狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法

狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法
【专利摘要】本发明公开了狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法。狂犬病活疫苗包含：狂犬病ERAg3m病毒。狂犬病毒ERAg3m毒株是通过反向遗传学方法将狂犬病毒ERA株进行改造获得的，安全性高，由此含有该狂犬病ERAg3m病毒可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫效力。
【专利说明】狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体而言，本发明涉及狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法。
【背景技术】
[0002]狂犬病(Rabies)又叫疯狗病或恐水症，是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的人兽共患急性传染病。狂犬病主要影响中枢神经系统，人一旦发病，目前尚没有有效的临床治疗方法，是迄今人类唯一病死率高达100%的急性传染病。全世界每年约有55000人死于狂犬病，我国自2003年后每年狂犬病死亡人数均超过2000人，虽然我国每年投入防控狂犬病的费用超过100亿，投入费用位居世界第一，防治效果却是全球倒数第二，仅次于印度。狂犬病毒的传播已经严重影响到我国的公共卫生安全，已成为一个非常突出的社会问题。
[0003]我国现有的狂犬病疫苗为采用Flury株在BHK21细胞上转瓶生产的弱毒活疫苗以及灭活疫苗。Flury弱毒活疫苗因为存在可能的毒力返强以及脑内感染致死性，现已基本停止生产。灭活疫苗主要是采用转瓶或微载体生产病毒抗原，然后浓缩、纯化，加入佐剂制成，由于生产病毒的滴度低，达到免疫效力要求需要浓缩的倍数高，如转瓶培养需要浓缩30-50倍；同时，由于细胞和病毒培养时加入2~10%的牛血清，导致下游纯化难度加大，所制备的灭活疫苗生产成本高，现有疫苗的销售价格都在20元/头份以上，导致各级政府采购成本居高不下，难以大规模推广。国外现有的针对犬猫的狂犬病疫苗为采用肌肉注射的灭活疫苗，质量较好，但价格昂贵。而采用口服疫苗，优势明显:一是改变传统疫苗制剂方式，采用口服，更易于扩大免疫覆盖范围，实现大范围对宠物犬和猫的免疫；二是可避免某些宠物，特别是大型犬和烈性犬注射免疫时可能对人造成的伤害；三是成本低，易于推广；四是采用缓释技术，免疫保护期较常规疫苗更长。
[0004]我国犬猫的饲养数目庞大，据估计可能超过2亿只，这其中包括大量的流浪犬和农村犬。采用肌肉注射免疫需要将犬保定，对于 大型犬和烈性犬，特别容易伤害到进行免疫注射的医务人员，加上流浪犬难以捕捉，因此采用肌肉注射某些时候难以进行。而口服疫苗却能很好地解决这一问题，对于大型犬、烈性犬和流浪犬只需将疫苗投撒在饲料中进行饲喂就可以起到免疫预防的作用，易于推广。
[0005]国外成功消灭狂犬病的经验是推行野生动物口服狂犬病疫苗，原因在于大多数的欧美国家狂犬病毒的传播主要是通过野生动物如狐狸、浣熊等自然宿主传播，而我国狂犬病毒的主要传播途径却是通过宠物犬的咬伤、舔舐以及人与宠物犬的亲密接触如亲吻等，因此我国防控狂犬病的首要措施就是切断宠物犬对人狂犬病毒的传播，对犬实现70%以上的免疫，包括流浪犬以及农村犬。

【发明内容】

[0006]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法，该疫苗可有效用于野生动物，如流浪犬等动物的免疫预防。
[0007]本发明是基于发明人的下列研究而完成的:发明人首先利用反向遗传学方法将狂犬病毒ERA株进行改造，获得了一株安全性极高的基因工程毒株，利用该毒株结合微球技术和诱饵技术研制出一种口服疫苗，该疫苗可用于野生动物，如流浪犬等动物的免疫预防。根据本发明实施例，狂犬病毒ERAg3m毒株是通过反向遗传学方法得到，可用作口服活疫苗生产用毒株，安全性高，免疫效力好。
[0008]为此在本发明的一个方面，本发明提出了一种狂犬病活疫苗，包含:狂犬病ERAg3m病毒。由此可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫原性。
[0009]根据本发明的实施例，所述狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m病毒的浓度为lX 109 0TCID50/mL.由此可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫原性。
