专利名称：9－脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因。
背景技术：
用作食品和食品原料的谷类含有脂质和脂肪酸。这些脂质和脂肪酸在加工和保存时由于谷类中所含的脂肪加氧酶或空气中的氧气引起的自动氧化而被氧化，生成脂质氢过氧化物和脂肪酸氢过氧化物。这些氢过氧化物由于热分解、化学分解和酶引发的分解等而生成醛，生成的醛具有木腥气味和脂肪酸臭味，因此明显有损谷类的香味(非专利文献1)。
醛类中，已知反式-2-壬烯醛是感觉到臭味的阈值较低的醛，被认为是长期保存而劣化的啤酒的老化臭味的原因物质(非专利文献2)和因加工或保存而品质劣化的米所具有的令人不快的臭味的原因物质(非专利文献3和4)。
例如，啤酒中反式-2-壬烯醛的生成机理如下所示(非专利文献5)。啤酒酿造中有使麦芽糖化而获得麦汁的下料工序，该工序中生成作为脂肪酸氢过氧化物之一的9-亚油酸氢过氧化物。接着，生成的9-亚油酸氢过氧化物经麦芽等啤酒原料中所含的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶引起的裂解，生成反式-2-壬烯醛。
对植物活体的醛合成中由氧脂素(oxylipin)合成体系承担的部分反应在双子叶植物中进行了详细的研究(非专利文献6)。醛通过脂肪加氧酶和脂肪酸氢过氧化物裂合酶的级联反应而生成，但脂肪酸氢过氧化物裂合酶被认为是对该反应体系的限速步骤进行催化的酶。醛类中，已知反式-2-壬烯醛是9-亚油酸氢过氧化物通过9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶的裂解反应催化作用而生成(非专利文献7)，9-亚油酸氢过氧化物裂合酶基因的结构也已经清楚(非专利文献8)。
另一方面，对水稻、小麦等单子叶植物的研究不充分，仅在大麦中分离出脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因。但是，该脂肪酸氢过氧化物裂合酶无法将9-亚油酸氢过氧化物作为底物，因此与反式-2-壬烯醛的生成完全没有关系(非专利文献9)。
非专利文献1J.Bruce German，食品加工和脂类氧化(Food Processing andLipid Oxidation).加工对食品安全的影响(Impact of Processing on FoodSafety)，Kluwer Academic/Plenum Publishers，纽约，1999非专利文献2Drost，B.W.等，香味稳定性(Flavor stability).J.Am.Soc.Brew.Chem.，48，124-131.1990非专利文献3Suzuki等，种子中存在或不存在脂肪加氧酶-3时的各种贮藏大米中的挥发性成分(Volatile components in stored rice(Oryza sativa(L.)of varieties with and without lipoxygenase-3 in seeds))，J.Agric.Food.Chem.，471119，1999非专利文献4Lam.H.S.和Proctor A.，精米氧化挥发成分和臭味的形成(Milled Rice Oxidation Volatiles and Odor Development)，Journal of FoodScience，682676-2681，2003非专利文献5Kuroda等，糖化时2(E)-壬烯醛的生成所涉及的因子的鉴定(Characterization of factors involved in the production of 2(E)-nonenalduring mashing)，Biosci.Biotechnol.Biochem.，67691-697，2003非专利文献6Blee，E.，植物氧脂素和植物防御反应(Phytooxylipins andplant defence reactions)，Prog.Lipid Res.，37，33-72，1998非专利文献7Matsui等，来源于黄瓜的脂肪酸9-和13-氢过氧化物裂合酶(Fatty acid 9-and 13-hydroperoxide lyases from cucumber)，FEBS Lett.481，183-8，2000非专利文献8Matsui，K.等，甜椒脂肪酸氢过氧化物裂合酶是一种细胞色素P450(CYP74B)(Bell pepper fruit fatty acid hydroperoxide lyase is acytochrome P450(CYP74B)).FEBS Lett.，394，21-24，1996非专利文献9Koeduka等，大麦脂肪酸氢过氧化物裂合酶的动力学受到盐和去污剂的调控(Kinetics of barley FA hydroperoxide lyase are modulatedby salts and detergents)，Lipids，381167-1172，2003发明的揭示如果清楚了单子叶植物的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因，则可发现限制性片断长度多态性(RFLP)和单核苷酸多态性(SNP)，筛选出9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶缺失的品种或9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶的稳定性和活性低的品种。此外，通过以RNA干扰(RNAi)为代表的基因抑制技术等，可以培育出9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶的活性受到抑制的品种。
