获自酿造过程产生的生物质的脂肪粘结剂的制作方法

获自酿造过程产生的生物质的脂肪粘结剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供富含多糖的组合物，所述组合物包含提取自来自酿造过程产生的副产物生物质的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞壁的β-葡聚糖、壳多糖和脱乙酰壳多糖，用于获得该组合物的方法及其用途。所述组合物发挥选择性的脂肪结合作用等生物学功能，因此其可以用于预防和/或治疗疾病如超重、肥胖症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高血压和心血管疾病。其可以被配制成可食用、药物或兽医产品。
【专利说明】获自酿造过程产生的生物质的脂肪粘结剂

【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学和营养学领域，并且尤其涉及用于重量控制和减少心血管负脂肪 的饮食补充物。

【背景技术】
[0002] 我们社会的不良饮食习惯和生活方式已经导致日益增加的公众健康问题。在目前 根据推荐的每日饮食摄入的金字塔的分解内，发现最关键的点在于过度消耗饱和脂肪酸和 胆固醇。推荐的是关于能量摄入的7%的饱和脂肪酸和< 250mg/天的胆固醇，而现实分别 达到15%和350mg/天的值。能量摄入过度主要是由于过度消耗饱和脂肪所致，同时过度摄 入胆固醇是由过度消耗动物产品导致的。
[0003] 所有流行病学研究都承认过度放纵消耗富含脂肪的食物并且减少通过物理活动 的能量支出导致多种流行的健康障碍，超重/肥胖症和高胆固醇血症被看作是最严重的。 除了有损生活质量以外，超重和肥胖症已与作为严重的不良健康状况的致病因素联系在一 起，所述不良健康状况包括心血管疾病、2型糖尿病、肌肉骨骼问题以及癌症。另一方面，据 信导致动脉粥样硬化（atherosclerosis)的高胆固醇血症（hypercholesterolemia)是作 为发达国家中的主要死亡原因的冠心病的主要风险因素。
[0004] 综上，可有助于降低体重和降低胆固醇的非处方降脂剂正被日益探寻。作为结果， 不管其变化的且不总是被完全证实的有效性如何，多种非处方降脂饮食补充物被推向市 场。其中，以胶囊和片剂形式可获得的脱乙酰壳多糖（壳聚糖，Chitosan)被宣称能够降低 胆固醇并且导致快速的减重。
[0005] 脱乙酰壳多糖是来源于壳多糖（几丁质，chitin)的多氨基糖。壳多糖，自然界 中最丰富的可再生有机资源之一，主要存在于甲壳类的外骨骼中，在化学上是一种由利用 β - (1-4)-糖苷键连接的N-乙酰-D-葡糖胺单元和D-葡糖胺单元组成的线性聚合物，其 中N-乙酰-D-葡糖胺单元在该聚合物链中占优势。壳多糖的脱乙酰形式被称为脱乙酰壳 多糖。壳多糖通常是指具有超过40%的乙酰化程度[S卩，N-乙酰-D-葡糖胺的数量超过 40%而D-葡糖胺的数量小于60% ]并且不溶于稀酸的共聚物。名称脱乙酰壳多糖被用于 在大多数情况中可溶于稀酸的具有低于40% DA[ S卩，超过60% DD (脱乙酰化程度），N-乙 酰-D-葡糖胺的数量小于40%而D-葡糖胺的数量超过60%]的共聚物。壳多糖和脱乙酰 壳多糖在化学上可以被认为是纤维素的类似物，其中碳-2处的羟基分别被乙酰胺基和氨 基替代。脱乙酰壳多糖具有独特的化学和生物学性质，这可归因于在其分子中多个氨基基 团的存在。这可以被用于各种过程（包括医学治疗），并且脱乙酰壳多糖的优异的生物相容 性和生理学惰性使得这些是可能的。
[0006] 在许多水生生物（虾和蟹的壳以及鱿鱼和乌贼的骨板）中，在许多昆虫中，在陆生 甲壳类（卷甲虫（Armadillidium vulgare)、平甲鼠妇（Porcellio scaber))中，在线虫中， 在蘑菇中以及在一些微生物（酵母、真菌和藻类）中，发现作为支撑物质的壳多糖和脱乙酰 壳多糖。基于干重，水生贝壳含有约30-40%蛋白质，30-50%碳酸钙，和20-30%壳多糖。这 些份额随甲壳类种类和季节而不同。传统上，壳多糖通过对蟹或虾壳进行脱钙和除蛋白来 制备，这分别涉及利用酸溶液溶解碳酸钙以及在碱性介质中或利用酶除去蛋白质。然后可 以通过利用热的碱溶液对壳多糖进行脱乙酰化以及脱色步骤来获得脱乙酰壳多糖。该脱乙 酰壳多糖制备方法具有多种不利的特性。例如，该方法需要昂贵的热能和具有潜在健康危 害的苛性碱。该方法还产生大量的废物，由此使得需要大量处理费用。此外，虾或蟹壳的供 应高度依赖于季节和环境因素，这导致对生产能力的不可预知的限制并且导致要被用于医 药和农业用途的终产物的理化性质不一致。此外，来自虾壳的脱乙酰壳多糖可能在最终的 产品中存在抗原，其可能导致消耗者的变应性。因此，虽然脱乙酰壳多糖在临床上已被很好 的耐受，但是其不能被推荐给对甲壳类敏感的人。这些问题可通过自不同来源提取脱乙酰 壳多糖来规避。
