用于疫苗的草肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包括用于预防或治疗房尘螨过敏症的肽的组合物，并且特别涉及用于预防或治疗所述过敏症的肽的最佳组合。
【专利说明】用于疫苗的草肽
[0001] 本申请是申请日为2010年2月5日，申请号为201080006665.3，发明名称为“用于疫苗的草肽”的申请的分案申请。
_2] 通过引用并入
[0003]以下优先权申请的内容在此通过引用并入:于2009年2月5日提交的英国专利申请第0901928.2号，于2009年2月5日提交的英国专利申请第0901927.4号，于2009年7月20日提交的英国专利申请第0912578.2号，于2009年8月14日提交的国际专利申请第PCT/GB09/01995号和于2009年10月12日提交的英国专利申请第0917871.6号。
发明领域
[0004]本发明涉及用于预防或治疗草过敏症的组合物。
_5] 发明背景
[0006]T细胞抗原识别需要抗原呈递细胞(APC)在其细胞表面上呈递与主要组织相容性复合物(MHC)的分子缔合的抗原片段(肽)。T细胞使用其抗原特异性T细胞受体(TCR)来识别由APC呈递的抗原片段。这样的识别作为免疫系统的触发器起作用来产生一系列应答以根除已被识别的抗原。
[0007]生物体如人类的免疫系统对外部抗原的识别可在某些情况下造成疾病，其被称作特应性疾患。后者的实例是过敏性疾病，包括哮喘、特应性皮炎和过敏性鼻炎。在这一组疾病中，B淋巴细胞产生对外源产生的抗原结合的IgE类抗体(在人类中)，所述抗原在本文称为过敏原，因为这些分子引发过敏响应。过敏原特异性IgE的产生依赖于也被过敏原活化(并对其有特异性)的T淋巴细胞。借助于诸如嗜碱性粒细胞和肥大细胞等细胞对IgE表面受体的表达，过敏原特异性的IgE抗体结合到这些细胞表面。
[0008]过敏原对结合在表面的IgE分子的交联造成这些效应细胞脱粒，导致炎症介质诸如组胺、5-轻色胺和脂质介质如硫桥白三烯(sulphidoleukotriene)的释放。除了 IgE依赖性事件，某些过敏性疾病诸如哮喘的特征为IgE独立性事件。
[0009]目前用提供症状缓解或预防的剂来治疗IgE介导的过敏性疾病。这种剂的实例是抗组胺剂、β 2激动剂和糖皮质类固醇。此外，通过包括过敏原成分或提取物的定期注射的去敏化程序来治疗一些IgE介导的疾病。去敏化治疗可诱导与IgE竞争过敏原的IgG响应，或可诱导阻断针对过敏原的IgE的合成的特定抑制性T细胞。这种形式的治疗不是总有效，并且具有激起严重副作用特别是一般过敏性休克的风险。这可以是致命的，除非立即意识到并用肾上腺素治疗。将减少或消除针对特定过敏原的不想要的过敏-免疫应答而不改变对其它外来抗原的免疫反应性或触发本身过敏响应的治疗性处理将对过敏个体大有益处。
[0010]普遍认为，草过敏原是包括哮喘、过敏性鼻炎和过敏性皮炎在内的人类和动物过敏性疾病的主要原因。存在于草花粉中的蛋白是尤其重要的。例如，约90%的干草热患者对草花粉过敏。干 草热是一种形式的季节性过敏症的统称，其特征是打喷嚏、流鼻涕和眼睛发痒。术语“干草热”源于该形式的变应性疾病在“割干草季节”中最为流行，该季节与许多草的花期相应，此时禾本植物释放最大量的花粉。其在夏季尤其流行，通常从5月末到8月末(在北半球)。
[0011]在美国，据计算干草热对于成人是第五位的主要慢性病并是缺勤的主要原因，这导致每年失去或减少近4百万个工作日，导致总生产力损失方面超过$7亿的总损失。过敏症还是儿童中最常报道的慢性病症，对于40%以上的儿童，限制了其活动。每年，过敏症在美国导致了 17，000，000次以上的门诊就诊；这些过敏症就诊的一半以上是因诸如干草热的季节性过敏症导致的。
[0012]因此治疗性或预防性治疗将对患有草过敏症的人或处于患草过敏症的风险的人具有极大益处。
[0013]发明概沭
[0014]通常将草花粉过敏原分组，在每一组中绝大多数物种表达至少一种花粉过敏原。组的例子包括:
[0015]-组I草花粉过敏原,其包括,例如,来自黑麦草(Loliumperenne)的蛋白Lol pi和来自猫尾草(Phleum pratense)的蛋白Phl pi ;和
[0016]-组5草花粉过敏原，其包括，例如，来自黑麦草的蛋白Lolp5a和蛋白Lol p5b，来自猫尾草的蛋白Phl p5,和来自狗牙根(Cynodon dactylon)的蛋白Cyn d5。
[0017]本发明人已发现，来源于草物种的花粉中的主要过敏原的某些肽片段在使得个体对这些过敏原的去敏化中尤其有用。已筛选了本发明的多肽组合结合许多MHC II类分子的能力，和以极小的组胺释放引起T细胞增殖的能力。因此可将本发明的组合物、产物、载体和制剂提供给个体以通过免疫耐受作用(tolerisation)来预防或治疗过敏症。
[0018]通过使用预测肽-MHC相互作用的计算机模拟分析和MHC II类结合分析，选择作为MHC II类-结合T细胞表位的本发明的肽。通过同源性来鉴定另外的表位。在体外T细胞响应分析的基础上对本发明的肽和肽组合进行进一步选择。
[0019]然而，本发明的肽组合通过靶向多种不同MHC分子而提供对人类人群覆盖面广泛的效力。因此，以本发明的肽配制的疫苗将具有广泛的应用。
[0020]本发明人的工作产生了具有以下特征的肽组合:
[0021]-该组合结合许多不同MHCII类分子
[0022]-该组合在草过敏个体中显著刺激细胞因子释放
[0023]-该组合的肽不引起显著的组胺释放。
[0024]从广泛分析的草表位序列中选择肽组合物以鉴定在草过敏个体中具有特别良好的MHC结合性质和细胞因子响应特征的核心肽。该组合可包括三个这样的肽的核心，其中每一个选自最普遍的草，猫尾草、黑麦草和狗牙根。该组合可包括四种这样的肽的核心，这些肽中的每一种选自在肽的相互组合中表现为特别有效的肽。[0025]以这种方式提供肽的核心组，其包括代表三种最普遍的草的多肽的核心组，优选同一组合中的四种或多种不同的单独的多肽提供各种MHC结合表位，并从而构建冗余性以允许MHC的多态性性质。提供本发明的核心组，优选具有特别良好的MHC结合性质和细胞因子响应特征的四种或多种不同的单独的多肽提供了多种T细胞表位，允许为了诱导免疫耐受性而募集宽泛范围的T细胞特异性。因此，本发明的组合物具有超越使用单独多肽的有利额外作用。本发明人也已证明:通过细胞因子响应测量，本发明的组合物能够提供对多态性研究群体的极高覆盖。[0026]因此，本发明第一方面提供了适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，该组合物包括:
[0027](a )多肽 TM)7B (KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE)、Tinfl4A (WGAIWRIDIPDH,),Tiffl07G (FKVMTMNAAPANDK)、或其任何一种的变体中的至少一种；
[0028](b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED),Ber02 (FIPMKSSffGA),Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B (KDSDEFIPMKSSWGAIWR)、或其任何一种的变体中的至少一种；和
[0029](c)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK),Rye09B (PEVKYAVFEMLIMIT)、Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C (NAGFKAAVMMNAPPK)、或其任何一种的变体中的至少一种，
[0030]其中所述变体是:
[0031]I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相应多肽的序列，或
[0032]II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列具有至少65%同源性的序列，该序列能够使得免疫耐受所述相应多肽；或
[0033]III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应的多肽。
[0034]在一些实施方案中，所述组合物可包括:a)多肽Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其变体，b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其变体，和 c)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其变体。
