适用于治疗血友病的药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及适用于治疗血友病的药物组合物。
【专利说明】适用于治疗血友病的药物组合物 技术背景
[0001] 本发明涉及血友病的治疗和/或预防。
[0002] 背景 经静脉内给予凝血因子的蛋白质替代疗法目前用于治疗血友病患者。对于患者的方便 性和依从性而言，血管外（例如，皮下（s.c.)或皮内）给药优于现有的静脉内（i.V.)注射。 血管外给予还具有潜在的安全性优势，因为许多患者能够避免静脉内端口手术以及这类导 管插入相关的感染和凝血风险。
[0003] 在FVIII缺乏的小鼠中经皮下给予FVIII，公开于Shi等人，Haemophilia, 2012， DOI:10. 1111/j. 1365-2516. 2011. 02735.X。FVIII的生物利用度在此文中据报告为低（大 约 1%)。
[0004] 经皮下给予FVIII和VWF另外公开于W008151817,但未公开FVIII剂量和所达到 的循环FVIII浓度间的剂量反应关系。在W0815817中，VWF与FVIII的（单位）比率大于 5:1，相当于VWF蛋白浓度比FVIII浓度有150-250倍摩尔过量。然而，从实践和经济上的 观点看，这种类型的比例并不理想。在W008151817中，进一步证明了当将FVIII与VWF共 同配制时，经皮下给予FVIII的小鼠的免疫原性明显降低。
[0005] 在W010062768中，公开了FVIII的聚乙二醇化可以改进经皮下注射给小鼠的 FVIII的生物利用度，而与VWF共同配制却没有改进FVIII的生物利用度。
[0006] 本领域需要这样的化合物和/或药物组合物：其适用于经血管外给予，以在有或 无抑制剂时治疗和/或预防患有凝血疾病例如A型血友病的患者，和/或治疗和/或预防 患有冯维勒布兰德氏病的患者，因为这样的给予形式将会减轻经静脉内治疗的负担，这两 者的静脉内治疗都同样涉及到输注并且也涉及到因植入便携式导管所致的感染风险。这样 的化合物和组合物优选是安全的（即具有低的免疫原性风险）和/或具有高生物利用度和 /或优选是在生产和配制过程中容易处理的。
[0007] 概述 本发明涉及包含FVIII分子的药物组合物在治疗血友病中的用途，其中所述FVIII分 子包含长度为100-700个氨基酸的截短的B结构域，其中所述截短的B结构域的氨基酸序 列源自wtFVIIIB结构域氨基酸序列，和其中所述FVIII分子经血管外给予的生物利用度 为至少20%。
[0008] 描述 本发明人惊奇地发现了以下观察结果：与例如具有整个B结构域完整的FVIII以及没 有或仅有少数氨基酸（例如，15-30个氨基酸）的B结构域截短/缺失的FVIII分子相比， 本发明的FVIII分子在经皮下给予时具有令人惊奇的高FVIII生物利用度。
[0009] 本发明的发明人还惊奇地发现了以下观察结果：当与VWF或VWF片段共同给予时 可以改善本发明的FVIII分子经皮下的生物利用度。优选地，VWF应当呈VWF片段的形式， 其包含TIL'结构域和任选地包含C1099和/或Cl142半胱氨酸的氨基酸取代，以减少多聚 体的形成。
[0010] 附图简述 图1 :在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7. 7倍摩尔剂量的VWFTIL' /E' /D3/A1 时，在皮下给予10000U/kg"N8-GP"后，血浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来自 n=2FVIIIKO小鼠的测量的平均值和标准差。"N8-GP"是如W02009108806的实施例1+2 所述而制备的糖-聚乙二醇化FVIII分子。
[0011] 图2 :在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7. 7倍摩尔剂量的VWFTIL'/E'/D3/ Al时，在皮下给予10000U/kgN8-GP后，血浆中的FVIII抗原。数据是在每一时间点来自 n=2FVIIIKO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0012] 图3 :在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7. 7倍摩尔剂量的VWFTIL' /E' / D3/A1时，在皮下给予2500U/kgN8-GP后，血浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来 自n=2FVIIIKO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0013] 图4 :在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7. 7倍摩尔剂量的VWFTIL' /E' / D3/A1时，在皮下给予2500U/kgN8-GP后，血浆中的FVIII抗原。数据是在每一时间点来 自n=2FVIIIKO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0014] 图5 :在有或无共同给予相对于FVIII而言的7. 7倍摩尔剂量的VWFTIL' /E' / D3/A1 时，在皮下分别给予 5000 或 20000IU/kgwtFVIII(N8,turoctocogalfa)后，血 浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来自n=2FVIIIKO小鼠的测量的平均值和标准 差。"N8"/"turocotogalfa"是如W02009108806的实施例1中所述而制备的B结构域截 短的FVIII分子。
