狂犬病病毒era减毒疫苗突变株及其制备方法和狂犬病活疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株及其制备方法和狂犬病活疫苗。其中，狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株表达编码突变糖蛋白，并且所述突变糖蛋白具有下列突变：信号肽第2位的氨基酸缺失；信号肽的第3位的氨基酸缺失；第333位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸；缺失psi假基因区；所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。由此上述狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株更安全、有效、成本低。
【专利说明】狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株及其制备方法和狂犬病活疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体而言，本发明涉及狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株及其制备方法和狂犬病活疫苗。
【背景技术】
[0002]狂犬病是一种人畜共患的病毒性传染病，人一旦发病，病死率为100%。近两年我国人狂犬病的发病和死亡数均超过3000人/年，并且疫情呈上升态势。人类主要是通过被患有狂犬病的家养或野生动物咬伤而感染狂犬病毒。因此，控制家养或野生动物狂犬病感染不仅可以降低这些动物的死亡率，而且可以有效控制人类感染狂犬病毒，是预防狂犬病的有效手段。
[0003]控制动物感染狂犬病毒的主要手段是投撒口服减毒活疫苗。当前所有上市的口服狂犬疫苗其病毒都来源于Evelyn-Rokitnick1-Abelseth (ERA)株。ERA株是狂犬病病毒街毒Street-Alabama-Dufferin(SAD)株的固定株。SAD株于1935年从美国阿拉巴马的一条疯狗中分离，在小鼠脑、幼仓鼠肾BHK-21细胞和鸡胚中进行多次传代减毒后,获得ERA株。传统的减毒活疫苗由于残余毒力或在体内繁殖变异可能导致接种的动物患病，具有一定的危险性。
【发明内容】
[0004]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株及其制备方法。
[0005]在本发明的一个方面，本发明提出了一种狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株，所述狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株表达编码突变糖蛋白，并且所述突变糖蛋白具有下列突变:信号肽第2位的氨基酸缺失；信号肽的第3位的氨基酸缺失;第333位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸；缺失Psi假基因区；所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。
[0006]根据本发明的具体实施例，上述突变糖蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0007]SEQ ID NO:1 氨基酸序列为:
[0008]MQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVETWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKD⑶EAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSffESHKSGGETRL0
[0009]根据本发明的具体实施例，上述突变株的基因组中包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。SEQ ID NO:2 核苷酸序列为:TGTTAAGCGT CTGATGAGTC CGTGAGGACGAAACTATAGGV3VXXXVX333XXVVV000X XXX0X0XXV3 3XXXXX00X3 XX3333VX0X XX0X33X3X300V3X30XX0OXVOVVVOOV V3X3V0VVVV 3X333XV3VV 0V30X33VVVVVVV0XV3VV 3X0VVVX33X0XV0V033X0 VVVXVV3V0V X3X333X0V3X3V33X3X30 VV033VVX30 XX3XV3VXVX 303XVV0XX3V0XV0VV30XV3XVVVVX0V 0X30VV3V03 3XVV03X0VX X0XX0V33XX VVV0VVX3X3VV3300XXX303X000XV00 0X3VX0X0XV 0VVX33333X 3VVV33X0003V0XV3330V XXX0333V0X0X00V33VX0 XVVVVVV300 V0VVVXX0VXVXV0XV0XX3 3VV0XVVVV0 XXW30V0XX xxvvxvxoxx3X3VXV000V3X33XV03X0 X333XXX0VV XVXVVVVVVO 3X3XXX0VVV 0V30XXV0V33V3X303XV0V0X300V00X 0V3XVX3XV0 XVOOVVVVOX VV33V33003X00XVV0XX3 330V33X33000X3XX30X3 VVV3X30030 0XV00V330VVV03XV3XVV 330VVV0V0V 0V3X3XX33X 3V333V3VV3V0V00VV0VV3X30V0V033 00X3VX3V0V 333VV3XVVV XV00V0V3XX 3X0VVV00V33X333VVOOOXXX3VV3X00 303X0XVX33 XVXVXXVOVO VV0VX033V0V3V3X00XVX V0VV3X3XXXVOVOVOVOOV 3X00V0XVVV 3V0V3X0VXVVV33X0V00X XOXVVVVOOX 33VXV3X0V3 3XX0X33XX30VX33XV00V0V00VV0XV0 0XV0V3XXX3 V00V0V03XV X0VV300VV0 VOOOXOOVV3300XV0V0X00X333VV333 03XVVVV00X V0XV00X33V 3XX3V030000XVXV00V0X 333X3XVV3VOOXOVVOVXV 333VVOOOOV V33X3XV3X300V3XVV3V0 VV03XVXVVV 0VXVV3XV0X 3XV0XX0X3VVV0VV0X300XV0V0XX3XV 03300X3X00 330V0VXXVX 30X0VX33XV V3X0XXX3XV0VV30V0XV3VVV333XV33 VV03XXX33X 3333V3VVX3 VVVVVVV0XV3XV33XVXVX 0X0XXV003VX3XVVV0033 0XVVVV3VVX VVOXXOVVOVVXVOXOVOXO V03XXVXV3V 0VV3VVVX3X XX0V03303XXV3X3VVV33X03330VV3X V3XVV33XX0 V3X0V3X3X0 XVXV0V003V XV3V3X3XV0V0VVVX3V03XOOVOOXVVO XV0XV3XVV0 3X3VXVXXX0 X300V0033X0VV0V33VVV 0X00V3X3XX3VX3V00V03 V03V0X3X3V V3X0X3VV00XV0XV0V300 X3V30VX03V 0X3V0VVV3V 0X3VV0X300300V03VXVV0VV3XX3VV0 VVVOVOXVOV 0V3XX3XXV0 