诱导骨生成和hedgehog信号传导且抑制脂肪形成的新的氧固醇类似物:氧固醇化合物149的制作方法
【专利摘要】本发明涉及，例如，具有以下结构(式I)的合成的化合物，氧固醇化合物149，或包含氧固醇化合物149和药学上可接受的载体的生物活性组合物或药物组合物。还公开了使用该化合物或生物活性组合物或药物组合物治疗多种疾病(包括例如骨病、肥胖症、心血管障碍和神经障碍)的方法。氧固醇化合物149可局部或全身递送。
【专利说明】诱导骨生成和HEDGEHOG信号传导且抑制脂肪形成的新的 氧固醇类似物：氧固醇化合物149
[0001] 本申请要求2012年5月7日提交的美国临时申请61/643, 776的优先权，其以其 整体在此引入作为参考。
[0002] 本发明在政府支持（GrantNo.AR059794)下做出，且得到NationalInstitutes ofHealth的嘉奖。政府具有本发明的一些权益。
【背景技术】
[0003] 生物制品通常在医学领域用于促进骨生长，包括骨折愈合和脊柱病症的手术处理 (1 - 4)。脊柱融合手术通常通过整形外科医生和神经外科医生等进行以解决影响腰椎和颈 椎的退行性椎间盘疾病和关节炎。从历史观点上说，自体骨移植物，通常从患者的髂嵴采 取，已用于增加椎体节段（vertebrallevel)之间的融合。然而，相关供体位点发病率、增 加的手术时间和与收集自体骨移植物（5-7)相关的增加的血液损失提供了寻找安全和有 效替代品的动机。
[0004] 重组人骨形态发生蛋白-2 (rhBMP-2)通常用于促进人的脊柱融合。其用途在2002 年被美国食品和药物管理局（FDA)批准用于单水平前路椎体间融合（8)dhBMP-2的使用从 此显著增加，其用途的适应症已扩展到包括后路腰椎脊柱融合以及颈椎融合。尽管rhBMP-2 具有功效，但最近的报告质疑其在用于脊柱融合外科手术时的安全性。报告的并发症包括 皮下积液、软组织肿胀、椎体骨质溶解、异位骨形成、逆行射精和致癌（9 - 12)。而且，在其用 于颈椎时观察到气道水肿，促使FDA颁布了一项公共卫生的通知，警告其在颈椎手术中的 使用。迄今没有找到合适的替代品在诱导融合方面具有类似的功效而没有rhBMP-2的不利 作用（12)。
[0005] 氧固醇（oxysterol)形成存在于循环系统以及人和动物组织中的一大家族的胆 固醇的氧化衍生物。已发现氧固醇存在于动脉粥样硬化损伤中且在多种生理过程，如细胞 分化、炎症、凋亡和类固醇产生中起作用。本
【发明者】中的一些之前报告了具体的天然存在的 氧固醇具有稳健的成骨性质（13)。最有效的成骨天然存在的氧固醇，20 (S)-羟基胆固醇 ("20S"）（14)，当施加于能分化为成骨细胞和脂肪细胞的多能间质细胞时是成骨性的和抗 脂肪形成的。之前已进行20S的结构修饰以合成20S更有效的类似物，包括氧固醇化合物 34和氧固醇化合物49,已显示它们能通过活化hedgehog(Hh)信号传递（15)诱导骨髓基质 细胞（MSC)的成骨分化和抑制骨髓基质细胞（MSC)的成脂分化。此外，氧固醇化合物34和 氧固醇化合物49在后外侧脊柱融合的大鼠模型中体内刺激脊柱融合（15)。现有技术的氧 固醇分子具有广泛地和不可预测地改变的性质。仍然需要相比rhBMP-2和现有技术的氧固 醇新的改善的氧固醇，以提供增加的效能和增强的功效，且方便合成和具有较低制备成本。 新的氧固醇可为医师治疗例如长骨骨折、脊柱疾病和骨质疏松提供更可行的临床选择。