[0035]在一些实施方案中，所述组合物还可包括以上先前未选择的一种或多种多肽或其变体，所述多肽为如表2至4中所示的SEQ ID NOl至73中的任何一种。
[0036]在一些实施方案中，其中所述组合物:
[0037]-能够使得群体中的一组草花粉过敏性个体的至少50%或至少60%免疫耐受，和/或
[0038]-可包括至少一种另外的多肽，最多总共14种不同的多肽，其中所述另外的多肽:(a)包括与SEQ ID NO:1至73的任何一种中的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65%序列同一性、在以上未选择的序列jP(b)长度为9至30个氨基酸。
[0039]在一些实施方案中，所述组合物可包括至少一种所述多肽，其长度为9-20个氨基酸或13-17个氨基酸。
[0040]在一些实施方案中，所述组合物可包括如表7中所列的组合I至10中的任何一个的多肽，其中任选地一种或多种所述多肽可被I (I)或(II)中所定义的其变体所替代。
[0041]在一些实施方案中，所述组合物可包括以下多肽:(a) Tim07Bl(KKIPAGELQIIDKIDA) ；(b) BerOl (SGKAFGAMAKKGQED) ；(c)Bio04A (LKKAVTAMSEAEK) ；(d)Rye09BI(KPEVKYAVFEAALTKAIT)；(e)Ber02(FIPMKSSffGA)；(f)Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)；和(g)Bio02A (KYDAYVATLTEALR)o
[0042]在一些实施方案中，其中所述多肽的一种或多种可具有选自以下的一种或多种修饰:(i ) N末端乙酰化；(ii ) C末端酰胺化；(iii )精氨酸和/或赖氨酸的侧链胺上的一个或多个氢被亚甲基基团所取代；(iv)糖基化；和(0磷酸化。[0043]在一些实施方案中，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶的，从而其可包括:(i)在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端:一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的N末端紧接的两个至六个连续氨基酸相对应；和/或(ii)在T细胞表位侧翼的肽的残基的C末端:一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的C末端紧接的一个至六个连续氨基酸相对应在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端和C末端，选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一个氨基酸，其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度，所述T细胞表位具有小于3.5mg/ml的溶解度。
[0044]在一些实施方案中，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶的，从而可以另外地:(i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸残基被丝氨酸或2-氨基丁酸替代；和/或(ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的至多三个氨基酸中的、不包含在T细胞表位中的疏水性残基；和/或(iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的最多四个氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T细胞表位中的任何两个连续氨基酸，和/或(iv)在N末端和/或C末端添加了一个或多个带正电荷的残基。
[0045]在一些实施方案中，其中每种多肽可具有0.03至200nmol/ml、0.3至200nmol/ml、50至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范围中的浓度。
[0046]本发明第二方面还包括适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，该组合物包括至少四种不同的选自以下的多肽:
[0047](a) Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其变体；
[0048](b) BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其变体；
[0049](c) Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其变体；
[0050](d) Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)或其变体；
[0051](e) Ber02 (FIPMKSSffGA)或其变体；
[0052](f) Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)或其变体；
[0053](g) Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)或其变体；和
[0054](h) Bio02A (KYDAYVATLTEALR)或其变体；
[0055]其中所述变体是:
[0056]I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列，或
[0057]II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)至(h)中指定的相应多肽的序列具有至少65%同源性的序列，该序列能够使得免疫耐受所述相应多肽；或
[0058]III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应的多肽。
[0059]在一些实施方案中，所述组合物可包括:(a)多肽Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其变体；(b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02 (FIPMKSSffGA)和 Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)、或其任何一种的变体中的至少一种；和(c)多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)、ye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)、Bio02A (KYDAYVATLTEALR)和 Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、或其任何一种的变体中的至少一种；和(&)以上未选择的b)或c)的至少一种另外的多肽。
[0060]在一些实施方案中，所述组合物可包括多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其变体、多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其变体、多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其变体，和以上未选择的b)或c)的至少一种另外的多肽。
[0061]在一些实施方案中，所述组合物还可包括以上先前未选择的一种或多种多肽或其变体，所述多肽为如表2至4中所示的SEQ ID NOl至73中的任何一种。
[0062]在一些实施方案中，其中所述组合物:
[0063]-能够使得群体中的一组草花粉过敏性个体的至少50%或至少60%免疫耐受，和/或
[0064]-可包括至少一种另外的多肽，最多总共14种不同的多肽，其中所述另外的多肽:(a)包括与SEQ ID NO:1至73的任何一种中的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65%序列同一性、在以上未选择的序列jP(b)长度为9至30个氨基酸。