[0007] 现今，研究聚焦于自真菌细胞壁组分提取纯的脱乙酰壳多糖。为此，N. Nwe等研究 了真菌细胞壁中脱乙酰壳多糖和葡聚糖之间的键以开发用于以高产率自真菌Gongroella butleri制备非常纯的脱乙酰壳多糖的酶方法（N.Nwe等2010，"Production of fungal chitosan by enzymatic method and applications in plant tissue culture and tissue engineering ：eleven years of our progress, present situation and future prospects(通过酶方法制备真菌脱乙酰壳多糖以及植物组织培养和组织工程中的应用： 我们i 年的进展、目前形式以及将来前景）" Biopolymers，Magdy Elnashar编辑，出版： 2010年9月28日，第7章第135-162页）。
[0008] EP 1483299描述了这样的方法，所述方法允许以受控的方式在壳多糖链不降解 或转化的情况下将壳多糖与β-葡聚糖分离。该方法是基于用碱性溶液接触真菌黑曲霉 (Aspergillus niger)的细胞，用酸性溶液接触碱不可溶性部分，由此获得包含所述细胞壁 衍生物的酸化的碱不可溶性部分的悬浮液，并且最终将其与β -葡聚糖酶接触从而获得壳 多糖产物，或将其与壳多糖脱乙酰酶接触从而获得脱乙酰壳多糖产物。
[0009] 脱乙酰壳多糖的一个应用是作为饮食降血脂补充物，其中由于人消化酶的有限水 解，脱乙酰壳多糖实际上完整地沿消化系统通过到达大肠，有效地充当膳食纤维。认为脱 乙酰壳多糖通过与脂肪酸和胆汁酸的阴离子羧酸根结合而减少自胃肠道的脂肪吸收，并且 通过利用疏水键结合中性脂质（即，胆固醇、其他留醇）干扰其乳化。已经在体内和体外 研究了脱乙酰壳多糖的降血脂潜力。体内研究包括在动物和人上进行的试验并且由多种 测定组成，主要有体重、血清脂质水平和粪便中的脂质浓度。明显地，报道的数据是矛盾 的。虽然动物试验大部分显示脱乙酰壳多糖对体重和胆固醇水平的降低作用（H. Yao等， "Effect of chitosan on plasma lipids, hepatic lipids, and fecal bile acid in hamsters human trials failed to show these effects (脱乙醜壳多糖对仓鼠中的血楽 脂质、肝脂质和粪便的胆汁酸的作用，人试验未显示这些作用）"J. Food Drug Anal. 2006， vol. 14,ρρ· 183-189)，人试验未显不这些作用（M.D. Gades等，"Chitosan supplementation and fat absorption in men and women(男人和女人中的脱乙酰壳多糖补充和脂肪吸 收）" J. Am. Diet. Assoc. 2005, vol. 105, PP. 72-77, C. N. Mhurchu 等，"Effect of chitosan on weight loss in overweight and obese individuals ：a systematic review of randomized controlled trials(在超重和肥胖个体中脱乙酰壳多糖对减重的作用：随机 化控制试验的系统综述）" 〇bes. Rev. 2005, vol. 6, PP. 35-42)。
[0010] 脱乙酰壳多糖补充物制剂是类似但不相同的。脱乙酰壳多糖自身是原料壳多糖 的化学脱乙酰化的产物，并且产物中脱乙酰化的程度随反应条件而变化。加工期间的一些 因素如脱乙酰化的程度和分子的分子量、壳多糖/脱乙酰壳多糖比、溶解度、离子强度、pH、 粒度和温度影响脱乙酰壳多糖的制备及其性质。可以预期脱乙酰壳多糖的效率取决于其 理化性质。然而，在脱乙酰壳多糖的结合能力和测量的理化性质之间尚未建立关联。这尤 其在以下的研究中指出，该研究报道了 11种所选择的脱乙酰壳多糖制剂的胆汁酸结合能 力、脂肪结合能力、溶胀能力、脱乙酰化程度和溶液粘度（K.Zhou等，"In vitro binding of bile acids and triglycerides by selected chitosan preparations and their physico-chemical properties (胆汁酸和甘油三酯通过所选择的脱乙酰壳多糖制剂的体 外结合及其理化性质）" Food Science and Technology 2006, vol. 39, PP. 1087-1092)。 toon] 基于脱乙酰壳多糖的补充物作为"油捕捉剂"和"油磁体"被销售。对这些补充物 中的一些的广告宣称可以给予消耗者不现实的预期。在其被宣称能够降低胆留醇并且导致 快速减重的同时，由于其同样捕获对人类健康有益的脂质系分子（如脂溶性维生素 A、D、E、 K、HDL胆固醇、植物留醇以及多不饱和脂肪酸如ω3和6脂肪酸）的能力所致，它们可能同 时导致抗营养作用。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明提供一种包含从来自酿造过程（酿造工艺，brewing process)产生的副产 物生物质的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的细胞壁提取的β-葡聚糖、壳多糖和 脱乙酰壳多糖的富含多糖的组合物（富多糖组合物，polysaccharide rich composition), 获得所述组合物的方法及其用途。因为本发明的组合物富含多糖（壳多糖、脱乙酰壳多糖 和β_葡聚糖），所以在本说明书中其被称为"富含多糖的组合物"。"所述组合物"、"所述 产品"和"本发明的组合物"也被无差别地用于指代本发明的组合物。
