增强针对艾美球虫属的免疫反应的组合物和方法

增强针对艾美球虫属的免疫反应的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及增强针对艾美球虫属的免疫反应的组合物和方法。提供了包含TRAP多肽的疫苗以及包含TRAP多肽的肠炎沙门氏菌载体。疫苗还可以包含能与CD40结合的CD154多肽。本发明还提供了增强针对顶复门寄生虫的免疫反应的方法及降低与顶复门寄生虫感染相关的发病率的方法。
【专利说明】增强针对艾美球虫属的免疫反应的组合物和方法
[0001]本申请是申请号为200880116875.0，申请日为2008年11月3日，发明名称为“增强针对艾美球虫属的免疫反应的组合物和方法”的中国专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉参考
[0003]本申请要求于2007年11月I日提交的美国临时申请系列号60/984，612的优先权，该临时专利的全部内容在此通过引用并入本文。
[0004]关于联邦资助研究的声明
[0005]无。
【技术领域】
[0006]本发明涉及增强针对艾美球虫属的免疫反应的组合物和方法。【背景技术】
[0007]球虫病导致世界范围的问题，其为由顶复门(Apicomplexan)原生动物寄生虫艾美球虫属(Eimeria)引起的家禽、猪和牛的传染病。就其对家禽工业的经济影响而言，球虫病位于家禽的前十大传染病之内。顶复门家族的其它成员也引起疾病，包括疟原虫属(Plasmodium)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)和弓形体属(Toxoplasma),它们分别是痕疾、隐孢子虫病和弓形体病的致病体。目前可用的抗艾美球虫属的疫苗以可控的低剂量的艾美球虫属寄生虫为基础，该寄生虫实质上是完整毒力但对药物敏感。用目前的基于艾美球虫属的疫苗接种产生大量的疫苗反应发病率并引起接种畜群的经济损失。因此，需要有效的低毒力的抗艾美球虫属的疫苗。对艾美球虫属有效的疫苗也可能被证明作为抗其它的顶复门寄生虫的疫苗是有用的。

【发明内容】

[0008]本发明公开了包含编码TRAP多肽或其免疫原性片段的第一多核苷酸序列的疫苗。TRAP多肽可以包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3，或其免疫原性片段。疫苗可选地还包括编码能与⑶40结合⑶154多肽的第二多核苷酸序列。⑶154多肽包括50个以下的氨基酸，并包含140-149位氨基酸或其同源物。
[0009]根据本发明所述的疫苗可包含于载体内，例如病毒、细菌或脂质体。在一个方面，本发明提供了包含肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)的疫苗,该肠炎沙门氏菌包含编码TRAP多肽的第一多核苷酸序列。
[0010]在另一方面，本发明包括通过施用本发明所述的疫苗增强受试者中针对顶复门寄生虫的免疫反应的方法。
[0011]在又一方面，本发明包括通过施用本发明所述的疫苗降低受试者中与顶复门寄生虫感染相关的发病率的方法。
【专利附图】

【附图说明】[0012]图1描述了在肠炎沙门氏菌中进行定点突变的方案。
[0013]图2A至图2B描述了重叠延伸PCR方法的设计方案，其用于产生插入至IamB多核苷酸的环区9中的TRAP和TRAP-CD154插入物。
[0014]图3为柱形图，其显示以表达所示的艾美球虫属TRAP序列的沙门氏菌载体接种后，巨型艾美球菌(Eimeria maxima)感染后5天的死亡百分率。经过IO4/禽形成孢子的巨型艾美球菌卵囊刺激21日龄的Broiler鸡在刺激之后5天的死亡率。在本实验中，孵化日的鸡不进行接种(对照)或者以沙门氏菌载体(表达来自巨型艾美球菌TRAP蛋白序列1、2、3，如附录中描述)进行接种。在第21天以完全相同剂量的巨型艾美球菌刺激所有的鸡。尸检表明所有的死亡均与巨型艾美球菌感染相关。用表达序列2的载体进行接种的小组中死亡率明显且显著降低。
【具体实施方式】
