEQ ID NO 7.SEQ ID NO 8.SEQ ID NO 9.SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20 和 SEQ ID NO 21。
8. 前述权利要求中任一项的VWF片段，其中所述片段包含SEQ ID NO 9,其中1099半 胱氨酸残基被另一氨基酸取代。
9. 权利要求8的VWF片段，其中1099半胱氨酸残基被丝氨酸取代。
10. 权利要求1-7中任一项的VWF片段，其中所述片段包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 1USEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20 和 SEQ ID NO 21， 其中1099和1142半胱氨酸残基被另一氨基酸取代。
11. 权利要求10的VWF片段，其中1099和1142半胱氨酸残基被丝氨酸取代。
12. 药物组合物，包括：⑴权利要求1-11中任一项的VWF片段；和（ii) FVIII分子。
13. 权利要求12的药物组合物，其中所述FVIII分子包含长度为5-700个氨基酸的截 短的B结构域。
14. 权利要求12-13中任一项的药物组合物，其中FVIII是B结构域截短的变体，其中 所述截短的B结构域的氨基酸序列源自SEQ ID NO 1所示的wt FVIII B结构域氨基酸序 列。
15. 权利要求14的药物组合物，其中所述B结构域包含与SEQ ID NO 1的Ser 750氨 基酸残基连接的〇-聚糖。
16. 权利要求12-15中任一项的药物组合物，其中所述FVIII分子与至少一个半寿期延 长部分缀合。
17. 权利要求12-16中任一项的药物组合物，其中至少一个半寿期延长部分与FVIII B 结构域中存在的〇-聚糖共价连接。
18. 权利要求12-17中任一项的药物组合物，其中所述FVIII分子在皮下给予后的生物 利用度为至少5%。
19. 权利要求12-18中任一项的药物组合物，其中FVIII和VWF的摩尔比为1:1。
20. 权利要求12-19中任一项的药物制剂，其中FVIII的浓度为至少500 IU/ml。
21. 权利要求12-20中任一项的药物制剂，其中FVIII与VWF片段结合的量占所述制剂 中的FVIII总量的至少70%。
22. 用于治疗血友病的权利要求12-21中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物 用于经皮下给予。
23. 药物组合物，其中所述组合物包含VWF片段，其中所述VWF片段的氨基酸序列选自： SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20 和 SEQ ID NO 21。
24. 经静脉内或皮下给予用于治疗冯维勒布兰德氏病的权利要求23的药物组合物。
【文档编号】A61K38/37GK104411716SQ201380033560
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2012年4月24日
【发明者】G.博特, D.M.卡普特, F.罗德, J.哈亚宁, K.罗伊普斯托夫, L.蒂姆, M.佩特森, M.克贾科, O.维斯特奧森, J.J.汉森 申请人:诺和诺德A/S（股份有限公司）