[0010]在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备狂犬病口服活疫苗的方法，该方法包括如下步骤:
[0011]I)利用BHK21细胞对狂犬病ERAg3m病毒进行全悬浮培养，以便获得狂犬病ERAg3m病毒溶液；
[0012]2)将所述狂犬病ERAg3m病毒溶液与壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液进行混合，以便制备得到壳聚糖纳米微球；以及
[0013]3)将所述壳聚糖纳米微球进行诱饵包裹，以便制备得到所述狂犬病口服活疫苗。
[0014]由此可以有效制备得到狂犬病口服活疫苗，该狂犬病口服活疫苗食用方便，免疫原性强，将狂犬病口服活疫苗制备成微球的形式可以有效保持狂犬病ERAg3m病毒的免疫原性，以便进一步提高狂犬病口服活疫苗免疫性。
[0015]另外，根据本发明上述实施 例的制备狂犬病口服活疫苗的方法还可以具有如下附加的技术特征:
[0016]根据本发明的实施例，在步骤2)中，将所述狂犬病ERAg3m病毒溶液加入到壳聚糖醋酸溶液中；再将壳聚糖和狂犬病ERAg3m病毒混合溶液加入到三聚磷酸钠水溶液中，混合均匀并离心处理，以便获得含有疫苗抗原的纳米微球。由此可以进一步提高制备壳聚糖纳米微球效果。
[0017]根据本发明的实施例，所述全悬浮培养是在37摄氏度的温度下培养36小时而完成的。由此可以进一步提高狂犬病ERAg3m病毒繁殖效率，以便进一步提高制备狂犬病口服活疫苗的效率。
[0018]根据本发明的实施例，所述狂犬病ERAg3m病毒溶液的浓度高于I X IO8 tlTCID5ci/ml。由此可以进一步提高狂犬病口服活疫苗的免疫原性。
[0019]根据本发明的实施例，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为0.1%-10%w/v,所述壳聚糖溶液的溶剂是浓度为1%的醋酸；所述三聚磷酸钠溶液的浓度为0.1%-5%w/v,由此可以进一步提高制备壳聚糖纳米微球的效率和质量。
[0020]根据本发明的实施例，所述离心处理是在4摄氏度、15000~18000rpm的条件下离心30分钟而完成的。由此可以进一步提高制备壳聚糖纳米微球的效率和质量。
[0021 ] 根据本发明的实施例，将所述壳聚糖纳米微球进行诱饵包裹之前，进一步包括:向所述壳聚糖纳米微球中加入MEM溶液，以便使得所述壳聚糖纳米微球中所述狂犬病ERAg3m病毒的浓度为lX109_°TCID5(l/ml。由此可以进一步提高壳聚糖纳米微球中的狂犬病ERAg3m病毒的浓度，以便进一步提高狂犬病口服活疫苗的免疫原性。
[0022]根据本发明的实施例，所述诱饵包裹进一步包括:将所述壳聚糖纳米微球加入到融化的蜡中进行第一诱饵包裹并晾干，以便得到第一壳聚糖纳米微球包裹物；将所述封蜡的壳聚糖纳米微球加入到猪油与蜡的混合液体中进行第二诱饵包裹并晾干，以便得到第二壳聚糖纳米微球包裹物；以及将所述第二壳聚糖纳米微球包裹物加入到猪肉聚合物中进行混匀并定型，以便制备得到所述狂犬病口服活疫苗。由此可以进一步提高狂犬病口服活疫苗的易食性和使用率。
[0023]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0025]图1是根据本发明的另一个实施例的制备狂犬病口服疫苗的方法中制备狂犬病ERAg3m病毒的克隆方法示意图。
[0026]图2是根据本发明的一个实施例制备狂犬病口服活疫苗的方法的流程图。
【具体实施方式】
[0027]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相 同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0028]根据本发明的一个方面，本发明提出了一种狂犬病活疫苗，根据本发明的实施例，该狂犬活疫苗包含:狂犬病ERAg3m病毒。根据本发明的具体实施例，狂犬病毒ERAg3m毒株是通过反向遗传学方法将狂犬病毒ERA株进行改造获得的，安全性高，由此含有该狂犬病ERAg3m病毒可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫效力。
[0029]根据本发明的具体实施例，上述狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m病毒的含量并不受特别限制，根据本发明的具体示例，狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m病毒的浓度可以为I X 109_ °TCID50/ml。由此可以进一步提高狂犬病活疫苗的免疫效力。