[0065]在一些实施方案中，所述组合物可包括至少一种所述多肽，其长度为9-20个氨基酸或13-17个氨基酸。
[0066]在一些实施方案中，所述组合物可包括如表7中所列的组合I至10中的任何一个的多肽，其中任选地一种或多种所述多肽可被I (I)或(II)中所定义的其变体所替代。
[0067]在一些实施方案中，所述组合物可包括以下多肽:(a) Tim07Bl(KKIPAGELQIIDKIDA) ；(b) BerOl (SGKAFGAMAKKGQED) ；(c)Bio04A (LKKAVTAMSEAEK) ；(d)Rye09BI(KPEVKYAVFEAALTKAIT)；(e)Ber02(FIPMKSSffGA)；(f)Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)；和(g)Bio02A (KYDAYVATLTEALR)o
[0068]在一些实施方案中，其中所述多肽的一种或多种可具有选自以下的一种或多种修饰:(i) N末端乙酰化；(ii) C末端酰胺化；(iii)精氨酸和/或赖氨酸的侧链胺上的一个或多个氢被亚甲基基团所取代；(iv)糖基化；和(0磷酸化。
[0069]在一些实施方案中，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶的，从而其可包括:(i)在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端:一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的N末端紧接的两个至六个连续氨基酸相对应；和/或(ii)在T细胞表位侧翼的肽的残基的C末端:一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的C末端紧接的一个至六个连续氨基酸相对应在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端和C末端，选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一个氨基酸，其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度，所述T细胞表位具有小于3.5mg/ml的溶解度。
[0070]在一些实施方案中，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶的，从而可以另外地:(i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸残基被丝氨酸或2-氨基丁酸替代；和/或(ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的至多三个氨基酸中的、不包含在T细胞表位中的疏水性残基；和/或(iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的最多四个氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T细胞表位中的任何两个连续氨基酸，和/或(iv)在N末端和/或C末端添加了一个或多个带正电荷的残基。
[0071]在一些实 施方案中，其中每种多肽可具有0.03至200nmol/ml、0.3至200nmol/ml、50至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范围中的浓度。[0072]本发明第三方面提供了一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，所述组合物包括至少一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列在表达时导致如前述所定义的组合物的产生。
[0073]本发明第四方面提供了一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的载体，所述载体包括四种或多种多核苷酸序列，每种所述多核苷酸序列编码如前述所定义的不同的多肽。
[0074]本发明第五方面提供了一种产物，所述产物包括:(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim04A (WGAIffRIDTPDKL), Tim07G(FKVAATAANAAPANDK)、或其任何一种的如本发明第一方面(I)或(II)中所定义的变体；(b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02 (FIPMKSSffGA), Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一种的如本发明第一方面(I)或(II)中所定义的变体中的至少一种；和((3)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)、Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)和Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C (NAGFKAAVAAAANAPPK)、或其任何一种的如本发明第一方面(I)或(II)中所定义的变体中的至少一种，其中每种不同的多肽是供同时地、分别地或顺序地用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症。
[0075]本发明第六方面提供了一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的药物制剂，所述药物制剂包括前述的组合物；本发明第四方面所述的载体；或本发明第五方面所述的产物；和药学上可接受的运载体或稀释剂。
[0076]在一些实施方案中，所述组合物、载体或产物可被配制为用于口服施用、局部施用、鼻内施用、皮下施用、舌下施用、皮内施用、口腔施用、表皮或贴剂施用、或用于通过吸入或通过注射施用。
[0077]在一些实施方案中，前述组合物或本发明第五方面所定义的产物可另外地包括另外的多肽过敏原，用于使个体免疫耐受所述另外的多肽过敏原。
[0078]本发明第七方面提供了一种确定T细胞是否识别如本发明第一和第二方面所定义的组合物的体外方法，所述方法包括将所述T细胞与所述多肽接触并检测所述T细胞是否被所述多肽刺激。
[0079]在一些实施方案中，可进行所述方法以确定个体是否患有草花粉过敏症或处于患草花粉过敏症的风险中。
[0080]本发明的组合物通常能够使得群体中一组草花粉过敏性个体的至少50%或至少60%免疫耐受，和/或包括至少一种另外的多肽，最多总共14种多肽，其中所述另外的多肽:(a)包括与以下所描述的SEQ ID NO:1至73的任何一种中的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65%序列同一性的序列；和(b)长度为9至30个氨基酸。
[0081]本文提及的序列的描述
[0082]SEQ ID NO:1至73提供如表2至4列出的本发明的多肽序列。SEQ ID N0.1至27对应于来自组I草过敏原的肽。SEQ ID N0.28至73对应于来自组5过敏原的肽。
[0083]发明详沭
[0084]本发明涉及可用于免疫耐受作用的肽。这样的肽可来源于本文所描述的任何草过敏原或是如以下所描述的其变体。与基于肽免疫作用的去敏化方法相关的困难是:如何选择过敏原的适当的大小和区域以作为用于免疫作用的肽的基础。选择的肽的大小是关键的。如果肽过小，疫苗可能不会有效诱导免疫应答。如果肽过大，或如果将全抗原导入到个体中，存在诱导有害反应的风险，比如过敏性反应，这可能是致命的。
[0085]已经选择本发明的肽以保留T细胞特异性，而同时尺寸足够小以不具有显著的三级结构，这将使其能够保留完整分子的IgE结合表位的构象。因此本发明的多肽不会引起细胞上邻近特异性IgE分子的显著性交联且因此不会导致显著的组胺释放，所述细胞比如肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
[0086]本发明的优势是肽能够宽泛地靶向主要组织相容性复合物(MHC)分子的能力。T细胞受体(TCR)的特异性是高度可变的。如抗体分子一样，通过细胞内的基因重组事件产生了可变性。TCR识别与由主要组织相容性复合物(MHC)的基因编码的分子结合的短肽形式的抗原。这些基因产物是同样的分子，产生用于移植的“组织类型”，且还被称为人类白细胞抗原分子(HLA)，这些术语可被互换地使用。单独的MHC分子具备肽结合沟，由于它们的形状和电荷其只能够结合有限的一组肽。被一个MHC分子结合的肽可能不一定被其它MHC分子结合。