[0014] 因此，本发明的第一方面涉及一种用于获得富含多糖的组合物的方法，所述组合 物包含从来自酿造过程产生的副产物生物质的酿酒酵母的细胞壁提取的β-葡聚糖、壳多 糖和脱乙酰壳多糖，所述方法包括以下步骤：
[0015] i)在搅拌和50至95°C的温度下，准备具有浓度为0. 25至3Μ的NaOH溶液的反应 器；
[0016] ii)将所述酿造过程产生的生物质添加到所述溶液中；
[0017] iii)将所述条件保持至少1小时；
[0018] iv)冷却所述溶液直至室温，
[0019] V)通过至少一次添加酸性溶液或水来中和所述溶液，直至达到pH7,其中当进行 超过一次的添加时，在添加之间进行将固体产物从所述溶液中分离的步骤；
[0020] vi)将在步骤（V)中获得的固体产物从所述溶液中分离；
[0021] vii)当通过添加酸性溶液进行步骤（V)中的中和时，所述固体产物用水进行至少 一次洗涤并且分离所获得的固体产物；以及
[0022] viii)干燥所述固体产物直至恒重并微粉化。
[0023] 本发明的另一方面提供通过上述方法可获得的组合物。
[0024] 在人体发挥若干有益作用中，本发明的组合物可用作治疗剂或预防剂。因此， 本发明的另一方面涉及本发明的组合物用作预防剂和/或治疗剂。特别地，所述组合 物可以用于在动物（包括人）中预防和/或治疗选自由以下各项组成的组中的疾病： 超重（overweight)、肥胖症、高胆固醇血症（hypercholesterolemia)、高甘油三酯血症 (hypertriglyceridemia)、高血压和心血管疾病。本发明提供所述组合物在制备药物中的 用途，所述药物用于预防和/或治疗上述疾病。这可以被备选地表达为用于在动物（包括 人）中预防和/或治疗选自由超重、肥胖症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高血压和心血 管疾病组成的组中的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的所述动物施用有效量的本发 明的组合物。
[0025] 本发明的另一方面涉及本发明的组合物用作肠脂肪粘结剂（gut fat binder agent)〇
[0026] 在另一方面中，本发明的组合物可以用作解毒剂（detoxifying agent)。
[0027] 在另一方面中，本发明的组合物可以用作免疫刺激剂（immunoestimulant agent)〇
[0028] 本发明的另一方面涉及药物和/或兽医产品，所述药物和/或兽医产品包含有效 量的上述组合物以及适量的药用或兽医用赋形剂。术语"有效量"当在本文中使用时，是 指在医学判断范围内高到足以递送所需益处但是又低到足以避免严重副作用的活性剂的 量。
[0029] 本发明的另一方面涉及可食用产品（edible product)，所述可食用产品包含有效 量的本发明的组合物以及适量的其他可食用成分。
[0030] 发明详述
[0031] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的细胞壁可以占到细胞干质量的20至 30%。其主要由甘露糖蛋白和β-葡聚糖以及小量的壳多糖和脂质组成。这些组分的比例 可以根据菌株和培养条件而变化。如上所述，现有技术中存在从真菌细胞壁组分提取脱乙 酰壳多糖的方法。另一方面，现有技术也公开了自酵母（尤其是酿酒酵母）获得β-葡聚 糖的方法。WO 91/03495公开了用于制备可溶性葡聚糖以刺激血小板产生的方法。这些方 法之一以之前根据Jamas等US 4810646的方法过程自干燥的面包酵母（Baker' s yeast) 制备的整个葡聚糖颗粒开始，并且包括额外的步骤以溶解不溶性葡聚糖颗粒。描述于所述 专利申请的实施例2中的另一种方法涉及自所选的酿酒酵母菌株制备可溶性葡聚糖的一 系列处理。
[0032] 因此，虽然现有技术公开了自酵母获得（一方面）壳多糖/脱乙酰壳多糖和（另 一方面）β -葡聚糖的方法，但是自真菌菌丝体的最终提取产物的质量和数量取决于真菌 来源、其生长条件（发酵介质组成：碳源和浓度、氮源和浓度及金属离子及其浓度；以及发 酵条件：接种量、收获时间、发酵温度）；并且取决于提取过程的步骤。
[0033] 本发明提供用于获得富含多糖的组合物的工业方法。所述方法包括在之前的部 分说明的步骤。在搅拌和50和95°C的温度下，准备具有浓度为0. 25至3Μ的NaOH溶液的 反应器。在本发明特别的实施方案中，NaOH浓度选自0. 25,0. 50,0. 75，1.0，1. 1，1.2，1.3， 1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9, 2. 0, 2. 1，2. 2, 2. 3, 2. 4, 2. 5, 2. 6, 2. 7, 2. 8, 2. 9 和 3M。特别地， NaOH的浓度为0. 25至I. 5M。更特别地，NaOH的浓度为0. 25M。在另一个特别的实施方案 中，NaOH的浓度为1M。