[0030]根据本发明的具体实施例，上述狂犬病活疫苗表达编码狂犬病ERAg3m病毒的糖蛋白，并且狂犬病ERAg3m病毒糖蛋白具有下列突变:信号肽第2位的氨基酸缺失；信号肽的第3位的氨基酸缺失；第333位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸；缺失psi假基因区；所述糖蛋白的G基因插入M基因之如。
[0031]根据本发明的具体实施例，上述狂犬病ERAg3m病毒突变糖蛋白具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:1氨基酸序列为:
[0032]MQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCP
[0033]NNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKffCPPDQL[0034]VNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVETWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKD⑶EAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL。
[0035]根据本发明的具体实施例，上述突变株的基因组中包含SEQ IDNO:2所示核苷酸序列。SEQ ID NO:2核苷酸序列为:
【权利要求】
1.一种狂犬病活疫苗，其特征在于，包含:狂犬病ERAg3m病毒。
2.根据权利要求1所述的狂犬病活疫苗，其特征在于，所述狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m 病毒的浓度为 lX109 °TCID5Q/ml。
3.一种制备狂犬病口服活疫苗的方法，其特征在于，包括: 1)利用BHK21细胞对狂犬病ERAg3m病毒进行全悬浮培养，以便获得狂犬病ERAg3m病毒溶液； 2)将所述狂犬病ERAg3m病毒溶液与壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液进行混合，以便制备得到壳聚糖纳米微球；以及 3)将所述壳聚糖纳米微球进行诱饵包裹，以便制备得到所述狂犬病口服活疫苗。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，将所述狂犬病ERAg3m病毒溶液加入到壳聚糖醋酸溶液中； 将含有壳聚糖和狂犬病ERAg3m病毒的混合溶液加入三聚磷酸钠水溶液，混合均匀并离心处理，以便获得含有疫苗抗原的纳米微球。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全悬浮培养是在37摄氏度的温度下培养36小时而完成的。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述狂犬病ERAg3m病毒溶液的浓度高于lX108°TCID5(l/ml。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的浓度为0.1%-10%w/v，所述壳聚糖醋酸溶液的溶剂是浓度为1%的醋酸；所述三聚磷酸钠水溶液的浓度为 0.1%-5%w/v。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心处理是在4摄氏度、15000~18000rpm的条件下离心30分钟而完成的。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中的将所述壳聚糖纳米微球进行诱馆包裹之前，进一步包括: 向所述壳聚糖纳米微球中加入MEM溶液，以便使得所述壳聚糖纳米微球中所述狂犬病ERAg3m 病毒的浓度为 lX109 °TCID5Q/ml。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中的所述诱饵包裹进一步包括: 将所述壳聚糖纳米微球加入到融化的蜡中进行第一诱饵包裹并晾干，以便得到第一壳聚糖纳米微球包裹物； 将所述封蜡的壳聚糖纳米微球加入到猪油与蜡的混合液体中进行第二诱饵包裹并晾干，以便得到第二壳聚糖纳米微球包裹物；以及 将所述第二壳聚糖纳米微球包裹物 加入到猪肉聚合物中进行混匀并定型，以便制备得到所述狂犬病口服活疫苗。
【文档编号】A61P31/14GK103877570SQ201410056975
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】熊炜, 高杨, 刘延亭, 刘俊生, 李耀东, 郑杰 申请人:北京中联康生物科技有限公司