[0087]当蛋白分子诸如抗原或过敏原被抗原呈递细胞诸如B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞吸收时，该分子在细胞中被酶促降解。降解过程产生所述分子的肽片段，如果它们具有合适的大小、电荷和形状，则可能结合到某些MHC分子的肽结合沟之内，并随后展示在抗原呈递细胞表面上。如果肽/MHC复合物以足够数量呈递在抗原呈递细胞表面上，则它们可能活化带有合适的肽/MHC特异性T细胞受体的T细胞。
[0088]由于MHC的多态性质，远系繁殖群体诸如人类中的个体将在其细胞表面上表达不同组合的MHC分子。由于不同MHC分子可基于肽的大小、电荷和形状而结合来自同一分子的不同肽，不同个体将展示与其MHC分子结合的不同库的肽。鉴定远系繁殖群体诸如人类中的通用MHC-结合肽表位比在近亲繁殖的动物(诸如实验小鼠的某些品系)中更困难。基于个体之间MHC的差异表达以及其带来的肽结合与呈递的固有差异，不太可能鉴定可用于人类去敏化治疗的单种肽。
[0089]如以下所讨论的，本发明通过提供基于一种以上的肽的组合物，即肽组合，而解决该问题。这些组合以肽的核心组为基础，这些肽当被单独检验时，实验上鉴定为在草过敏性患者中表现出令人惊奇地强的响应，且当以组合来提供时，响应尤其强。当肽的这些核心亚组被包括在草肽疫苗中时具有有利的性质。
[0090]核心组可包括至少一种来源于猫尾草的肽，至少一种来源于黑麦草的肽和至少一种来源于狗牙根的肽，每种肽显示了特别良好的单独的响应特性。将这些肽包括在组合中允许覆盖三种最普遍的草，并且如以下所进一步讨论地，通过同源性另外扩及覆盖其它的草。
[0091]另外，核心组可包括至少四种肽，该肽选自在检验的组中具有高等级的单独响应特性且被进一步证明当一起组合来提供时为草疫苗提供最优响应特性的肽。
[0092]这样的肽组合优选地包括至少一种来源于组I草过敏原的肽或其变体和至少一种来源于组V草过敏原的肽或其变体。草过敏原分类为组I草过敏原和组V草过敏原是技术人员所熟知的，且在本文中被进一步讨论。优选的组I草过敏原是狗牙根过敏原，Cyndl。优选的组V过敏原是黑麦草过敏原，Lol p5。在一些实施方案中，本发明涉及包括至少一种来源于Cyn dl的肽或其变体和至少一种来源于Lol p5的肽或其变体。基于Cyn dl肽和Lol p5肽或它们的变体的组合的组合物在以下被进一步讨论。
[0093]本发明的优选的肽可包括SEQ ID NO:1至73的任何一个中所示的序列，可由SEQID NO:1至73的任何一个中所示的序列组成，或可基本上由SEQ ID NO:1至73的任何一个中所示的序列组成。这些特定肽的变体也可被使用。变体可包括作为SEQ ID N0:1至73的任何一个的片段或SEQ ID NO:1至73的任何一个的同源物的序列，可由作为SEQ ID NO:1至73的任何一个的片段或SEQ ID NO:1至73的任何一个的同源物的序列组成，或可基本上由作为SEQ ID NO:1至73的任何一个的片段或SEQ ID NO:1至73的任何一个的同源物的序列组成。
[0094]这样本发明提供了适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，该组合物包括:
[0095]Ca)多肽 TimO7B (KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim04A(WGAIffRIDTPDKL), Tim07G (FKVAATAANAAPANDK)、或其任何一种的变体中的至少一种；
[0096](b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED),Ber02 (FIPMKSSffGA),Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一种的变体中的至少一种；
[0097](c )多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK),Rye09B (PEVKYAVFEMLIMIT)、Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY), Rye05C (NAGFKAAVMMNAPPK)、或其任何一种的变体中的至少一种，
[0098]其中所述变体是:
[0099]I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相应多肽的序列，或
[0100]II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列具有至少65%同源性的序列，该序列能够使得免疫耐受所述相应多肽；或
[0101]III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应的多肽。
[0102]a)至c)的其它优选的变体是:
[0103]i)具有9至30个氨基酸的长度且包括由以下组成的区域的多肽:
[0104]-a)至c)的对应序列中的任何一种，或
[0105]-与a)至c)的对应序列中的任何一种具有至少65%同源性的序列，该序列能够使个体免疫耐受a)至c)的序列中的任何一种，或
[0106]ii)具有9至30个氨基酸的长度且包括由代表以下任何一种的序列组成的区域的多肽:
[0107]-a)至c)的序列中的任何一种的片段，或
[0108]-a)至c)的序列中的任何一种的片段的同源物，
[0109]所述序列能够使个体免疫耐受a)至c)的序列中的任何一种，且具有至少9个氨基酸的长度，且其中所述同源物与a)至 c)的序列中的任何一种中的任何9个连续氨基酸具有至少65%的同源性；其中任选地，四个多肽中无一是由a)至c)的任何一个所定义的同一原始序列的变体。[0110]因而组合物至少包括三种多肽，第一多肽是a)的多肽或其变体，第二多肽是b)的多肽或其变体，第三多肽是c)的多肽或其变体。这样，例如组合物可包括Tim07B的变体、BerOl、和Rye09B的变体。优选地，以上组合物除核心三种多肽之外包括a)、b)或c)或其任何一个的变体的第四多肽。组合物可包括a)、b)或c)或其变体的四种、五种、六种、七种、八种或以上的多肽。
[0111]在一些方面，组合物可包括a)或其变体的两种、三种、四种或更多种多肽。在另外的方面，组合物可包括b)或其变体的两种、三种、四种或更多种多肽。在其它的方面，组合物可包括c)或其变体的两种、三种、四种、五种、六种或更多种多肽。这些选择以组合物包括a)或其变体的至少一种多肽、b)或其变体的至少一种多肽为条件。选自组a)、b)和c)的三种多肽的优选的组合是多肽Tim07B或其变体、多肽BerOl或其变体、和多肽Bio04A或其变体。
[0112]组合物可包括至少两种选自组a)或其变体的多肽，至少两种选自组b)或其变体的多肽和至少两种选自组c)或其变体的多肽。
[0113]优选的组合物可包括多肽Tim07B或其变体、和至少两种、三种或四种选自组b)或其变体的多肽。该优选的组合物可包括两种或三种选自组c)或其变体的多肽，优选地包括Bio04A或其变体。另一个优选的组合物可包括多肽Tim07B或其变体、和至少两种、三种或四种选自组c)或其变体的多肽。该优选的组合物可包括两种或三种选自组b)或其变体的多肽，优选地包括BerOl或其变体。
[0114]基于a)至c)的以上所有组合物可包括选自SEQ ID NOl至74的任何一个或其变体、且先前根据a)至c)未选择的另外的多肽。
[0115]本发明还提供了适宜于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，该组合物包括至少四种不同的选自以下的多肽:
[0116](a) Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其变体；
[0117](b) BerOI (SGKAFGAMAKKGQED)或其变体；
[0118](c) Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其变体；
[0119](d) Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)或其变体；
[0120](e) Ber02 (FIPMKSSffGA)或其变体；
[0121](f) Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)或其变体；