因此，本发明的目的在于弄清单子叶植物的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因。
随着近年来基因组技术的进展，逐步积累了充足的基因信息，可以基于已知的基因信息而抽提出与之类似的基因，但特别指定催化作用、特别是生成物的情况下，就现有的技术而言，还非常困难。脂肪酸氢过氧化物裂合酶属于细胞色素P-450家族，但该家族由数千种相似基因的群构成，无法通过基因序列的相似性来推定酶蛋白质的功能。
因此，本发明者以与水稻相关的基因公开信息为基础，筛选出多个与脂肪酸氢过氧化物裂合酶具有相似性的基因，使各基因表达，考察其功能，结果发现由序列编号1所示的碱基序列构成的基因和由序列编号5所示的碱基序列构成的基因将9-亚油酸氢过氧化物转化为反式-2-壬烯醛，从而完成了本发明。
即，本发明提供由序列编号1所示的碱基序列构成的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因。此外，本发明提供编码由序列编号2所示的氨基酸序列构成的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因。
本发明还提供由序列编号5所示的碱基序列构成的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因。此外，本发明提供编码由序列编号6所示的氨基酸序列构成的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因。
若以本发明的基因为指标，可以筛选出9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶的稳定性和活性低的品种。此外，通过控制或改变本发明基因的表达，可以培育出9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶的稳定性和活性低的品种。因此，可以提供香味得到保持的食品。
附图的简单说明
图1为与AK105964和AK107161相关的分子系统树。
图2(a)为使由序列编号1所示的碱基序列构成的基因表达而得到的蛋白质与9-亚油酸氢过氧化物的反应生成物的GC-MS的总离子流色谱图。图2(b)为阴性对照的总离子流色谱图(total ion chromatogram)。
图3为峰1的质谱图。
图4为表示使由序列编号1所示的碱基序列构成的基因表达而得到的蛋白质与9-亚油酸氢过氧化物反应生成的反式-2-壬烯醛的图。
图5(a)、(b)和(c)分别为13-HPOD、9-HPOT和13-HPOT与使由序列编号1所示的碱基序列构成的基因表达而得到的蛋白质的反应生成物的GC-MS的总离子流色谱图。
符号说明1表示反式-2-壬烯醛，2表示1-壬醇(内标物)。
实施发明的最佳方式本发明的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因来源于水稻，由序列表的序列编号1所示的碱基序列构成。此外，该基因编码的多肽、即9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶由序列表的序列编号2所示的氨基酸序列构成。另外，本发明的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因来源于水稻，由序列表的序列编号5所示的碱基序列构成。此外，该基因编码的多肽、即9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶由序列表的序列编号6所示的氨基酸序列构成。9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶能将9-亚油酸氢过氧化物转化为作为老化臭味的原因物质的反式-2-壬烯醛。因此，通过抑制本发明基因的表达或改变本发明的基因，可以保持谷类的香味，可以将本发明的基因用于这样的目的。
例如，有通过利用RNAi或反义RNA控制本发明基因的表达而保持谷类的香味的方法。此外，也可以利用位点特异性诱变等，制成反式-2-壬烯醛生成活性低下的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因，将该基因导入谷类中，从而培育出可以保持香味的谷类。作为导入方法，可以例举农杆菌法、原生质体法、PEG法、电穿孔法、基因枪法、显微注射法等。