[0015]重组DNA技术能使对许多细菌及病毒物种的操作相对容易。一些细菌及病毒有轻微的致病性或无致病性，却能够产生强烈的免疫反应。这些细菌及病毒是诱导针对抗原的免疫反应的有吸引力的疫苗。细菌或病毒疫苗能够模拟自然感染并产生强烈的和持久的粘膜免疫性。生产和施用疫苗通常相对廉价。此外，这样的载体经常能携带一个以上的抗原，而且可以提供针对多种传染性试剂的保护。
[0016]在一个方面，本发明提供了包含编码TRAP多肽或其免疫原性片段的第一多核苷酸序列的疫苗。TRAP多肽可包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 11的免疫原性片段。疫苗包括任何包含编码能够诱导对多肽的免疫反应的抗原性多肽的多核苷酸的组合物。在另一方面，本发明公开了载体(例如细菌载体)的用途，用于接种和产生针对艾美球虫属或其它顶复门寄生虫如疟原虫属(疟疾的致病体)、弓形体属和隐孢子虫属的免疫反应。沙门氏菌菌株是适当的载体，因为可以使细菌基因发生突变或使其毒性减弱以产生对被感染或免疫的受试者有低致病性或没有致病性但同时保持免疫原性的细菌。
[0017]已经证明来自巨型艾美球菌(EmTFP250)的高分子量、无性阶段抗原为母体抗体的靶标，所述母源抗体通过饲养被该原生动物寄生虫感染的雌鸡而产生。抗原的氨基酸序列分析揭示TRAP (凝血栓蛋白相关的无名蛋白)家族的新成员，其含有16个凝血栓蛋白I型重复和31个表皮生长因子样钙结合结构域。EmTFP250或TRAP还包含两个低复合亲水区域，其富含谷氨酸和甘氨酸残基，以及与寄生虫滑行运动相关的跨膜结构域/细胞质尾部(其在顶复门微线体蛋白内高度保守)。选出数个潜在表位并在SEQ ID N0:l-3和11中列出。由于这个抗原的保守性质，通过载体表达这些表位可诱导针对多个顶复门寄生虫的保护性免疫力。
[0018]沙门氏菌可提供有用的载体，因为它能够在宿主的胃肠道存活并引起粘膜免疫反应。使用沙门氏菌载体的口服疫苗产生强烈的粘膜免疫反应，而且对动物和人类施用都相对容易。然而，与其毒性更强的对应体(counterpart)比较，许多目前的沙门氏菌疫苗菌株在产生强烈的保护性免疫反应方面不那么有效。强毒性菌株提供强烈的免疫反应但也可引起接种的受试者的显著的发病率。可以用作有效的粘膜(例如口服)接种的沙门氏菌菌株可提供一种载体，其能够容易地对受试者进行接种从而抵抗一种或多种致病体，例如顶复门寄生虫。[0019]本发明描述了可用作载体的肠炎沙门氏菌菌株，以及使用这个菌株制成的各种重组载体。具体地，本发明提供了能表达外源TRAP多肽的肠炎沙门氏菌13A(SE13A)。此外，本发明公开了疫苗和通过施用疫苗增强受试者的免疫反应的方法，所述疫苗包含编码TRAP多肽的TRAP多核苷酸序列和编码能够与CD40结合的CD154多肽或其同源物的CD154多核苷酸序列。疫苗可以用于增强针对艾美球虫属或另一个顶复门寄生虫(如疟原虫属、弓形体属或隐孢子虫属)的免疫反应，或用于降低与顶复门寄生虫引起的感染相关的发病率。
[0020]基于在鸡体内引起粘膜定殖(colonization)和粘膜下易位的不寻常的能力(使相关抗原或表位在商业化鸡体内强烈地呈递)，选择了沙门氏菌的野生型分离体，肠炎沙门氏菌13A (SE13A)(于2006年9月13日保藏于美国模式培养物保藏所(ATCC)，保藏号为PTA-7871)。重要地是，该野生型沙门氏菌分离体在商业化鸡体内不引起临床可检测的疾病或性能的丧失，表明该野生型沙门氏菌对脊椎动物的致病潜在可能性低。
[0021]可通过灭活细菌的在实验室或生产条件之外持续复制必需的至少一个基因使SE13A分离体进一步减毒。能用作载体的减毒或变异的沙门氏菌菌株如下所述。SE13A用于产生减毒的沙门氏菌菌株以开发疫苗并产生增强的免疫反应。SE13A对家禽具有侵入性、无致病性，而且不造成可检测的发病率。与非侵入性细菌载体相比，这些特性导致增强的免疫反应。通过使限制细菌传播能力的基因突变而使SE13A减毒可以提高疫苗的安全性。具有aroA或htrA突变的SE13A菌株保留产生免疫反应的能力，但在宿主中的复制受到限制。因此，减毒提高了载体的安全性而未使其免疫原性下降。