[0122](g) Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)或其变体；和
[0123](h) Bio02A (KYDAYVATLTEALR)或其变体；
[0124]其中所述变体是:
[0125]I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列，或
[0126]II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)至(h)中指定的相应多肽的序列具有至少65%同源性的序列，该序列能够使得免疫耐受所述相应多肽；或
[0127]III)长度为9至30 个氨基酸的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列中的至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应的多肽。
[0128]a)至h)的其它优选的变体是:[0129]i)具有9至30个氨基酸的长度且包括由以下组成的区域的多肽:
[0130]-a)至h)的对应序列中的任何一种，或
[0131]-与a)至h)的对应序列中的任何一种具有至少65%同源性的序列，该序列能够使个体免疫耐受a)至h)的序列中的任何一种，或
[0132]ii)具有9至30个氨基酸的长度且包括由代表以下任何一种的序列组成的区域的多肽:
[0133]-a)至h)的序列中的任何一种的片段，或
[0134]-a)至h)的序列中的任何一种的片段的同源物，
[0135]所述序列能够使个体免疫耐受a)至h)的序列中的任何一种，且具有至少9个氨基酸的长度，且其中所述同源物与a)至h)的序列中的任何一种中的任何9个连续氨基酸具有至少65%的同源性；其中任选地，四种多肽中无一是由a)至h)的任何一种所定义的同一原始序列的变体。
[0136]因而组合物至少包括四种多肽，所述四种多肽中的每一种选自a)至h)的多肽或其变体。以上组合物可包括a)至h)或其任何一种的变体的另外的多肽，比如a)至h)或其变体的五种、六种、七种、八种或更多种多肽。
[0137]在一些方面，组合物可包括a)或其变体的多肽，至少一种选自b)、e)或f)或其任何一种的变体的多肽，和至少一种选自c)、d)、g)或h)或其变体的多肽。可选地，组合物可优选地包括a)或其变体的多肽、和至少两种或三种选自b)、e)或f)或其任何一种的变体的多肽。该组合物可优选地包括多肽BerOl或其变体。在另一个实施方案中，组合物可包括a)或其变体的多肽和至少两种、三种或四种选自c)、d)、g)或h)或其任何一种的变体的多肽。该组合物可优选地包括多肽Bio04A或其变体。
[0138]所有这些组合物可优选地包括多肽Tim07B或其变体，多肽BerOl或其变体，和多肽Bio04A或其变体。
[0139]以上选自a)至h)的组合物优选地包括a)至h)的至少四种不同的多肽或包括至少四种变体，所述变体的每一种对应于a)至h)的不同的原始或基线序列。这样，该组合物通常以起源的四种不同的表位序列为基础来选择。优选地，该组合物包括狗牙根起源的至少一种表位序列，黑麦草起源的至少一种表位序列和猫尾草起源的至少一种表位序列。相关表位序列可选自SEQ ID NOl至74中的任何一种或其变体。
[0140]基于a)至h)的以上所有组合物可因而包括选自SEQ ID NOl至74的任何一种或其变体、且先前根据a)至h)未选择的另外的多肽。所有选择以该组合物包括至少四种选自a)至h)或其变体的多肽为条件。
[0141]任选地，本文所描述的特定多肽的任何组合物可包括另外的多肽而最多总共14种独特的多肽。另外的多肽通常与不在已选择的多肽中的其它序列，即SEQ ID NO:1至73相关(即，通常为其同源物和/或其片段)。另外的肽通常是SEQ ID NO:1至73的肽中其一的功能性变体。另外的肽可以与SEQ ID NO:1至73中的任何一种相同。因此该组合物可包括最多十四种不同的多肽，所述多肽如SEQ ID NO:1至73中任何一种所提供的，以至少一种多肽选自如上所定义的(a)和(b)的每种为条件。然而，任选的另外的多肽不需要与SEQ ID NO:1至73的任何一种100%相同。它们优选地与SEQ ID NO:1至73的任何一种中的至少9个(例如至少10、11、12或13个)或更多个连续氨基酸至少65%相同，而非在选自(a)和(b)的每一种的至少一种多肽中已选择的。这些连续氨基酸可包括MHC II类表位，例如其与本文所述的MHC分子中的任何一种相结合。
[0142]本发明还提供了用于通过免疫耐受来预防或治疗草过敏症、包括本发明的多肽的产物和制剂，和包括能够表达本发明的多肽的多核苷酸的组合物、产物和载体。所述免疫耐受通常将针对SEQ ID NO:1至74中任何一种中存在的表位(例如MHC II类-结合的T细胞表位)。
[0143]草物种
[0144]草物种黑麦草(Loliumperenne)、猫尾草(Phleum pratense)和狗牙根(Cynodondactylon)在世界范围造成高比例的草过敏症，尤其是与草花粉相关的过敏症，比如干草热。其它重要的草物种包括绒毛草(Holcus Ianatus)、鸭茅(Dactylis glomerata)、加那利草(Phalaris canariensis)和草地早熟禾/肯塔基蓝草(草地早熟禾(Poa pratensis))。
[0145]黑麦草是世界上最常见的草之一，并广泛用作动物饲料的来源。其原产于欧洲，但已被引进到世界所有大陆上，并且在所有温带都是常见的。其花期可贯穿整个夏季，但在北半球通常在5月到7月之间。黑麦草良好适应于温和、湿润的温带气候，并且在相对粘重、肥沃、滋润的土地上生长得最好。其在充分施肥的具有足够水分的轻质土壤上也生长良好。其不喜阴且需要排水良好的土壤。黑麦草通常生长于土壤PH在从约6到约7的范围内的位置处，但其可耐受从约4.5到约8.5的范围,优选地年降水量在约21到约180cm的范围。
[0146]猫尾草是世界上另一种最常见的草，并且是动物饲料的首要来源。其原产和分布于欧洲、北非和亚洲北部的大部分。其已被引进到北美和南美、南非和澳洲并在那里广泛分布。猫尾草通常生长于年降水量在约35到约180cm的范围、年平均温度在约4到约22°C的范围和土壤pH为约4.5到约8的位置。其良好适应于凉的、湿润的温带气候，在粘重的、深层的和湿润的土壤或甚至湿地上生长得最好。生长的最佳温度在18-21°C间变化，且昼/夜温度为15/10°C和21/15°C。猫尾草花期通常限于初夏且猫尾草花粉是这个季节中草过敏症的主要原因。在研究中，已发现达21%的患有过敏性鼻炎或其它症状的患者对猫尾草花粉响应。
[0147]狗牙根通常生长于年降水量为约9至约429cm、年平均温度范围为约5到约28°C和土壤pH在约4到约8.5，优选地约6到约7的范围的位置。狗牙根花期通常在夏末(北半球的8月到10月)。狗牙根植物产生大量的花粉且因此是干草热的主要原因。还已报道狗牙根植物导致接触性皮炎。狗牙根在世界范围广泛生长，主要在温暖的气候中，且通常发现于约北纬30°到约南纬30°的纬度之间。
[0148]组I和组5草花粉过敏原的肽片段
[0149]主要的草过敏原包括组I草花粉过敏原和组5草花粉过敏原。将来自不同物种的蛋白根据氨基酸序列同源性分组。例如，组I主要草花粉过敏原包括猫尾草蛋白Phl Pl和黑麦草蛋白Lol pl，组5主 要草花粉过敏原包括猫尾草蛋白Phl p5和黑麦草蛋白Lol p5。
[0150]本发明人已鉴定了某些草花粉过敏原蛋白中包括MHC II类结合T细胞表位的区域。本发明人也已证明，主要草花粉过敏原中对应于MHC II类结合T细胞表位的区域在给定的组中的代表之间是高度保守的，参见，例如，实施例2。基于该信息，来源于给定的组中的蛋白的相关区域的肽适宜于通过免疫耐受该组中的草过敏原而预防或治疗草过敏症。例如，来自，例如猫尾草的Phl pl或黑麦草的Lol pl的相关区域适用于通过免疫耐受组I草过敏原而预防或治疗草过敏症。
[0151]本发明的肽来源于组I (SEQ ID NO:1至27)和组5 (SEQ ID NO: 28至73)草过敏原。术语“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。以上的蛋白在本文中还被称作“过敏原”。
[0152]表2至4列出了本发明的肽的序列，指明了每种肽所来源的母体蛋白质。