本发明的基因可以从表达该基因的水稻(例如日本晴(Oryza sativa L.)等品种)的种子等通过RT-PCR法得到。更具体地，通过AGPC法或胍·氯化铯超离心法等从水稻的种子中提取RNA，将得到的RNA作为模板进行PCR，从而可以获得本发明的基因。
另外，通过位点特异性诱变法等，也可以合成作为本发明基因的突变型的编码9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶的基因。作为在核酸中导入突变的方法，可以例举Kunkel法、缺口双链体(gapped duplex)法等公知的方法。例如，使用采用位点特异性诱变法的突变导入用试剂盒(Mutan-K和Mutan-G等；TAKARA)等，或者LA PCR体外诱变系列试剂盒(TAKARA)，来进行突变的导入。
实施例
(实施例1)利用基因功能已知的大麦13-脂肪酸氢过氧化物裂合酶(CAC82980)、大麦水稻氧化丙二烯合成酶(CAB86383、CAB86384)和水稻氧化丙二烯合成酶(Q8VZX5、Q940D7)，在NCBI(美国国立生物技术信息中心，National Center forBiotechnology Information)和KOME(水稻分子生物学百科全书，Knowledge-based Oryza Molecular biological Encyclopedia)的数据库中，使用蛋白质-蛋白质BLAST程序，将E-value＝e-10设定为阈值，筛选与上述基因具有同源性的蛋白质。
其结果，新筛选出水稻cDNA，即AK105964和AK107161。用ExPASy分子生物学服务器上的ClastaIW制成分子系统树，得到图1所示的分子系统树。如图1所示，新筛选出的2个基因被分类到与氧化丙二烯合成酶基因(AOS)和13-脂肪酸氢过氧化物裂合酶(13-HPL)这两个明显不同的组中，推测其具有与AOS和13-HPL不同的酶功能。AK105964和AK107161具有非常相似的结构，所以对AK105964进行了进一步的功能分析。
(实施例2)从水稻种子(品种日本晴)中用Tripure分离试剂(罗氏)提取总RNA后，使用Oligotex-dT30 mRNA纯化试剂盒(TAKARA BIO)生成PolyA+RNA。使用两个引物(5′-gcggatccatggcgcgccgccgcgagccaa-3′(序列编号3)和5′-gcgaattcccgcaccaacactcgccgctc-3′(序列编号4))进行RT-PCR，亚克隆到pUC118中。进行全长序列的测序，确认序列与AK105964一致。接着，将AK105964的结构基因亚克隆到pRSETA(Invitrogen)的BamH I位点和EcoR I位点之间，导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLys中。
大肠杆菌中的表达和粗提取液的制备使用Kuroda等，麦芽汁中将亚油酸转化为二羟基十八烯酸和三羟基十八烯酸的因子的鉴定(Charaterization offactors that transform linoleic acid into di-and trihydroxyoctadecenoicacids in mash)，J.Biosci.Bioeng.，9373-77，2002中所记载的方法。具体来说，首先于16℃下在50mL预培养的培养液(OD600＝0.5)中添加异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷，使最终浓度为1mM。再培养16小时，将大肠杆菌细胞通过离心分离回收后，加入5mL含有0.1％的Tween20的10mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.2)，使其悬浮。将细胞悬浮液通过超声波破碎使细胞可溶化，离心分离30分钟后(15000g，4℃)，回收上清，得到粗提取液。作为对照样品，准备导入了pRSETA的BL21(DE3)pLys，以与上述同样的条件制备粗提取液。
脂肪酸氢过氧化物裂合酶的活性测定以Kuroda等，糖化时2(E)-壬烯醛的生成所涉及的因子的鉴定(Characterization of factors involved in theproduction of 2(E)-nonenal during mashing)，Biosci.Biotechnol.Biochem.，67691-697，2003中所记载的方法进行。具体来说，在5μL粗提取液中加入含有0.1％的Tween20的10mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.2)，定容到100μL，添加5μL溶解有9-亚油酸氢过氧化物(2mM)的乙醇，在30℃下保温5分钟后，加入900μL乙醇，停止反应。将反应物移入添加了30g氯化钠和5mL蒸馏水的管瓶中，作为内标加入1ppm的1-壬醇(乙醇溶液)后加盖。