[0015] 图6 :在有或无共同给予相对于FVIII而言的7. 7倍摩尔剂量的VWFTIL' /E' / D3/A1 时，在皮下给予 5000 或 20000IU/kgwtFVIII(N8,turoctocogalfa)后，血浆中 的FVIII抗原。数据是在每一时间点来自n=2FVIIIKO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0016] 图7 :在有或无共同给予相对于FVIII而言的7. 7倍摩尔剂量的VWFTIL' /E' / D3/A1 时，在皮下给予 5000IU/kgFVIII(N8,turoctocogalfa)后，血浆中的FVIII抗 原。数据是在每一时间点来自n=2FVIIIKO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0017] 图8:在有或无共同给予相对于FVIII而言的7. 7倍摩尔剂量的VWFTIL' /E'/ D3/A1 时，在皮下给予 5000IU/kgFVIII(N8,turoctocogalfa)后，血浆中的FVIII活 性。数据是在每一时间点来自n=2FVIIIKO小鼠的测量的平均值和标准差。
[0018] 图 9 :在 20T与FVIII(N8,turoctocogalfa)结合的VWF片段（764-865SEQ IDNO5)。上图面显示每次滴定后释放热量的原始数据。下图面显示得自积分原始数据的 结合等温线。数据分析表明VWF片段（SEQIDNO5)在放热反应中与FVIII结合，其化学 计量学为 1. 14,ΛH为-5. 82kcal/mole，ΛS为 9. 8cal/mol/deg和Kd 为 0· 33μΜ。"F8/ N8/turoctocogalfa"是如W02009108806的实施例1中所公开而制备的B结构域截短的 FVIII分子。
[0019] 图10 :经皮下给予的N8-GP在体内能有效止血。左图面显示在尾巴横切前24小 时经皮下N8-GP或溶媒治疗，或在尾巴横切前5分钟经静脉内治疗的FVIIIK0小鼠中的血 液损失。N8-GP"是如W02009108806的实施例1+2中所述而制备的糖-聚乙二醇化FVIII 分子。右图面显示在来自小鼠离体全血中的凝血时间，使用R0TEM。
[0020] 图 11 :在 25°C，FVIII、TIL，/E，/D3/A1III、以及FVIII和TIL，/E，/D3/A1III 的混合物在155mMNaCl、10mM乙酸钙、10 %异丙醇中的SEC-UV(280nm)色谱图。
[0021] 图 12 :在 25°C，FVIII、TIL' /E' /D3II、以及FVIII和TIL' /E' /D3II的混合物 在155mMNaCl、10mM乙酸钙、10%异丙醇中的SEC-UV(280nm)色谱图。
[0022] 定义 本文使用的术语"治这"指任何有需要的人或其他脊椎动物受试者的医学治疗。预期 所述受试者已经历医生或兽医进行的身体检查，医生或兽医已给出试验性或明确的诊断， 表明使用所述特定治疗对治疗所述人或其他脊椎动物的疾病有益。根据受试者健康状况， 所述治疗的时机和目的可因个体的不同而异。因此，所述治疗可以是预防性的、缓和性的、 对症的和/或治愈性的。
[0023]给药方式:本发明的化合物和药物组合物可经胃肠外给予，例如，经静脉内或血管 外（例如，皮内、肌内、皮下等）给予。本发明的化合物和药物组合物可以是预防性和/或 治疗性地给予和/或按需要给予。根据本发明，血管外给予本发明的化合物/药物组合物 具有若干优势。血管外给予对所有患者的可能益处、尤其是对儿童和小婴儿的特定益处是， 更容易、简单，更少疼痛，更少麻烦和并发症（并因此可能带来较好的依从性）。有可能避免 导管手术并且有可能使用更方便的药盒和装置，用于使用血管外给药途径来给予产品。
[0024]联合治疗/共同给予：可以以许多不同方式完成两种或更多种活件化合物(例如， 本发明的FVIII分子和具有与FVIII结合能力的VWF(例如，VWF片段））的联合给予。在 一个实施方案中，两种活性化合物可以在单个组合物中一起给予。在另一个实施方案中，两 种活性化合物可以在单独组合物中给予，作为联合治疗的组成部分。例如，第一种化合物可 以在第二种化合物之前、之后或同时给予。在FVIII和VWF作为两种单独的药物组合物经 血管外（例如，皮下）给予的情况下，它们优选地是靠近地给予，以便得益于这两种类型的 化合物同时给予时所获得的改进的生物利用度（即注射部位应当间隔不超过5cm、优选地 不超过4cm、优选地不超过3cm、优选地不超过2cm和最优选地不超过Icm)。两种化合 物还应当优选地在大约1小时内、优选大约30分钟内、优选大约15分钟内、和最优选地大 约5分钟内注射。
[0025]因子VIII:因子VIII(FVIII)是主要由肝细胞产生的大的复杂糖蛋白。人 FVIII的序列编码2351个氨基酸，包括信号肽，并包含若干个不同的结构域，如通过同源性 所限定。有3个A-结构域、1个唯一的B-结构域和2个C-结构域。结构域顺序可列为 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。通过二价金属离子结合将链连接在一起。A1-A2-B链命名为 重链（HC)，而A3-C1-C2命名为轻链（LC)。Al(al区）和A2 (a2区）的小的酸性区C-末 端和A3结构域的N-末端（a3区）在其与其它凝血蛋白质的相互作用中起到重要作用，所 述其它凝血蛋白质包括凝血酶和冯维勒布兰德因子（vonWillebrandtFactor) (VWF)， FVIII的载体蛋白。
[0026] 内源VIII分子以具有不同尺寸的B-结构域的分子库（最短的具有在位置740的 C-末端，即在A2-a2的C-末端，并因此不含B结构域）在体内循环。这些具有不同长度的 B结构域的FVIII分子都具有全部促凝血活性。一旦用凝血酶活化，在位置372的Al-al的 C-末端、在位置740的A2-a2的C-末端、和在位置1689的介于a3和A3之间切割FVIII， 后一切割释放a3区，同时失去对VWF的亲和力。活化的FVIII分子称为FVIIIa。活化允许 FVIIIa与磷脂表面样活化的血小板和活化的因子IX(FIXa)相互作用，即形成tenase复合 物，允许有效活化因子X(FX)。