[0153]当本发明的组合物包括四种或更多种选自a)至h)的多肽或其变体的多肽时，该组合物通常包括选自a) SEQ ID NO:1至27 ;和b) SEQ ID NO: 28至73的每一种的至少一种多肽或其变体(例如功能性变体)。该组合物可包括选自a)SEQ ID N0:l至27;和b)SEQID NO:28至73的每一种的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种多肽或其变体(例如功能性变体)。在一些实施方案中，该组合物可包括选自a)SEQ ID NO:1至10 ;和b)SEQ ID NO:28至52的每一种的至少一种多肽或其变体(例如功能性变体)。该组合物可包括选自a) SEQ ID NO:1至10 ;和b) SEQ ID NO: 28至52的每一种的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种多肽或其变体(例如功能性变体)。
[0154]如以上概述，因此，基于a)至h)的多肽或其变体的优选的组合物包括组合物中包括至少一种来源于Cyn dl或其变体的肽和至少一种来源于Lol p5或其变体的肽的那些组合物。特别优选的组合物是包括至少一种来源于Cyn dl或其变体的肽、至少一种来源于Lol p5或其变体的肽和至少一种来源于Phl p5的肽的那些组合物。在一些实施方案中，a)至h)的组合物可包括来源于Cyn dl或其变体的两种、三种、四种或更多种肽和/或来源于Lol p5或其变体的两种、三种、四种或更多种肽。在一些实施方案中，该组合物可由来源于Cyn dl和Lol p5或其变体的肽组成，或基本上由来源于Cyn dl和Lol p5或其变体的肽组成。在另一些实施方案中，该组合物任选地不包括来源于Lol pl或其变体的肽。
[0155]如上所讨论的，基于Cyn dl和Lol p5肽的组合物在草过敏症的治疗中特别有用。
[0156]本发明的特别优选的组合物包括:包括以下、由以下组成或基本上由以下组成的那些组合物:
[0157]a)如本文所定义的SEQ ID NO: 1、2和5的多肽或其变体中的至少一种；
[0158]b)如本文所定义的SEQ ID N0:28、29、31和46的多肽或其变体中的至少一种；和任选地
[0159]c)如本文所定义的SEQ ID NO:69的多肽或其变体。
[0160]这些组合物提供了特别优选的Cyn dl肽、特别优选的Lol p5肽、和任选地，特别优选的Phl p5肽。更优选地，该组合物包括如a)中所定义的至少两种或所有三种多肽，和如b)中所定义的至少两种或至少三种多肽。仍为优选地，该组合物包括如c)中所定义的多肽。特别优选地，组合物包括i) SEQ ID NO:1, ii) SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5中的一种；和 iii) SEQ ID NO:46。
[0161]具体的优选的组合物包括组合I至10，如表7中所列。在所述组合物中，SEQ IDNO: 1、2、5、28、29、31、46和69的单独的多肽的一种或多种可任选地替代其变体。在一些实施方案中，存在于组合I至10的SEQ ID N0:l、2、5、28、29、31、46和69的多肽中的两种、三种、四种、五种或更多种可被其变体替代。被其变体替代的多肽的数目通常取决于该组合物中所包括的多肽的总数目。例如，在基于四种多肽的组合(即，组合6、8、10)中，优选地仅有一种或两种多肽被其变体替代。可选地，包括选自SEQ ID N0:l、69、31、46、2、5、29、28、43、53、35、27、4和70的任何一种或其变体的四种或更多种多肽的任何组合物也是优选的。[0162]更优选的组合物包括SEQ ID NO: 1、2、5、28、31、91和93或其变体的多肽，由SEQID N0:l、2、5、28、31、91和93或其变体的多肽组成，或基本上由SEQ ID NO: 1、2、5、28、31、91和93或其变体的多肽组成。其它优选的组合物包括SEQ ID NO: 1、2、5、28、31、91和93、或替代这些多肽的一种、两种或三种、四种或更多种的它们的变体。在一些实施方案中，以上7种肽组合物不包括任何其它的多肽或不包括任何其它的来源于草过敏原的多肽。在优选的实施方案中，组合物包括SEQ ID N0:l、2、5、28、31、91和93或其变体，且不包含与本文所述的任何草物种的蛋白具有超过20%的同源性的任何另外的蛋白。以上组合物可包括另外的非肽组分，比如载体或佐剂。
[0163]本发明还提供了产物，所述产物包括以下:
[0164](a)多肽 Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim04A(WGAIffRIDTPDKL), Tim07G (FKVAATAANAAPANDK)、或如本文所描述的其任何一种的变体；
[0165](b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED),Ber02 (FIPMKSSffGA),Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR中的至少一种、或如本文所描述的其任何一种的变体;和
[0166](C)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK),Rye09B (PEVKYAVFEMLIMIT)和 Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C (NAGFKAAVAAAANAPPK)中的至少一种、或如本文所描述的其任何一种的变体，其中每种不同的多肽是供同时地、分别地或顺序地用于通过免疫耐受预防或治疗草花粉过敏症。
[0167]本发明的产物中的四种或更多种多肽可按照与通过免疫耐受作用而用于草过敏症的预防或治疗的本发明的组合物有关的以上所述的相同标准来选择。
[0168]变体
[0169]因此，本发明的组合物或产物可包括SEQ ID NO:1至73的任何一种的变体。变体通常包括存在于SEQ ID NO:1至73的相应的肽中的MHC II类表位的I个、2个、3个或更多个。
[0170]本文提到了功能性变体。该变体可能能够使个体免疫耐受存在于SEQ ID NO:1至59的相应的肽中的MHC II类表位，并因而其将通常包括与同样的MHC II类分子结合和/或被识别SEQ ID NO:1至73的多肽中相应的表位的T细胞所识别的序列。该序列因此能够使得免疫耐受天然多肽中相应的序列。因此变体多肽可使得免疫耐受相应的天然多肽。
[0171]SEQ ID N0:1至73的变体可以是通过截短衍生的片段，例如，通过从多肽的N末端和/或C末端去除一个或多个氨基酸。片段还可以通过一个或多个内部缺失来生成，条件是组成T细胞表位的核心9个氨基酸基本上不被破坏。
[0172]例如，SEQ ID NO:1的变体可包括SEQ ID NO:1的片段，即，较短序列。这可包括从SEQ ID NO:1的N-末端或从SEQ ID NO:1的C-末端缺失一个、两个、三个或四个氨基酸。这样的缺失可从SEQ ID NO:1的两端进行。SEQ ID NO:1的变体可包括延伸超出SEQID NO:1的末端的另外的氨基酸(例如来自衍生肽的亲本蛋白的序列)。变体可包括以上讨论的缺失和添加的组合。例如，可从SEQ ID NO:1的一端缺失氨基酸，但可在SEQ ID NO:1的另一端添加来自全长亲本蛋白序列的另外的氨基酸。以上变体的相同讨论还适用于SEQID NO:2 至 73。
[0173]变体肽可包括SEQ ID NO:1至73任一种或其片段的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。变体肽可包括与SEQ ID NO:1至73任一种中至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65%序列同一性的序列。更优选地，合适的变体可包括与SEQ ID NO:1至73任一种的至少9个连续氨基酸至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的氨基酸同一性。这一水平的氨基酸同一性可见于肽的任何区段，尽管它优选地是核心区域。氨基酸同一性的水平是超出至少9个连续氨基酸，但它可以是至少10、11、12、13、
14、15或至少16或17个氨基酸，这取决于比较的肽的大小。因此，任何以上指明的同一性水平可跨越序列的完整长度。
[0174]以与本发明的特别优选的肽的序列同一性为基础选择的优选变体的例子是:
[0175]BerOl (SEQ ID NO:1)的变体:SGKAFGAMAKKGEED (SEQ ID NO:74)，绒毛草 Hol11 ;草地早熟禾 Poa pl ；SGHAFGSMAKKGEED (SEQ ID NO: 75)，鸭茅 Dac gl ;黑麦草 Lol pl ；SGIAFGSMAKKGDED (SEQ ID NO: 76)，猫尾草 Phl pI, SGTAFGAMAKKGEEE (SEQ ID NO: 77)，玉米(Zea mays)Zea ml。