采用气相色谱-质谱分析(GC-MS)的定量和化合物的鉴定如下进行。将聚二甲基硅氧烷SPME纤维(SUPELCO)插入到管瓶中，在40℃下保温10分钟后，供于气相色谱(惠普HP6890/MSD系统)的注射孔(260℃)。毛细柱使用DB-1(30m×0.25mm，膜厚1μm，J&W公司)，载气使用氦气(1mL/分钟)。加热炉条件为120℃下保持1分钟，以5℃/分钟升温至150℃，以40℃/分钟升温至300℃，在300℃下保持2分钟。反式-2-壬烯醛和1-壬醇的定量以选择离子模式(m/z)的条件进行分析。反式-2-壬烯醛和1-壬醇的保留时间分别为7.6分和7.8分。GC-MS分析中，如上所述进行气相色谱，使用HP-Chemistation的软件和化合物数据库进行生成物的MS/MS分析和化合物的鉴定。
图2(a)为表示使由序列编号1所示的碱基序列构成的基因表达而得到的蛋白质与9-亚油酸氢过氧化物的反应生成物的GC-MS的结果的图(总离子流色谱图)。此外，图2(b)为阴性对照的总离子流色谱图。保留时间7.6分的峰1表示反式-2-壬烯醛，保留时间7.8分的峰2表示内标物1-壬醇。如图2所示，只有使由序列编号1所示的碱基序列构成的基因表达的情况下，发现反式-2-壬烯醛的峰。图3为峰1的质谱图，由该质谱图可知，峰1表示反式-2-壬烯醛。
图4为表示使由序列编号1所示的碱基序列构成的基因表达而得到的蛋白质与9-亚油酸氢过氧化物反应生成的反式-2-壬烯醛的图。纵轴表示单位大肠杆菌蛋白质(mg)的反式-2-壬烯醛的活性。由图4可知，只有使由序列编号1所示的碱基序列构成的基因表达的情况下生成反式-2-壬烯醛。
对于AK107161也进行了与AK105964同样的分析。引物使用5′-gccggatccatggcgccaccgccagt-3′(序列编号7)和5′-gccgaattccgcaattaaaacatccaccaacct-3′(序列编号8)，亚克隆到pUC118中。进行全长序列的测序，确认序列与AK107161一致。接着，将AK107161的结构基因亚克隆到pRSETA的BamH I位点和EcoRI位点之间，导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLys中。以下，通过与AK105964同样的方法，在大肠杆菌中进行表达，制备粗提取液，测定其酶活性，确认AK107161具有与AK105964同样的活性。
由以上的结果可知，由序列编号1所示的碱基序列构成的基因和由序列编号5所示的碱基序列构成的基因是将9-亚油酸氢过氧化物转化为反式-2-壬烯醛的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因。
(实施例3)以下，对于AK105964(和AK107161)对以下的脂肪酸过氧化物(所有脂肪酸过氧化物都含于水稻中)的催化作用进行分析13(S)-氢过氧化-9(Z)，11(E)-十八碳二烯酸(13-HPOD)、9(S)-氢过氧化-10(E)，12(Z)，15(Z)-十八碳三烯酸(9-HPOT)和13(S)-氢过氧化-9(Z)，11(E)，15(Z)-十八碳三烯酸(13-HPOT)。与实施例2同样地，使酶提取液和脂肪酸过氧化物反应，对得到的生成物用GC-MS进行分析。
得到的色谱图示于图5。(a)、(b)和(c)分别与13-HPOD、9-HPOT和13-HPOT反应而得到的生成物的GC-MS的色谱图。如图5(a)～(c)所示，由13-HPOD生成了己醛，由9-HPOT生成了(2，6)-壬二烯醛，由13-HPOT生成了(3Z)-己烯醛和(2E)-己烯醛。生成的这些醛会成为引起食品的老化臭味的物质，可以期待通过用基因抑制技术抑制AK105964(和AK107161)的表达等来提高米的品质。
序列表序列表<110>札幌啤酒株式会社(Sapporo Breweries Ltd.)<120>9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因<130>FP05-0209-00<150>JP 2004-162138<151>2004-05-31<150>JP 2004-318233<151>2004-11-01<150>JP 2004-368306<151>2004-12-20<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1533<212>DNA<213>日本晴水稻(Oryza sativa)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1533)<223>