[0006] 上述成骨的氧固醇特别适用于直接、局部给药于感兴趣的靶细胞、组织或器官。目 前，没有商业上的合成代谢药物用于全身递送和骨病例如骨质疏松的干预，骨质疏松为在 老年男性和女性以及绝经后妇女中骨损失的疾病。目前仅有的诱导骨形成的全身递送药物 为ForteoT< (特立帕肽[rDNA起源]注射），其是昂贵的，具有不利作用且FDA要求使用不 超过24个月。对在例如骨质疏松患者中全身给药后更安全和更有效诱导全身骨形成的成 骨剂，如成骨的氧固醇存在需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0007] 图1显示成骨的氧固醇的分子结构。示出了20(S)_羟基胆固醇（20S)、氧固醇化 合物34、氧固醇化合物49和氧固醇化合物133的分子结构。氧固醇化合物34与20S的不 同之处在于在C6上具有额外的0H基团且C5和C6之间的双键被消除。氧固醇化合物49 具有与氧固醇化合物34类似的结构且在C25和C27之间包括双键。氧固醇化合物133与 氧固醇化合物34和49的不同在于缺少C27和侧链长度增加一个碳。
[0008] 图2显示碱性磷酸酶活性通过氧固醇的剂量依赖性活化。融合的（图2A) C3HT101/2细胞或（图2B)M2-10B4细胞用对照载体或0. 125-10yM氧固醇化合物133处 理。为直接与氧固醇化合物133比较，C3H细胞也用氧固醇化合物34和氧固醇化合物49 (图 2A)处理。4天后，碱性磷酸酶（ALP)活性在全细胞提取物中测量。代表性三个单独的实验 的数据报告为一式三份测定值的平均值土SD且归一化为蛋白质浓度。（对于用0. 25yM或 更高剂量的所有氧固醇处理的细胞vs.对照载体处理的细胞，p〈0. 0001)。
[0009] 图3显示氧固醇化合物133诱导成骨性分化。（图3A)融合的C3HT101/2细胞用 对照载体或2. 5yM氧固醇化合物133在成骨介质中处理。成骨基因Runx2、ALP、BSP、0SX 和0CN的表达在处理48小时（48h)、4、7和14天后通过定量实时PCR测量。代表性实验的 结果报告为一式三份测定值的平均值土SD。（在所有时间点对于ALP、BSP和0SX和在4、7 和14天对于Runx2和0CN，对于对照vs.氧固醇化合物133，p〈0. 005)。（图3B)C3H10Tl/2 细胞用对照载体或2. 5yM氧固醇化合物133处理3周。为检测细胞外矿化，进行vonKossa 染色，且矿化基质在光学显微镜（10X)下显示深黑染色。（图3C)在与（B)中描述的那些平 行的培养物中，矿化使用45Ca掺入测试定量（对于对照vs.所有浓度的氧固醇化合物133， p〈0.005)。（图3D)原代人MSC在成骨介质中用对照载体或5yM氧固醇化合物133处理 4周。成骨基因0SX、BSP和0CN的表达通过定量实时PCR测量。代表性实验的结果报告为 一式三份测定值的平均值土SD(在对照vs.氧固醇化合物133处理的细胞中对于所有基因 p〈0. 05)。（图3E)原代人MSC在成骨介质中用对照载体或0. 5、1和5yM氧固醇化合物133 处理5周。为检测细胞外矿化，进行vonKossa染色且矿化基质在光学显微镜（10X)下显 示深黑染色。
[0010] 图4显示hedgehog途径在氧固醇化合物133-诱导的成骨性分化中的作用。（图 4A)C3H10Tl/2融合的细胞在成骨介质中用对照载体或氧固醇化合物133在存在或不存在 4yM环杷明（cyclopamine，Cyc)的情况下处理。4天后的ALP活性，和7天后成骨基因ALP、 BSP和0SX的表达通过定量实时PCR测量（对于ALP活性和所有所示基因的表达，对于对照 vs.氧固醇化合物133,以及对于氧固醇化合物133vs.氧固醇化合物133+Cyc，p〈0. 001)。 (图4B)C3H10Tl/2细胞用对照质粒（pGL3b)或包含8X-Gli荧光素酶报告物的质粒转染，且 用对照载体或氧固醇化合物133处理，且荧光素酶活性在48小时后测定。代表性实验的结 果报告为一式三份测定值的平均值土SD。（对于对照vs. 100nM、250nM的氧固醇化合物133 以及1yM氧固醇化合物133,p〈0. 001)。（图4C)在不包含竞争剂或包含50yM游离竞争 剂固醇（20S，氧固醇化合物133或氧固醇化合物16)的样品中比较被20S珠或对照珠捕获 的YFP-Smo的量。被珠捕获的YFP-Smo通过蛋白质印迹（上部）测量且与没有竞争剂的结 合反应中捕获的量对比绘图（下部）。
[0011] 图5显示通过BMP2和氧固醇化合物133形成的融合块的平片放射性照片。显示 了手术8周后指示组的两个代表性动物的Faxitron图像。箭头（Arrowheads)表示缺少骨 形成；箭体（arrows)表示骨形成。组1(对照）；没有骨形成的横突间空间。组II(BMP2); 桥接骨量和在L4 -L5的双侧融合。组III(氧固醇化合物133, 20mg);桥接骨量和在L4 -L5的双侧融合。组IV(氧固醇化合物133, 2mg);在显示通过氧固醇化合物133诱导融合的 动物中的桥接骨量和在L4 -L5的双侧融合。
[0012] 图6显示通过BMP2和氧固醇化合物133形成的融合块的显微CT。显示了指示组 的两个代表性动物的显微CT。箭头表示缺少骨形成；箭体表示骨形成.组1(对照）；没有 骨形成的横突间空间。组II(BMP2);桥接横突间空间的骨量和在L4-L5的双侧融合。组 III(氧固醇化合物133, 20mg);桥接横突间空间的骨量和在L4 -L5的双侧融合。组IV(氧 固醇化合物133, 2mg);在显示通过氧固醇化合物133诱导融合的动物中的桥接横突间空间 的骨量和在L4-L5的双侧融合。组V(氧固醇化合物133,0. 2mg);在右侧远端的箭体指示 从L5横突的少量的骨形成。
[0013] 图7显示氧固醇化合物133对脊柱融合的效果的组织学分析。（图7A)显示了各 组的两个单独的代表性动物的冠状组织学切片（10X)。组1(对照）在横突间空间（箭头） 没有显著的骨形成。组II(BMP2)证实在L4-L5(箭体）的桥接骨头，清楚证明形成融合块 的小梁骨和皮质骨。组111(氧固醇化合物133-20mg)和组IV(氧固醇化合物133,2mg) 试样证实在横突间空间（箭体）显著的骨形成，且小梁骨和皮质骨的形成与BMP2诱导的相 当。（图7B)源自组II(BMP2)和组III(氧固醇化合物133, 20mg)的两个动物的冠状组织 学切片证实，在BMP2处理的动物的融合块中有显著的脂肪细胞形成，且在源自氧固醇处理 的动物的融合块中有明显较少的脂肪细胞（箭体，放大率20X)。
[0014] 图8显示在（图8A)M2-10B4骨髓基质细胞，和在（图8B)C3H10Tl/2胚胎成纤维细 胞中，成骨性分化标记、碱性磷酸酶活性被氧固醇化合物133和氧固醇化合物149诱导。融 合的细胞用载体、氧固醇化合物133或氧固醇化合物149处理。4天后，碱性磷酸酶（ALP) 活性在全细胞提取物中测量。代表性的三个单独实验的数据报告为一式三份测定值的平均 值辛SD，且归一化为蛋白质浓度。
[0015] 图9显示氧固醇化合物133和氧固醇化合物149诱导成骨性分化和成骨性分化标 记基因的表达。融合的C3HT101/2细胞用载体、氧固醇化合物133或氧固醇化合物149在 成骨介质中处理。成骨基因Runx2(图9E)、ALP(图9A)、骨唾液蛋白质（BSP)(图9B)、锌指 结构转录因子（Osterix) (0SX)(图9C)和骨钙蛋白（0CN)(图9D)的表达在处理8天后通 过定量实时PCR测定。代表性实验的结果报告为一式三份测定值的平均值土SD。