[0176]Bio02A (SEQ ID NO: 28)的变体:KYDAYVATLTESLR (SEQ ID NO: 78)，大麦(Hordeumvu I gar e) Hor v5 ；KYDAYVATLSEALR (SEQ ID NO: 79)，猫尾草 Phl p5;草地早熟禾 Poa p9 ；KYDAFVAALTEALR (SEQ ID NO:80)，鸭茅 Dac g5 ；KYDAFVTTLTEALR (SEQ ID NO:81)，绒毛草Hol 15。
[0177]BioO3A (SEQ ID NO:29)的变体:KFIPTLEAAVKQAYAA (SEQ ID NO:82)，鸭茅 Dacg5 ;薦草(Phalarus aquatica) Pha a5 ；KFIPALEAAVKQAYAA (SEQ ID NO:83)，猫尾草 Phlp5。
[0178]Tim07B(SEQ ID NO:69)的变体:KIPAGELQIVDKIDA (SEQ ID N0:84)，鸭茅 Dac g5 ；薦草 Pha a5 ；KIPTGELQIVDKIDA (SEQ ID NO:85)，黑麦草 Lol p5 ；KIPAGEQQIIDKIDA (SEQID NO:86)，草地早熟禾Poa p5。Tim07B在绒毛草Hol 15b中也是保守的。
[0179]Bio04A(SEQ ID N0:31)的变体:LKKAITAMSEAQK(SEQ ID NO:87)，猫尾草 Phl p5 ；绒毛草 Hol 15b ；LKKAITAMSQAQK (SEQ ID NO:88)，草地早熟禾 Poa p5。
[0180]Ber02C (SEQ ID NO:5)的变体:KESWGAIWRIDTPDK (SEQ ID N0:89)，薦草 Pha al ；猫尾草Phl pl。
[0181]Rye09B(SEQ ID N0:46)的变体:PQVKYAVFEAALTKAIT(SEQ ID NO:90)，猫尾草 Phlp5。
[0182]这样，SEQ ID NO:74至90是可作为以上天然肽的替代物用于本发明的组合物中的优选的变体。用于本发明的天然肽的其它优选变体来源于玉米过敏原。玉米过敏原与草花粉过敏原具有很近的同源性，且因此来源于玉米的序列可包含用于免疫耐受草花粉过敏原的交叉反应性表位。
[0183]关于氨基酸序列，“序列同一'丨生”是指当使用ClustalW (Thompson等人，1994,同前)用以下参数评价时具有指定值的序列:成对的比对参数-方法:准确，矩阵:PAM，缺口开放罚分:10.00，缺口延伸罚分:0.10 ;多比对参数-矩阵:PAM，缺口开放罚分:10.00，％延迟同一性:30，处罚末端缺口:开，缺口间距:0，负矩阵:不，缺口延伸罚分:0.20，残基特异性缺口罚分:开，亲水缺口罚分:开，亲水残基:GPSNDQEKR。在特定残基的序列同一性意在包括仅仅被衍生化的相同残基。
[0184]变体肽可包括SEQ ID NO:1至73任一种中的1、2、3、4、5或更多个或者多达10个氨基酸取代。取代变体优选地包括用相同数目的氨基酸代替一个或多个氨基酸并进行保守的氨基酸取代。例如，可用具有相似特征的替代性氨基酸例如，另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电荷氨基酸、另一亲水氨基酸、另一疏水氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸来取代氨基酸。可用于选择合适的取代基的20种主要氨基酸的一些特征如下:
[0185]
【权利要求】
1.一种适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，所述组合物包括:
(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE),Tim04A (WGAIWRIDTPDKL),Tim07G (FKVMTMNAAPANDK)、或其任何一种的变体中的至少一种；
(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)、Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一种的变体中的至少一种；和
(c )多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK), Rye09B (PEVKYAVFEMLTKAIT )、Bio02A (KYDAYVATLTEALR)、Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ),Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY),Rye05C (NAGFKAAVMMNAPPK)、或其任何一种的变体中的至少一种，其中所述变体是: I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相应多肽的序列，或 II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列具有至少65%同源性，且能够使得免疫耐受所述相应多肽的序列；或 III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应多肽。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包括: a)多肽 Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其变体， b )多肽 BerO I (SGKAFGAMAKKGQED )或其变体，和 c)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其变体。
3.一种适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，所述组合物包括至少四种不同的选自以下的多肽: (a)Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其变体； (b)BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其变体； (c)Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其变体； (d)Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)或其变体； (e)Ber02 (FIPMKSSffGA)或其变体； (f)Ber02C (KSSffGAIffRIDPKKPLK)或其变体； (g)Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)或其变体；和 (h)Bio02A (KYDAYVATLTEALR)或其变体； 其中所述变体是: I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列，或 II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)至(h)中指定的相应多肽的序列具有至少65%同源性，且能够使得免疫耐受所述相应多肽的序列；或 III)长度为9至30个氨 基酸的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应多肽。
4.根据权利要求3所述的组合物，所述组合物包括:(a)多肽 Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其变体；
(b )多肽 BerO I (SGKAFGAMAKKGQED )、Ber02 (FIPMKSSffGA)和 Ber02C( KSSffGAIffRIDPKKPLK)、或其任何一种的变体中的至少一种；和
(c )多肽 Bio04A( LKKAVTAMSEAEK)、ye09B( PEVKYAVFEMLTKAIT )、Bio02A( KYDAYVATLTEALR)和Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、或其任何一种的变体中的至少一种；和 Ca)以上未选择的b)或c)的至少一种另外的多肽。