[0034] 在本发明的另一个实施方案中，反应器中用NaOH溶液的处理在选自以下的温度 下进行：50,51，52,53,54,55,56,57,58,59,60,61，62,63,64,65,66,67,68,69,70,71，72， 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,80,81，82,83,84,85,86,87,88,89,90,91，92,93,94 和 95?。特别 地，温度为65至85°C，并且更特别地为80°C。
[0035] 在本发明的一个实施方案中，在冷却所述溶液（步骤（iv))后，通过加入酸性溶液 将其中和以达到pH 7并且将固体与溶液分离。特别地，酸性溶液是磷酸溶液、HCl溶液或 乙酸溶液。然后，用水对固体产物进行至少一次洗涤。在这些洗涤之间，将固体产物与溶液 分离。
[0036] 在本发明的另一个实施方案中，中和步骤通过至少一次添加水（特别是蒸馏水） 进行。当进行超过一次的添加时，在这些添加之间进行从溶液分离固体产物的步骤。当通 过添加水进行中和时，在中和之后不是必需要洗涤固体，但是如果需要更洁净的固体产物， 则可以进行洗涤。
[0037] 在本发明的特别的实施方案中，所述方法包括在中和前的一个步骤，所述步骤在 于在冷却后从溶液分离固体产物。分离例如通过离心进行。在工业规模，例如，批次2(或 第2批）在增加此步骤的情况下进行。
[0038] 在本发明的特别的实施方案中，酿造过程产生的生物质以1 : 2至1 : 5的量添 加到反应器。特别地所述量为1 : 3。这表示为湿生物质：NaOH溶液。如实施例中可见， 以此方式制备批次2-4,其中生物质的添加量为1 : 3(批次2和3)和1 : 2(批次4)。在 干燥的产物中表示，所述实施例中使用的量将分别是1 : 39和1 : 23。
[0039] 因此，可以将酿造过程产生的副产物生物质添加到反应器中，其中NaOH溶液直 接来自酿造过程。该生物质因为包含酿造过程的杂质所以是湿的（本文中称为"湿生物 质"）。
[0040] 也可以将干燥的酿造过程产生的副产物生物质添加到反应器中。因此，在另一个 实施方案中，所述方法还包括在向NaOH溶液中添加生物质前，对酿造过程产生的生物质进 行预处理。所述预处理包括以下步骤：（a)筛分生物质以便将酿酒酵母生物质与酿造过程 的杂质分离；(b)干燥步骤（a)中获得的酿酒酵母生物质；以及（c)研磨步骤（b)中获得的 酿酒酵母产物。在此情况中，向反应器添加的干燥的酿酒酵母产物的量为1 : 20至1 : 40 重量/体积。特别地，所述量为I : 30w/v。如在实施例中可见，在生物质的添加量为1 : 30 的情况下以此方式制备批次1。
[0041] 将反应器中的条件保持至少1小时。特别地，将条件保持5至20h，并且优选地保 持16h。在另一个实施方案中，所述反应需要IOh (见例如批次4)。
[0042] 将终产物干燥并最后微粉化。优选地，将所述产物放置在玻璃托盘中并且在真空 炉中在60°C干燥至恒重，然后微粉化。干燥可以在真空下进行以减少工艺时间。在特别的 实施方案中，干燥通过喷雾干燥产物进行直至溶剂含量低于5重量％。
[0043] 本发明涵盖本文所述的特定条件的所有可能的组合。以下实施例（批次1-4)显示 可以在不显著改变产物特性的情况下改变某些反应条件和方法步骤（如在实施例的第9. 4 点中可见的）。
[0044] 作为该方法的结果，获得包含酿酒酵母的细胞壁的葡聚糖、壳多糖和脱乙酰 壳多糖的组合物。在本发明的实施方案中，组合物中脱乙酰壳多糖、壳多糖和葡聚糖之 比为I : 10 : 80至1 : 20 : 150。在本发明的另一个实施方案中，所述组合物在pH 3. 5 在蒸馏水中的溶解度为650至800mg/l。在本发明的另一个实施方案中，组合物的碳、氢和 氮的原子质量百分比分别为36至44% (碳）、5· 5至7% (氢）和0· 2至0· 8% (氮）。
[0045] 在本发明的特别的实施方案中，以0. 25M的NaOH浓度，在80°C，在反应器中的干 燥的酿酒酵母产物的量为I : 30w/v下，在16h的反应时间期间，进行获得所述组合物的方 法。利用这些条件获得的组合物的化学性质描述于以下实施例的第2部分中。特别地，组合 物中脱乙酰壳多糖、壳多糖和β-葡聚糖之比为1 : 14 : 116;所述组合物在pH 3. 5在蒸 馏水中的溶解度为710mg/l ;并且组合物的碳、氢和氮的原子质量百分比分别为40. 32%、 6. 35%和 0· 24%。
[0046] 在本发明的特别的实施方案中，以0. 25M的NaOH浓度，在80°C，在反应器中的酿酒 酵母湿生物质的量为1 : 3下，在16h的反应时间期间，进行获得所述组合物的方法。在中 和步骤前，从冷却后的溶液分离产物。在特别的实施方案中，获得的产物具有在第9. 4部分 批次2中描述的性质。
[0047] 在本发明的特别的实施方案中，以0. 25M的NaOH浓度，在80°C，在反应器中的酿酒 酵母湿生物质的量为1 : 3下，在16h的反应时间期间，进行获得所述组合物的方法。在水 解后，通过添加酸性溶液直接中和混合物（没有首先离心反应混合物下）。在中和后，将混 合物离心然后洗涤。在特别的实施方案中，获得的产物具有第9. 4部分批次3中描述的性 质。