[0016] 图10显示氧固醇化合物133和氧固醇化合物149诱导hedgehog途径信号传递。 融合的C3H10T1/2细胞在存在或不存在4yM环杷明（Cyc)下，在成骨介质中用对照载体、 氧固醇化合物133或氧固醇化合物149处理。72小时后hedgehog途径靶基因Glil(图 10A)、Ptchl(图10B)和HIP(图10C)的表达通过定量实时PCR测定。代表性实验的结果 报告为一式三份测定值的平均值土SD。
【发明内容】
[0017] 本
【发明者】在此描述和表征了一种分子（化合物），其为新鉴别的、特别有效的氧固 醇分子（氧固醇化合物133)和四环素-衍生的靶向骨的部分的混杂物。该混杂分子称为 氧固醇化合物149。由于其选择性和特异性递送至骨的能力，氧固醇化合物149特别适合于 全身递送至受试者，例如用于靶向骨质疏松。
[0018] 本
【发明者】在此首先鉴定了一种成骨的氧固醇，氧固醇化合物133,其非常适合于多 种临床用途，且描述了其在体外促进成骨性分化和在大鼠模型体内促进脊柱融合的能力。 在合成和测试的大量氧固醇类似物中，氧固醇化合物133出乎意料地特别有效且易于合 成。氧固醇化合物133诱导成骨标记Runx2、osterix(OSX)、碱性磷酸酶（ALP)、骨唾液蛋白 质（BSP)和骨钙蛋白（OCN)在C3H10T1/2小鼠胚胎成纤维细胞中的显著表达。氧固醇化合 物133-诱导的8X-Gli荧光素酶报道物的活化，其与Smoothened的直接结合，和氧固醇化 合物133-诱导的成骨作用被hedgehog(Hh)途径抑制剂环杷明的抑制作用，证实了Hh途径 在介导对氧固醇化合物133的成骨响应中的作用。此外，氧固醇化合物133诱导OSX、BSP 和0CN的表达且刺激原代人间质干细胞中稳健的矿化。在体内，在仅4周后在用氧固醇化 合物133处理的动物中在融合位点通过X-射线观察到双侧脊柱融合，且在8周后通过手动 评估、显微-CT和组织学证实，其具有与骨形态发生蛋白质-2 (BMP2)相等的功效。然而，不 像BMP2,氧固醇化合物133没有在融合块中诱导脂肪形成且导致更致密的骨形成，如被更 大的BV/TV比例和更小的小梁分离所证实。因此氧固醇化合物133可用于治疗会受益于骨 形成的局部刺激的疾病，包括例如，脊柱融合，骨折修复，骨再生/组织工程应用，增加下颁 骨密度以用于种植牙，骨质疏松等。
[0019] 本
【发明者】还证实氧固醇化合物133抑制多潜能MSC细胞的脂肪形成。因此氧固醇 化合物133可用于治疗以下疾病，例如，黄瘤形成、脂肪垫的局部累积和肥胖症。
[0020] 氧固醇化合物133的优点包括，例如，当与本
【发明者】研宄的其它成骨的氧固醇相 比时更方便合成和改善的融合时间。
[0021] 而且，本
【发明者】在此描述了一种修饰形式的氧固醇化合物133,其连接有作为靶向 骨的部分的四环素-衍生的分子。该混杂分子，称为氧固醇化合物149,选择性和特异地递 送至骨（选择性传递至（homesto)骨），这是由于其与祀向骨的试剂的连接。不希望被任 何具体理论束缚，据建议氧固醇化合物149选择性在骨中聚集且刺激间质干细胞经历成骨 性分化并制成新的骨，且这种成骨性分化的刺激是通过骨细胞中hedgehog信号传导的活 化介导的。无论其作用机理是什么，因为氧固醇化合物149是选择性和特异性递送至骨，因 此在全身递送至受试者后对于骨生成是有效的。全身递送的能力代表一种显著的优点，例 如用于治疗骨质疏松受试者。氧固醇化合物149为小分子成骨的氧固醇，其可作为下一代 的骨合成治疗剂的一员，以及治疗多种其它疾病的有用药物，包括将受益于Hh途径活性的 刺激的疾病。