[0027] 术语"因子VIII(a) "和"FVIII(a) "包括FVIII和FVIIIa两者。同样，术语"因子 VIII"和"FVIII"可包括FVIII和FVIIIa两者。本文使用的"因子VIII"或"FVIII"是指 作为内在凝血途径的成员并对血液凝固必需的人血浆糖蛋白。"野生型（wt)/天然FVIII" 是源自如SEQIDNO:1 (氨基酸1-2332)所示的全长序列的人FVIII分子。"FVIII(a)"包 括可以在个体之间存在并出现的FVIII(a)的天然等位变体。本发明的FVIII分子优选是 经重组产生的，使用众所周知的生产和纯化方法。糖基化、酪氨酸硫酸化和其它翻译后修饰 的程度和位置可以随所选择的宿主细胞及其生长环境的不同而变。
[0028] 本发明的药物组合物可包含这样的B结构域-截短的FVIII分子：其中剩余结构 域接近相当于如SEQIDNO:3的氨基酸编号1-740和1649-2332所示的序列。在这类分子 中，可以引入突变。可将氨基酸修饰例如取代、插入和缺失引入分子中，以便修饰FVIII与 多种其他组分的结合能力，所述多种其他组分例如低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP)和相 关受体、多种其他受体、其他凝血因子、细胞表面、糖基化位点的引入和/或取消等。不取消 FVIII活性的其它突变也可在本文的FVIII分子中提供。
[0029] 本发明的FVIII分子（分子/变体/衍生物/类似物/缀合物）在凝血级联中能 够起作用，其方式在功能上类似于或等同于wt/内源FVIII，导致FXa的形成（经由与活化 血小板上的FIXa相互作用）和支持血凝块的形成。可使用本领域众所周知的技术，在体外 评价FVIII活性。凝血分析、FX活化测定法（通常称为显色测定法）、凝血酶产生测定法和 全血血栓-弹性成像是这类体外技术的实例。本发明的FVIII分子具有的FVIII活性是天 然人FVIII的至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少 大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、100%或甚至超过100%。
[0030] 将内源全长FVIII合成为单链前体分子。在分泌之前，将前体切割为重链和轻链。 可从两种不同的策略产生重组B结构域缺失或截短的FVIII。将无B-结构域的重链和轻链 单独合成为两条不同的多肽链（两条链策略），或将B-结构域缺失或截短的FVIII合成为 单一前体多肽链（单条链策略），其以与全长FVIII前体相同的方式被切割为重链和轻链。
[0031] 在经单条链策略产生的B结构域缺失或截短的FVIII前体多肽中，通常通过接头 分开重链和轻链部分。为了使在本发明的B结构域缺失/截短的FVIII中导入免疫原性表 位的风险最小化，接头的序列优选来源于FVIIIB结构域。在全长FVIII的B结构域中，氨 基酸1644-1648组成该识别位点。在B结构域缺失的FVIII活化时导致接头移除的凝血酶 切割位点位于重链中。因此，接头的尺寸和氨基酸序列不太可能影响通过凝血酶活化将其 从残余FVIII分子中移除。B结构域的缺失/截短对于产生FVIII是有利的。然而，可在接 头中包含部分B结构域而不降低生产能力。B结构域对生产能力的负面效应不能归因于B 结构域的任何特定尺寸或序列。
[0032]SEQIDNO:1:wt人FVIII(Ser750 残基以黑体显示） ATRRYYLGAVELSffDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLL GPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMAS DPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASAR AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDL GQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPK TWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEV ⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYS SFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQAS NIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLW ILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNIODYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHP§_TRQKQFNATTIPEND IEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLH HSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDT TLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSIS LLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKN MEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKV VVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNL FLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQ NFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIP QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQRE VGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKff NEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAA INEGQNKPEIEVTffAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPR SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAE VEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDL EKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHA INGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWR VECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVD LLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRL HPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKE WLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRY LRlHPQSffVHQIALRMEVLGCEAQDLY FVIII的B结构域跨越SEQIDNO:1的氨基酸741-1648。B-结构域在若干不同位点上 被切割，在循环的血浆FVIII分子中产生大的异质性。高度糖基化的B-结构域的确切功能 未知。所知道的是B结构域在凝血级联中对FVIII活性是非必要的。因此经常以B结构域 缺失/截短的变体形式产生重组FVIII。例如，可由表达载体产生FVIII分子，所述载体编码 具有以下序列的21个氨基酸残基L(接头）序列：SEQIDNO2:SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (0-聚糖连接到下划线的S)。优选的本发明的FVIII分子是B结构域缺失/截短的变体， 其包含连接到SEQIDNO1中的Ser750残基的0-聚糖，任选经由该0-聚糖缀合到聚合 物（半寿期延长）部分上。
[0033]本发明的发明人惊奇地发现了以下观察结果：与例如具有整个B结构域完整的FVIII以及没有或仅有少数氨基酸（例如，15-30个氨基酸）完整的FVIII分子相比，本发 明的具有以下长度的B结构域的B结构域缺失/截短的FVIII分子当经血管外（例如皮 下）给予时，具有惊人高的生物利用度：大约100至大约700个氨基酸（（优选150-650、 更优选150-600、更优选150-550、更优选150-500、更优选150-450、更优选150-400、更 优选150-350、更优选200-700、更优选200-600、更优选200-500、更优选200-400、更优 选200-300、和最优选大约200-250)。这样的分子可以包含或可以不包含SEQIDNO1的 Ser750残基。因此提供了在皮下/皮内给予后具有改善的生物利用度的FVIII的简单而安 全的生产方式。通过将所述分子与半寿期延长部分缀合/融合可延长本发明的FVIII分子 的体内循环半寿期是似乎合理的。本发明的包含226个氨基酸的B结构域的FVIII分子的 实例见SEQIDNO3 : SEQIDNO3 : (226个氨基酸的B结构域分子）： ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLL GPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMAS DPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASAR AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDL GQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPK TWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEV ⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYS SFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQAS NIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLW ILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNIODYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPEND IEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLH HSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDT TLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSHHHHHHSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEE IDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEF TDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTY FWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFT ENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKE EYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQW APKLARLHYSGSINAffSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTL MVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMF ATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQffTLFFQN GKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY 表a:本发明的FVIII分子的B结构域的实例。His-标签是任选的并在化合物纯化/ 分离后可被移除。
【权利要求】
1. 包含FVIII分子的药物组合物在治疗血友病中的用途，其中所述FVIII分子包含长 度为100-400个氨基酸的截短的B结构域，其中所述截短的B结构域的氨基酸序列源自wt FVIII B结构域氨基酸序列，和其中所述FVIII分子经皮下给予的生物利用度为至少10%。
2. 权利要求1的FVIII分子，其中所述B结构域包含连接到SEQ ID NO 1中的Ser 750 氨基酸残基的〇-聚糖。
3. 前述权利要求中任一项的FVIII分子，其中所述FVIII分子的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4. 权利要求1的FVIII分子，其中所述FVIII B结构域的氨基酸序列选自：氨基酸 741-857 + 1637-1648;氨基酸 741-914 + 1637-1648;氨基酸 741-954 + 1637-1648;氨基 酸 741-965 + 1637-1648;氨基酸 741-965 + 1637-1648;氨基酸 741-1003 + 1637-1648; 氨基酸 741-1003 + 1637-1648;氨基酸 741-1020 + 1637-1648;氨基酸 741-1079 + 1637-1648;氨基酸 741-1206 + 1637-1648;氨基酸 741-1261 + 1637-1648;氨基酸 741-1309 + 1637-1648;氨基酸 741-914 + 1637-1648;氨基酸 741-954 + 1637-1648; 氨基酸 741-968 + 1637-1648;氨基酸 741-1003 + 1637-1648;氨基酸 741-1018 + 1637-1648;氨基酸 741-1070 + 1637-1648;氨基酸 741-1230 + 1637-1648;氨基酸 741-1301 + 1637-1648 ;氨基酸 741-965 + 1637-1648 ;氨基酸 741-965 + 1637-1648 ;氨 基酸 741-965 + 1637-1648;和氨基酸 741-965 + 1637-1648。
5. 前述权利要求中任一项的FVIII分子，其中至少一个半寿期延长部分与所述FVIII 分子共价连接。
6. 前述权利要求中任一项的FVIII分子，其中至少一个水溶性聚合物与B结构域中存 在的聚糖共价连接。
7. 权利要求5-6中任一项的的FVIII分子，其中所述水溶性聚合物选自：PEG和多糖。
8. 前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含VWF或VWF片 段。
9. 权利要求8的药物组合物，其中所述VWF片段包含至多1200个氨基酸，和其中所述 VWF片段包含TIL'结构域。
10. 权利要求8-9中任一项的药物组合物，其中所述VWF片段不含1099和/或C1142 半胱氨酸。
11. 权利要求8-10中任一项的药物组合物，其中小于5%的所述VWF片段呈寡聚物和 /或多聚体形式。
12. 权利要求8-10中任一项的药物组合物，其中所述VWF片段是二聚体。
13. 权利要求8-12中任一项的药物组合物，其中所述VWF片段的氨基酸序列选自：SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 5,SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 7,SEQ ID NO 8,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20 和 SEQ ID NO 21。
14. 权利要求8-13中任一项的药物组合物，其中FVIII和VWF的比例为1:1。
15. 前述权利要求中任一项的药物制剂，其中FVIII浓度为至少500 IU/ml。
16. 前述权利要求中任一项的药物制剂，其中与VWF片段结合的FVIII的量占所述制 齐[J中的FVIII总量的至少70%。
17. 前述权利要求中任一项的药物组合物在经皮下给予用于治疗血友病中的用途。
18. 权利要求17的药物组合物在经血管外给予用于治疗冯维勒布兰德氏病中的用 途。
【文档编号】A61K38/37GK104411323SQ201380033402
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2012年4月24日
【发明者】G.博特, D.M.卡普特, F.罗德, J.哈亚宁, K.罗伊普斯托夫, L.蒂姆, M.佩特森, M.克贾科, O.维斯特奧森, P.里斯拜诺拜, J.J.汉森 申请人:诺和诺德A/S（股份有限公司）