[0022]可以在多种其它沙门氏菌基因中进行突变，这些基因包括但不限于cya、crp、asd、0(11:、口110?、口110(>)、011^|1?、外膜蛋白、(^111、111:^ 或其它应激相关基因、aro、pur 和 gua。如实施例中所示，发现aroA和htrA突变可以使SE13A减毒。aro基因是涉及莽草酸酯(shikimate )生物合成途径或芳香酶 途径的酶，而aro突变体是芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的营养缺陷型。htrA是编码降解异常蛋白的细胞周质蛋白酶的应激反应基因。htrA突变体也是减毒的并表现出对过氧化氢敏感性增加。
[0023]实施例中描述的aroA和htrA突变是缺失突变，但可以以各种方式产生突变。适当地，突变为不能通过单一步骤修复的非回复突变(non-reverting mutation)。适当的突变包括缺失、反转、插入及置换。载体可以包括一种以上突变，例如载体可以同时包含aroA及htrA突变。产生这种突变的方法是本领域熟知的。
[0024]可以将编码TRAP多肽抗原和来自任何数目的致病生物的其它抗原的多核苷酸插入载体(例如，SE13A)中并由细菌表达。通过载体表达的这些多核苷酸使得在受试者免疫后产生抗原性多肽。可将多核苷酸插入细菌的染色体中，或在质粒或其它染色体外DNA上编码。本领域技术人员将理解，存在大量方法以获得载体(例如沙门氏菌)中多核苷酸的表达。多核苷酸可以通过本领域技术人员已知的方法与启动子(例如，组成型启动子、可诱导启动子等等)可操作地连接。适当地，可将编码TRAP抗原的多核苷酸插入被表达的细菌的多核苷酸中。适当地，细菌的多核苷酸编码跨膜蛋白，将编码TRAP抗原的多核苷酸插入至细菌多核苷酸序列中，以允许TRAP抗原在细菌表面表达。例如，编码TRAP的多核苷酸可以按照处于阅读框内的方式插入至编码跨膜蛋白外环区的区域中的细菌多核苷酸中，从而使细菌多核苷酸序列保留在阅读框中。参见实施例1。
[0025]或者，可将编码TRAP抗原的第一多核苷酸插入编码分泌多肽的多核苷酸中。本领域的技术人员将理解，编码TRAP抗原的多核苷酸可以插入众多的细菌多核苷酸中，以使TRAP抗原表达并呈递至经过疫苗治疗的受试者的免疫细胞。在实施例中，将编码TRAP多肽的第一多核苷酸插入SE13A的IamB基因的环区9中。编码TRAP抗原的多核苷酸可以可包含于单一拷贝或一个以上的拷贝中。也可产生包含插入至IamB的环区9中的多个拷贝的TRAP抗原的细菌载体。或者，可以将多个拷贝的表位插入到细菌载体中一个以上的位置。
[0026]适当地，第一多核苷酸编码TRAP多肽的一部分或整个TRAP多肽。可将多核苷酸插入到载体中。在实施例中，将3个多肽(SEQ ID N0:1-3)加入到SE13A中。适当地，插入至载体的TRAP多肽部分是免疫原性片段。免疫原性片段是能够激发细胞或体液免疫反应的肽或多肽。适当地，TRAP的免疫原性片段可以是全长蛋白序列的6个或更多个连续的氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸，或者20个或更多个氨基酸。
[0027]其它适当的包含于疫苗(其具有包含于载体内的TRAP)中的表位包括但不限于，编码其它艾美球虫属相关多肽的多核苷酸。本领域的技术人员将理解，多种序列可以与任何其它抗原联合使用，而且也可以与编码免疫刺激肽(如CD154多肽)的多肽结合使用。