[0022] 本发明的一个方面为化合物，称为氧固醇化合物149(Oxy149)，具有下式
[0023]
【权利要求】
1. 一种化合物，其为氧固醇化合物149,具有式I，
或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
2. 生物活性组合物，其包含该化合物氧固醇化合物149和药学上可接受的载体。
3. 权利要求2的生物活性组合物，其进一步包含至少一种另外的试剂，其选自甲状旁 腺激素、氟化钠、胰岛素样生长因子I(ILGF-I)、胰岛素样生长因子II(ILGF-II)、转化生长 因子0 (TGF-0)、细胞色素P450抑制剂、成骨前列腺素类、BMP2、BMP4、BMP7、BMP14和 抗再吸收剂。
4. 治疗患有骨病、骨质疏松或骨折的受试者的方法，包括向受试者给药有效量的权利 要求2的生物活性组合物。
5. 权利要求4所述的方法，包括向受试者以治疗有效剂量以有效剂型在所选的间隔给 药该生物活性组合物以增加骨量。
6. 权利要求4所述的方法，包括向受试者以治疗有效剂量以有效剂型在所选的间隔给 药该生物活性组合物以改善骨质疏松症状。
7. 治疗需要增加骨形态形成和/或骨质增生的受试者的方法，包括向受试者给药有效 量的权利要求2所述的组合物。
8. 治疗受试者以诱导骨形成的方法，包括以有效剂型在所选的间隔给药权利要求2所 述的组合物以增加骨量。
9. 诱导哺乳动物的间质干细胞的成骨细胞分化的方法，包括将该细胞与有效量的权利 要求2所述的组合物接触，其中该哺乳动物的间质干细胞为受试者的骨髓基质细胞。
10. 在受试者的细胞或组织中刺激hedgehog(Hh)途径介导的响应的方法，包括将该细 胞或组织与有效量的权利要求2的生物活性组合物接触，其中该Hh途径介导的响应为成骨 细胞分化、骨形态形成和/或骨质增生的刺激。
11. 治疗受试者以诱导骨形成的方法，包括： 收集哺乳动物的间质干细胞； 用权利要求2的生物活性组合物处理哺乳动物间质细胞以诱导该细胞的成骨细胞分 化；和 将该分化的细胞给予受试者。
12. 权利要求4-10任一项所述的方法，其中将该生物活性组合物局部给予受试者的细 胞、组织或器官。
13. 权利要求4-10任一项所述的方法，其中将该生物活性组合物全身给予受试者。
14. 刺激哺乳动物中的哺乳动物细胞以使成骨细胞分化的生物标记表达水平大于未处 理的细胞中的生物标记水平的方法，包括将哺乳动物细胞暴露于有效量的权利要求1所述 的化合物。
15. 权利要求14所述的方法，其中所述生物标记为碱性磷酸酶活性、钙掺入、矿化和/ 或骨钙蛋白mRNA的表达。
16. 权利要求14所述的方法，其中该哺乳动物细胞为间质干细胞、骨原细胞或颜盖损 伤、破裂或缺陷中的细胞。
17. 用于人或动物体的植入物，其包含具有表面的基材，其中该植入物的表面或内部包 含足以在周围骨组织诱导骨形成的量的权利要求2的生物活性组合物。
18. 权利要求17所述的植入物，其中所述基材形成针、螺杆、板或人工关节的形状。
【文档编号】A61K31/575GK104507951SQ201380033489
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年5月7日
【发明者】F.帕哈米, M.E.琼格, F.斯塔彭贝克, 小威廉.M.皮尔斯, K.G.泰勒, K.E.默滕 申请人:加利福尼亚大学董事会, 路易斯维尔大学研究基金会公司