[0048] 在本发明的特别的实施方案中，以0. 32M的NaOH浓度，在80°C，在反应器中的酿酒 酵母湿生物质的量为1 : 2下，在IOh的反应时间期间，进行获得所述组合物的方法。在水 解后，通过添加酸性溶液直接中和混合物（没有首先离心反应混合物下）。在中和后，将混 合物离心然后洗涤。在特别的实施方案中，获得的产物具有第9. 4部分批次4中描述的性 质。
[0049] β -葡聚糖由于其激活免疫系统的能力而被称为生物学反应调节剂。此外，欧洲 食品安全局（European Food Safety Authority) (EFSA)以最新的科学观点推断在β-葡 聚糖的消耗和血液胆固醇浓度的降低之间可以建立因果关系。进行研究的食品成分是 β -葡聚糖，其是可溶性谷物纤维。关于重量控制，向EFSA提交的参考文件都没有证明 β -葡聚糖消耗对体重的作用，因此专家小组推断在β -葡聚糖消耗和正常体重的保持或 实现之间没有建立因果关系（Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to beta glucans and maintenance of normal blood cholesterol concentrations (ID 754,755,757,801,1465,2934)and maintenance or achievement of a normal body weight(ID 820,823)pursuant to Article 13(l)of Regulation(EC)(根 据规定（EC)的条款13(1)的对关于β葡聚糖和正常血液胆固醇浓度（ID754,755,757， 801，1465,2934)以及正常体重的保持或实现（ID 820,823)的健康宣称的证明的科学意 见）No 1924/2006EFSA Journal 2009 ;vol. 7 (9)ρρ·1254[18ρρ·])。
[0050] 出乎意料地，基于来自酿造过程的酿酒酵母生物质的β -葡聚糖和壳多糖/脱乙 酰壳多糖的混合物的本发明的组合物在人临床试验中显示出特异的降脂作用以及减重作 用和腰围减小。
[0051] 以下工作实施例证明本发明的组合物涉及在改善摄入的脂质特征（profile)的能 力方面的显著提高。在本发明的特别的实施方案中，所述组合物具有是其重量至少10倍的 脂肪结合能力，这是通过由以下组成的测定确定的：i)在37°C以及恒定搅拌下将棉籽油与 组合物在酸性溶液中接触两个小时；ii)将溶液离心以便将与组合物结合的棉籽油与存在 于上清中的未结合的棉籽油分离；iii)将上清与己烷混合并且对混合物进行离心；和iv) 回收经离心的混合物的上部相，允许己烷蒸发，并且对未结合的棉籽油进行称重。该测定还 在实施例的第3部分中详细说明。
[0052] 以下工作实施例还证明，与用作对照组的市售的类似脂肪粘结剂产品相比，用本 发明的产品饲喂的动物显示较少的重量增加。能量效率（g体重增加/kcal摄取的饲料） 是这样的值，其清楚地显示产品在降低吸收方面的效力。在此情况中，与对照相比，本发明 的产品降低作为总饲料效率测量的总脂肪吸收。本发明的产品的消耗在动物中不显示明显 的粪便排泄的增加。在市售产品（Chitosan S)的组中不是这样。Chitosan S产品达到排 泄和干物质的极高值。这个与在本发明的产品的情况中发生的不同的事实表明在Chitosan S产品的情况中，存在非选择性的作用，Chitosan S产品并非特异性地结合脂肪而是还结合 许多更多的营养物。因此，本发明的产品具有这样的优点，即没有由其他市售的脂肪粘结剂 产品所呈现的抗营养作用，如实施例中所显示的。选择性脂肪结合是令人关注的，因为饱和 脂肪酸的排泄在DAMM产品消耗后显著增加。实施例1中描述的方法生产的产品在下文中 以及在本文中也被称为"DAMM产品"或"批次1"。单不饱和脂肪酸的排泄增加（尽管结 果不是统计学显著的），而多不饱和脂肪酸的排泄并不增加。
[0053] 本发明的产品的脂肪结合作用也已在人体内被证明。在人中的功能临床试验的结 果显示在治疗3个月后重量下降0. 7kg并且腰围减小2cm。在摄取所述产品后，观察到总体 脂减少0. 82%。观察到使体脂在腹部区域中的累积减少的体脂的再分布。这与减少心血管 风险因素、高血压和糖尿病的潜在益处相关。在有这些结果的情况下，可以推断所述产品促 进减重，在3个月的治疗后，重量总体减少2. Ikg而腰围减小2cm(考虑到安慰剂组整体显 示I. 4kg的增加）。这些结果是临床相关的，因为重量和腰围减小的结果是在没有特别限制 饮食的情况下并且在短的治疗时间内（3个月）获得的。
[0054] 除了在选择性地减少膳食脂肪吸收方面的作用以外，本发明的组合物还在葡萄糖 的代谢中显示生物功能性。在动物模型的口服葡萄糖耐受试验中，血糖峰值（特别地在正 餐后即刻的时间）与阴性对照相比显示下降并且显示与阳性市售对照相同的级数。
[0055] 本发明的产品还显示其可以用作解毒剂，因为其捕获不同的相关毒物毒剂：黄曲 霉毒素 Bl真菌毒素、水银、多氯化联苯（PCB 209)和呋喃。
[0056] 对获得所述组合物的方法的不同重复产生均质的产品，其保持相同的所提及的生 物功能。因此，本发明的方法和产品的一个优势在于最终产品的性质和有用性不依赖于原 料，因为其利用提取自甲壳类的壳多糖/脱乙酰壳多糖发生。另外的及相关的优势在于，通 过本发明的方法，整年内可以获得相同的材料；并且提取的组合物没有存在于提取自甲壳 类的组合物中的重金属内含物如镍、铜。