<400>1atg gcg ccg ccg cga gcc aac tcc ggc gac ggt aac gac ggc gcc gtc 48Met Ala Pro Pro Arg Ala Asn Ser Gly Asp Gly Asn Asp Gly Ala Val1 5 10 15gga ggg cag agc aag ctc tcg ccg tcg ggc ctg ctg ata cgc gag att 96Gly Gly Gln Ser Lys Leu Ser Pro Ser Gly Leu Leu Ile Arg Glu Ile20 25 30ccg ggc ggc tac ggc gtg ccc ttc ctc tcg ccg ctg cgc gac cgc ctc 144Pro Gly Gly Tyr Gly Val Pro Phe Leu Ser Pro Leu Arg Asp Arg Leu35 40 45gac tac tat tac ttc cag ggc gcc gac gag ttc ttc cgc tca cgc gtc 192Asp Tyr Tyr Tyr Phe Gln Gly Ala Asp Glu Phe Phe Arg Ser Arg Val50 55 60gcc cgc cac ggc ggc gcc acc gtg ctc cgc gtc aac atg ccg ccc ggc 240
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<210>3<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>AK105964的引物<400>3gcggatccat ggcgcgccgc cgcgagccaa30<210>4<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>AK105964的引物<400>4gcgaattccc gcaccaacac tcgccgctc 29<210>5<211>1503<212>DNA<213>日本晴水稻(0ryza sativa)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1503)<223>
<400>5atg gcg cca ccg cca gtg aac tcc ggc gac gcc gcc gcc gcc gcc acg48Met Ala Pro Pro Pro Val Asn Ser Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Thr1 5 10 15gga gag aag agc aag ctc tcg ccg tcg ggc ctc ccc ata cgc gag ata96Gly Glu Lys Ser Lys Leu Ser Pro Ser Gly Leu Pro Ile Arg Glu Ile20 25 30ccc ggc ggc tac ggc gtg ccc ttc ttc tcg ccg ctg cgc gac cgc ctc144Pro Gly Gly Tyr Gly Val Pro Phe Phe Ser Pro Leu Arg Asp Arg Leu35 40 45
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<223>AK107161的引物<400>7gccggatcca tggcgccacc gccagt 26<210>8<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>AK107161的引物<400>8gccgaattcc gcaattaaaa catccaccaa cct 3权利要求
1. 9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因，其特征在于，由序列编号1所示的碱基序列构成。
2.脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因，其特征在于，编码由序列编号2所示的氨基酸序列构成的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶。
3. 9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因，其特征在于，由序列编号5所示的碱基序列构成。
4.脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因，其特征在于，编码由序列编号6所示的氨基酸序列构成的9-脂肪酸氢过氧化物裂合酶。
全文摘要
本发明涉及由序列编号1所示的碱基序列构成的9－脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因和由序列编号5所示的碱基序列构成的9－脂肪酸氢过氧化物裂合酶基因。
文档编号C12N9/88GK1946846SQ20058001285
公开日2007年4月11日 申请日期2005年5月27日 优先权日2004年5月31日
发明者黑田久夫, 金田弘举, 大嶋利幸 申请人:札幌啤酒株式会社