VVOVVVOXXX V3V000VVV0003XX3XXVV00V0V000X3 XVX300000V X3XX0X3X0X VVV0XV3X33X30X0XV30X 30XXVXX003VV30XVVVX3 33XV0V3X0V V3X000XVXVX30XV00VX0 XXX3V3XXV3 X3XVV3XX0X 03V3X00XX0X30XVVV3XV3XXVXX33X3 XVVVOOOXOV 0XX300VX3V 3XX033XX3V 33XV3XXXVXX3X3V3X30XX0X30V3V0V 00V3000V33 OVOXXXOXVV OVVOVVXVOVOVVOOVOXXX 3VV0VV3V33XXOXXXVXVX 3VXVV300V0 V0VX3033V3X3XVV3XVVV 3VVVVXV3XX 000X3VXXXV 3XVX00X3V00V3XX0X3V0VV0XVXX30X 3V3X0XX0V3 V3000X0V0V 3XVV30V 3XX VXVXOXVOOVOXXViBOOOX3XXXXX0XV3 V0XVX33VV0 03300XXXXX V0V3XX3VVV33VXVX3VX0 V00XXVVX30X0X0XVVVV3 V3X3VV3V0X VVX3X3VXV33V3VV00X03 XVVVVXXOXX XX33330V3V OVOXXXXXVOV30V0VXV00V3V0V30XXV 3VVV3V0VVX VX3VVX00X3 V3VVVV3000 33XVXVVVV30V0XX00VXVX0X3X0V0XX 3X3XX3X003 X0VXX33X03 0XV30V0X333X0X3V3333 V0V0VV3V0X3VV00XV300 V00V3V0X3X 3000XXVV000VV0VX0XV0 XOVXOOVVVV XVOVOOXOOX 3X3XX00V3333V3XV0VVXV0V00VVVV0 3V30XXV0X0 OXVVODXVXO 0V33V00X3V 0VV0033X0XV3V0000V0XXXXXX0V30X VV30030V30 0XXXVX33XX 0XVX0XV03V0X33XV0XX3 VVV33033030V0XV300V3 X0XXXX0V3X 0VV3VXV30VVVXVVVXXXV 0333X300VV V00VX333VV XVX0X3330VVVVV0XXXV0VVV3XV330X 333VX0VV3V X0V0XV3VV3 XV00X03XVX XV0V0X330VV0XXX3X3X00X00V3XVVX VV3X0VVV3X XVXOXXVOVV 3V0330XV00XVV3VX3333 V3VVX0XVVV
【权利要求】
1.一种狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株，其特征在于，所述狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株表达编码突变糖蛋白，并且所述突变糖蛋白具有下列突变: 信号肽第2位的氨基酸缺失； 信号肽的第3位的氨基酸缺失； 第333位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸； 缺失Psi假基因区； 所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。
2.根据权利要求1所述的狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株，其特征在于，所述突变糖蛋白具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列。
3.根据权利要求1所述的狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株，其特征在于，所述突变株的基因组中包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
4.一种制备权利要求1-3任一项所述的狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株的方法，其特征在于，包括: (1)利用表达载体对宿主细胞进行转染； (2)对步骤(1)中所得到的经过转染的宿主细胞进行培养； (3)对步骤(2)中所得到的 培养物进行过滤，以便获得所述狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株， 其中， 所述表达载体携带第一核酸分子，所述第一核酸分子编码突变糖蛋白，并且所述突变糖蛋白具有下列突变: 所述信号肽第2位的氨基酸缺失； 所述信号肽的第3位的氨基酸缺失； 第333位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸； 缺失Psi假基因区； 所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述突变糖蛋白具有SEQID N0:1所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一核酸分子具有SEQID N0:2所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求4所示的方法，其特征在于，所述第一核酸分子的5’端连接有编码锤头状核酶的核酸分子，所述第一核酸分子的3’端连接有编码丁型肝炎核酶的核酸分子。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，将所述表达载体与辅助载体对所述宿主细胞进行共转染，其中，所述辅助载体包括: 第一载体，所述第一载体携带N基因序列； 第二载体，所述第二载体携带P基因序列； 第三载体，所述第三载体携带L基因序列；以及 第四载体，所述第四载体携带编码T7RNA聚合酶的核酸分子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述表达载体和所述第一至第四载体均为pBlue质粒。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为BHK-21细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，包括: 将BHK-21细胞于10%的新生牛血清的MEM完全培养基中培养至6孔板90%汇合度时；用4ug/孔的表达载体和第一载体、第二载体、第三载体以及第四载体脂质体2000法对所述BHK-21细胞进行共转染；将经过所述共转染后的BHK-21细胞置于5%的CO2培养箱中并于37°C的温度下培养4-6小时后弃掉上清液；补加5%的所述新生牛血清的MEM完全培养基，并置于5%的CO2培养箱中于37°C的温度下培养72小时，将细胞冻融3次，离心收集上清液并采用0.22um的滤膜进行过滤，以便获得所述狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株， 其中，所述表达载体为pBlueERA ； 所述第一载体为PBlueN (2ug/孔)，所述第二载体为pBlue P (lug/孔)，所述第三载体为pBlueL(lug/孔),所述第四载体为pT7 (2ug/孔)。
12.—种狂犬病活疫苗，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株 。
【文档编号】A61P31/14GK103881985SQ201410056860
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】李耀东, 刘俊生, 刘延亭, 郑杰, 熊炜, 高杨 申请人:北京中联康生物科技有限公司