[0057] 在另一个实施方案中，获得富含多糖的组合物的方法包括第二次热碱处理 (second thermoalcaline treatment)以便改变壳多糖的脱乙酰化程度。因此，在对获自 第一个反应的固体产物进行中和和分离后，以浓度为25至50%的NaOH，在40至80°C的温 度，并且在反应时间为30至240分钟的情况下，对所述产物进行第二次处理。特别地，NaOH 的浓度选自25%、37. 5%和50%。选择的反应温度为在40、60和80°C之间；并且选择的时 间为在30、120、135和240分钟之间。如在以下工作实施例（第7部分）中所显示的，该处 理所产生的产物可以用作解毒剂，因为其能够捕获不同的相关毒物毒剂：黄曲霉毒素 Bl真 菌毒素、水银、多氯化联苯（PCB 209)和呋喃。
[0058] 在另一个实施方案中，获自该第二次热碱处理的部分可用作免疫刺激剂，如在以 下工作实施例中所显示的（第7部分）。具体地，在体内研究中，补充的动物由于具有氧化 活性的激活细胞的百分比增加而显示更大的针对细菌感染的保护能力。可用作免疫刺激剂 的特别的组合物是通过用25% NaOH在40°C水解起始产物达30分钟获得的（如通过实施 例的第1部分中说明的方法获得的）组合物。
[0059] 本发明还提供药物和/或兽医产品，所述药物和/或兽医产品包含有效量的本发 明的组合物以及适量的药用或兽医用赋形剂。在这点上，所述药物产品可以被制备成以片 齐?、丸剂、胶囊、微胶囊、粒剂、混悬剂、糖浆、干粉、液体制剂等的形式经口施用。考虑到所述 组合物的特定目的，赋形剂的选择以及最适当的配制方法在药物【技术领域】的普通技术人员 的能力范围内。口服施用是优选的。
[0060] 术语"药用"当在本文中使用时属于这样的化合物、材料、组合物和/或剂型，所 述化合物、材料、组合物和/或剂型在良好医学判断的范围内适合用于与对象（例如人）的 组织接触，而没有过度的毒性、刺激、变态反应或其他问题或并发症，具有合理的收益/风 险比。各种载体、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须是"可接受的"。合适 的载体、赋形剂等可见于标准药物教科书。类似地，术语"兽医用"是指适用于与非人动物 的组织接触。
[0061] 本发明的组合物也可以被包含在多种可食用产品中，所述可食用产品如乳制品、 酸奶、凝乳、干酪（例如酸奶酪（quark)、奶油、加工的、软的和硬的）、发酵乳、奶粉、基于奶 的发酵产品、冰激凌、基于发酵谷物的产品、基于奶的粉末、饮料、调味品和宠物食品。术语 "可食用产品"以其最广的含义用于本文中，包括可以被动物摄取的任何类型、任何呈现形 式的产品，但是排除药物和兽医产品。其他可食用产品的实例有肉制品（例如肝浆、法兰 克福香肠和意大利香肠或肉酱（meat spread))、巧克力酱（chocolate spread)、馅料（例 如巧克力糖（truffle)、奶油）和糖霜、巧克力、糖果（例如焦糖、软糖或太妃糖）、烘烤食 品（蛋糕、糕点）、沙司和汤、果汁和人造稀奶油。特别感兴趣的可食用产品有饮食补充物 和婴儿配方奶粉（infant formulas)。在本发明的意义上，饮食补充物还包括营养药物 (nutraceuticals)，其已知是对人类健康具有医药作用的食物提取物。动物食物用饲料也 包括在本发明的范围内。本发明的组合物也可以用作其他食物产品中的成分。因此，在本 发明的另一方面中，提供可食用产品，所述可食用产品包含本发明的组合物以及适量的可 食用成分。优选地，本发明的组合物是饮食补充物。如果根据本发明的组合物被用作饮食 补充物，其可以被原样地施用，或者可以与合适的可饮用液体如水、酸奶、奶或果汁混合，或 者可以与固体或液体食品混合。在本文中，饮食补充物可以是片剂、丸剂、胶囊、粒剂、粉剂、 混悬剂、香囊、锭剂、糖果、棒、糖浆和相应的施用形式的形式，通常是单位剂量的形式。优选 地，本发明的组合物以在胶囊中的或形成丸剂（在药物产品的常规制备方法中制备的）的 粉末的形式施用。在另一个优选的实施方案中，所述组合物以容易溶解在可饮用液体中的 瓶盖内的粉末的形式呈现。适用于本发明的组合物的施用方案可以由本领域技术人员确 定。本发明的组合物可以这样施用：一天一次，一周一次，每周若干天或每天若干次。
[0062] 根据本发明的组合物可以被配制成可食用的药物或兽医产品，其中所述组合物是 唯一的活性剂或所述组合物与一种或多种其他活性剂混合和/或与药用或兽医用赋形剂 (在药物或兽医产品的情况下）或适当的添加剂（在可食用产品的情况下）混合。
[0063] 因此，要理解，不管施用形式如何（即，可食用的、药物或兽医产品），受试者都可 以受益于本发明的产品的功能。生物功能是本说明书中说明的那些并且包括脂肪结合作用 及其相应的在预防和/或治疗疾病如超重、肥胖症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高血 压和心血管疾病中的用途。生物功能还有葡萄糖结合作用、解毒作用和免疫刺激作用。 [0064] 以下部分通过体外以及动物和人的体内测定详细描述了获得本发明的组合物的 方法，以及组合物性质，包括其脂肪结合作用。提供以下实施例和附图作为举例说明，并且 它们不意在限制本发明。获得的结果证明：当与其他脂肪粘结剂市售产品相比时，本发明的 组合物具有改善的特征。