5.根据权利要求4所述的组合物，所述组合物包括多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其变体、多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其变体、多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其变体，和以上未选择的b)或c)的至少一种另外的多肽。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包括以上先前未选择的一种或多种多肽或其变体，所述多肽为如表2至4中所示的SEQ ID NOl至73中的任何一种。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物: -能够使得群体中的一组草花粉过敏性个体的至少50%或至少60%免疫耐受，和/或 -包括至少一种另外的多肽，最多总共14种不同的多肽，其中所述另外的多肽: (a)包括与SEQID NO:1至73的任何一种中的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65%序列同一'丨生 、在以上未选择的序列；和 (b)长度为9至30个氨基酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包括至少一种所述多肽，其长度为9-20个氨基酸或13-17个氨基酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包括如表7中所列的组合I至10中的任何一个的多肽，其中任选地一种或多种所述多肽可被I (I)或(II)中所定义的其变体所替代。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包括以下多肽:
(a)Tim07Bl (KKIPAGELQIIDKIDA)；
(b)BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)；
(c)Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)；
(d)Rye09Bl (KPEVKYAVFEAALTKAIT)；
(e)Ber02 (FIPMKSSffGA)；
(f)Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK);和
(g)Bio02A (KYDAYVATLTEALR)o
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多肽的一种或多种具有选自以下的一种或多种修饰: (i)N末端乙酰化； (ii)C末端酰胺化； (iii)精氨酸和/或赖氨酸的侧链胺上的一个或多个氢被亚甲基基团所取代； (iv)糖基化；和 (V)磷酸化。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶的，从而其包括:(i)在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端:一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的N末端紧接的两个至六个连续氨基酸相对应；和/或 (ii)在T细胞表位侧翼的肽的残基的C末端:一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的C末端紧接的一个至六个连续氨基酸相对应；或 (iii)在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端和C末端，选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一个氨基酸， 其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度，所述T细胞表位具有小于3.5mg/ml的溶解度。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶的，从而另外地: (i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸残基被丝氨酸或2-氨基丁酸替代；和/或 (ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的至多三个氨基酸中的、不包含在T细胞表位中的疏水性残基；和/或 (iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的最多四个氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T细胞表位中的任何两个连续氨基酸，和/或 (iv)在N末端和/或C末端添加了一个或多个带正电荷的残基。
14.根据前述权利要求 中任一项所述的组合物，其中每种多肽具有0.03至200nmol/ml、0.3 至 200nmol/ml、50 至 200nmol/ml 或 30 至 120nmol/ml 的范围中的浓度。
15.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，所述组合物包括至少一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列在表达时导致如权利要求1至13中任一项所定义的组合物的产生。
16.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的载体，所述载体包括四种或多种多核苷酸序列，每种所述多核苷酸序列编码如权利要求1至13中任一项所定义的不同的多肽。
17.—种产物，所述产物包括:
(a)多肽Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE),Tim04A (WGAIWRIDTPDKL),Tim07G (FKVMTMNAAPANDK)、或其任何一种的如权利要求1 (I)或(II)中所定义的变体；
(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)、Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一种的如权利要求1 (I)或(II)中所定义的变体中的至少一种；和
(c)多肽Bio04A (LKKAVTAMSEAEK),Rye09B (PEVKYAVFEMLTKAIT)和 Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY), Rye05C (NAGFKAAVMMNAPPK)、或其任何一种的如权利要求1 (I)或(II)中所定义的变体中的至少一种， 其中每种不同的多肽是供同时地、分别地或顺序地用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症。
18.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的药物制剂，所述药物制剂包括根据权利要求1至15中任一项所述的组合物；根据权利要求16所述的载体；或根据权利要求17所述的产物；和药学上可接受的运载体或稀释剂。
19.根据权利要求18所述的组合物、载体或产物，所述组合物、载体或产物被配制为用于口服施用、局部施用、鼻内施用、皮下施用、舌下施用、皮内施用、口腔施用、表皮或贴剂施用、或用于通过吸入或通过注射施用。
20.如权利要求1-15中任一项所定义的组合物，或如权利要求17中所定义的产物，所述组合物或产物另外地包括另外的多肽过敏原，用于使个体免疫耐受所述另外的多肽过敏原。
21.一种确定T细胞是否识别如权利要求1至14中任一项所定义的组合物的体外方法，所述方法包括将所述T细胞与所述多肽接触并检测所述T细胞是否被所述多肽刺激。
22.根据权利要求21所述的方法，进行所述方法以确定个体是否患有草花粉过敏症或处于患草花粉过敏症的风险中。
【文档编号】A61K38/04GK103784952SQ201410056647
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2010年2月5日 优先权日:2009年2月5日
【发明者】罗德·哈夫纳, 保罗·莱德勒, 盖伊·雷顿, 马克·拉尔什 申请人:切尔卡西亚有限公司