[0065] 除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的【技术领域】中 的普通技术人员通常理解的相同含义。在本发明的实施中，可以使用与本文中所述的那些 类似或等同的方法和材料。在整个说明书和权利要求中，词语"包含"及其变体不意在排 除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。在对说明书检查后，本发明的其他目的、优势和特征 对于本领域技术人员将是明显的，或者可以通过实施本发明得到。此外，本发明涵盖本文所 述的特别的和优选的实施方案的所有可能的组合。
[0066] 附图简述
[0067] 图1显示与之前在实验室规模获得的产品（C60,上图）相比的DAMM产品（下图） 的 1H-NMR分析。
[0068] 图2显示DAMM产品（图2A)和纯的壳多糖（来自蟹壳的壳多糖，Sigma，C3641) (图2B)的衍射图（X射线）。
[0069] 图3显示浅棕色细粉形式的最终产品。
[0070] 图4显示产物批次4 (上图）、批次3 (中图）和批次2 (下图）的1H-NMR分析。 实施例
[0071] 实施例1.获得富含多糖的纟目合物（"DAMM产品"）的方法
[0072] 用作起始物料的酿酒酵母源来源于酿造过程中的八次重复使用。用Imm的筛网对 酿造过程副产品进行筛分以便将酿酒酵母生物质与酿造过程的杂质分离。在加热器中干燥 获得的酿酒酵母生物质并且碾磨以获得粉末。
[0073] 利用湿度分析仪IR Sartorius MA30确定酵母生物质的湿度。制备反应介质，用 蒸馏水加载反应器，将搅拌调节在150rpm，添加获得IM NaOH溶液所需量的NaOH，然后在 80°C加热反应介质。称重酵母生物质以使干酵母生物质/反应介质体积之比为1/30。将 酵母生物质添加到热的反应介质中，并且将反应保持16h。经过反应时间后，冷却产品至室 温。随后，将反应体积卸载到惰性容器。将连续离心的运行条件调整至120秒的旋转时间 和2秒的卸载（排出）时间。进行离心，在室温，使用蠕动泵（流速31/min)，用来自所述容 器的反应产物向离心机（Centrifuge GEA Westfalia CTC l(WhisperFuge?))进料。在此 第一次离心后，将获得的固体收集在容器中并且用蒸馏水中和。为此，连续地添加蒸馏水的 体积，进行恒定的搅拌并且控制混合物的pH。混合物的终体积为约50%反应体积并且pH 值为9至10。对获得的中和的混合物的体积再次进行离心，并且重复如上所述的中和-离 心过程，直至达到PH7。五轮离心/中和足以实现pH7。在搅拌下用蒸馏水洗涤pH7的终产 品，直至固体完全分开。此溶液的终体积约为反应体积的25%。如上所述地在室温并且在 流速31/min下对获得的混合物体积再次离心。通过不连续离心对以上步骤中获得的产物 进行离心，其中使用Eppendorf离心机5804R。最后，利用以下运行条件和喷雾干燥器技术 条件对获得的产品进行喷雾干燥：雾化室尺寸=0丨200 X 745 mm;1彡产品接触的材 料=不锈钢AIS 316;外部材料:AISI 304;气旋(旋风分离器，cyclone) = 0 300;旋转 rpm = 24400rpm ;旋转功率=3. 5kW旋转；最大空气流率（进气）=990m3/h ;进气的最高 温度=250°C ;进气电池的最大功率=27kw ;用于进液的蠕动泵：自动/手动速度。
[0074] 在以下实验中，此部分中描述的方法所产生的产品也被称为"DAMM产品"或"批次 1"。
[0075] 使所述方法扩展到中试规模，使NaOH浓度从IM至0. 25M变化。进行体外脂肪结 合测试以按比例地评估产品的生物功能的保持，得到积极结果。
[0076] 实施例2.产品表征
[0077] 在图1中，1H-NMR分析显示：与之前在实验室规模获得的产品（上图）（该产品在 图中被称为"C60"）相比，在中试规模获得的DAMM产品（下图）呈现相同的官能团。图2 显示DAMM产品（图2A)和纯的壳多糖（图2B)的衍射图（X射线）。图3显示DAMM产品的 外观。
[0078] 化学分析显示DAMM产品的脱乙酰壳多糖、壳多糖和β -葡聚糖之比为 1 : 14 : 116,并且碳、氢和氮的原子质量百分比分别为40. 32%、6. 35%和0.24%。该产 品在pH 3. 5在蒸馏水中的溶解度为710mg/l。
[0079] 实施例3.脂肪结合作用：体外诜择件测定
[0080] 利用以下脂质进行通过GLC-MS对脂肪结合以及脂肪捕获中的选择性进行测定：
[0081] ?橄榄油+胆固醇（25mg胆固醇/ml的橄榄油）
[0082] ?棉籽油
[0083] ?鱼油+反油酸（2. 5mg反油酸/ml鱼油）
[0084] 使用这些脂肪而不使用其他脂肪的理由为：
[0085] -它们是脂质的复杂混合物，因此获得关于对不同类型的脂肪酸的更大或更小的 亲和性的信息。此外，情形接近于真实摄入。
[0086] -对于测试对二十二碳六烯酸（DHA)和二十碳五烯酸（EPA)的亲和性程度来说，使 用鱼油是所希望的，由于DHA和EPA的显著的健康益处，希望避免其固定化。
[0087]-利用橄榄油在测定中引入胆固醇提供关于结合来自动物来源的最有害的脂肪之 一的能力的信息。
[0088] -利用这些产品，总计16种对心血管健康或多或少有益或有害的脂肪酸的捕获亲 和性程度被评估。
[0089] 测试的"脂肪粘结剂"产品有DAMM产品、具有82 %脱乙酰化程度的来自 Primex( "Chitoclear"，Iceland)的市售的脱乙酰壳多糖（"Qs Primex"）和来自 Laminaria (Laminaria digitata Sigma, L9634)的葡聚糖。
[0090] 使用的方案如下：对于要测试的每种脂肪粘结剂产品，用HCl 0. 5M制备pH 2的 12ml溶液（w/v)。将3g脂质添加到该溶液并且在37°C在300rpm搅拌3小时。然后利用 0. IM NaOH将溶液的pH先增加至pH 6. 2然后增加至6. 5的最大pH并且在搅拌下在37°C保 持2. 5h。然后将溶液在2000g在37°C离心以分离未与产品结合的脂肪。利用移液管将未 结合的脂肪除去，小心不要吸出水相。用0.5M HCl酸化该溶液以溶解脂肪粘结剂产品并且 尽可能多地释放脂肪。将水相用5ml己烷萃取三次并且最后合并三份有机萃取物，在40°C 在被称重过的容器中蒸发。最后称重干燥的脂肪以定量脂肪粘结剂能够结合的脂肪的量。 结果显示在表1中。
[0091] 表 1
[0092]

【权利要求】
1. 一种用于获得组合物的方法，所述组合物包含从来自酿造过程产生的副产物生物质 的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)的细胞壁提取的葡聚糖、壳多糖和脱乙酰壳 多糖，所述方法包括以下步骤： i) 在搅拌和50至95°C的温度下，准备具有浓度为0. 25至3M的NaOH溶液的反应器； ii) 将所述酿造过程产生的生物质添加到所述溶液中； iii) 将所述条件保持至少1小时； iv) 冷却所述溶液直至室温； v) 通过至少一次添加酸性溶液或水来中和所述溶液，直至达到pH7,其中当进行超过 一次的添加时，在添加之间进行将固体产物从所述溶液分离的步骤； vi) 从所述溶液中分离在步骤（v)中获得的固体产物； vii) 当步骤（v)中的中和通过添加酸性溶液进行时，用水对所述固体产物进行至少一 次洗涤并且分离所获得的固体产物；以及 viii) 干燥所述固体产物直至恒重并微粉化。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤（i)中的温度为65至85°C。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤（i)中的温度为80°C。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述NaOH溶液的浓度为0. 25至1. 5M。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将所述酿造过程产生的生物质以 1:2至1:5的量添加到所述反应器中。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤（v)的中和之前，从 步骤（iv)的所述溶液中分离所述固体产物。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤（viii)通过喷雾干燥所述产物直 至溶剂含量低于5重量％进行。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，所述方法还包括在将所述酿造过程产生的 生物质添加到所述NaOH溶液中之前预处理所述生物质，所述预处理包括以下步骤： (a) 筛分所述生物质以便将所述酿酒酵母生物质与所述酿造过程的杂质分离； (b) 干燥在步骤（a)中获得的酿酒酵母生物质；以及 (c) 研磨在步骤（b)中获得的酿酒酵母产物。
9. 一种通过权利要求1-8中任一项所述的方法可获得的组合物。
10. 根据权利要求9所述的组合物，其用作预防剂和/或治疗剂。
11. 根据权利要求9所述的组合物，其用作肠脂肪粘结剂。
12. 根据权利要求9所述的组合物，其用于预防和/或治疗选自由以下各项组成的组中 的疾病：超重、肥胖症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高血压和心血管疾病。
13. -种药物和/或兽医产品，所述药物和/或兽医产品包含有效量的根据权利要求9 所述的组合物，以及适量的药用或兽医用赋形剂。
14. 一种可食用产品，所述食用产品包含有效量的根据权利要求9所述的组合物，以及 适量的其他可食用成分。
15. 根据权利要求14所述的可食用产品，其是饮食补充物。
【文档编号】A61P3/06GK104379001SQ201380033306
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年6月21日 优先权日:2012年6月25日
【发明者】雷梅迪奥斯·曼塞博莫利纳, 弗兰塞斯克·哈维尔·卡斯塔内西特亚斯, 霍尔迪·库内卡斯特利亚纳, 约纳坦·桑塔斯古特雷斯, 玛格杰列娜·拉费卡斯马丁内斯, 玛丽亚·安赫莱斯·比阿特丽斯·米拉莱斯布拉利亚, 英马库拉达·马特奥斯-阿帕里西奥塞迭尔, 安赫莱斯·玛丽亚·埃拉斯卡巴列罗 申请人:戴姆有限公司