[0028]如以下更详细描述，包括载体的疫苗可包括⑶154多肽，⑶154多肽能够与受试者内的CD40结合并刺激受试者对载体及其相关抗原产生反应。树突状细胞(DC)的参与对于有力的免疫反应的启动是必需的，因为其具有激活原态T细胞的独特的能力，引起T细胞扩增并分化为效应细胞。DC的作用(DC是机体的几乎所有组织中发现的抗原递呈细胞(APC))是捕获抗原，将抗原运送到相关的淋巴组织，然后把抗原递呈给原态T细胞。被DC激活后，T细胞扩增、分化为效应细胞、离开次级免疫器官并进入外周组织。激活的细胞毒性T细胞(CTL)能破坏感染了病毒的细胞、肿瘤细胞或者甚至是被细胞内寄生虫(例如沙门氏菌)感染的APC，并被证明在抗病毒感染的保护中至关重要。CD40是TNF受体家族分子的成员并在多种细胞类型上表达，包括专职的抗原递呈细胞(APC)Jf^B DC和B细胞。⑶40与其配体⑶154的相互作用是极其重要的，对于体液和细胞免疫都有刺激作用。可以通过抗⑶40抗体模拟在DC表面表达的CD40对DC的刺激。然而在体内这是通过在激活的T细胞表面表达的⑶40的天然配体(即⑶154)相互作用发生的。有趣的是，已经鉴定了⑶154的⑶40结合区。CD154的CD40结合区可以在载体(如沙门氏菌载体)的表面表达，并可导致对共递呈的肽序列增强的免疫反应。
[0029]如上所述，可将编码CD154多肽的多核苷酸插入载体的染色体中或保持在染色体外。⑶154多肽可以是⑶154全长蛋白的一部分或整个⑶154蛋白。适当地，⑶154多肽能够与CD40结合。本领域技术人员将理解，可以按照处于阅读框内的方式将这些多核苷酸插入到多种多核苷酸中并在载体的不同部分表达或被分泌。编码能够增强对TRAP的免疫反应的CD154多肽的多核苷酸也可以编码TRAP抗原。可以将编码CD154多肽的多核苷酸与编码TRAP抗原的多核苷酸连接起来，从而在载体中CD154多肽和TRAP抗原存在于同一多核苷酸上。在实施例中，编码能够与CD40结合的CD154多肽的多核苷酸也编码TRAP抗原。参见所附序列表中SEQ ID NO: 1，2，3和11。在实施例中，将编码TRAP抗原的多核苷酸(SEQID NO: 13-15)和编码⑶154多肽的多核苷酸都插入IamB基因的环区9中。本领域技术人员将理解，也可以使用编码其它跨膜蛋白和IamB基因的其它环区的细菌多核苷酸。
[0030]如上所述，疫苗中可以包括编码能够增强对抗原的免疫反应的CD154多肽的⑶154多核苷酸。适当地，⑶154多肽长度为50个氨基酸以下，更适当地是40个以下、30个以下或是20个以下氨基酸的长度。多肽可介于10至15个氨基酸之间、10至20个氨基酸之间或10至25个氨基酸长度之间。CD154序列和CD40结合区在各种物种间不是高度保守的。鸡和人的CD154序列分别见于SEQ ID NO: 10及SEQ ID N0:4。
[0031]已经确定了一些物种的⑶154的⑶40结合区，包括人、鸡、鸭、小鼠和牛，分别见于SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8 和 SEQ ID NO: 9。虽然不同物种之间的CD40结合区的序列有可变性，但人CD154多肽能够增强鸡的免疫反应。因此，人们可以使用物种特异性CD154多肽或异源CD154多肽来实施本发明。
[0032]在实施例中制备了几种SE13A重组细菌。在每种同时含有TRAP和⑶154多核苷酸的SE13A菌株中，TRAP多肽和⑶154多肽被编码在同一多核苷酸上，而且它们彼此处于阅读框内并与其所插入至的沙门氏菌IamB多核苷酸处于阅读框内。在替代的【具体实施方式】中，⑶154多肽和TRAP多肽可被不同的多核苷酸编码。SE13A的aroA htrA TRAP包含aroA和htrA的缺失并同时编码TRAP表位(SEQ ID NO: 1-3)和可选地插入至IamB的环区9 的 CD154 多肽(SEQ ID N0:4)。
[0033]本发明还提供了包含减毒的沙门氏菌菌株和药学上可接受的载体的组合物。药学上可接受的载体是任何适合体内施用的载体。药学上可接受的适合用于组合物中载体的例子包括但不限于，水、缓冲溶液、葡萄糖溶液或细菌培养液。组合物的附加成份可以适当地包括，例如，赋形剂如稳定剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂和滑润剂。药学上可接受的载体或稀释剂的例子包括稳定剂，如碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、右旋糖苷)、蛋白(如白蛋白或酪蛋白)、含蛋白试剂(如牛血清或脱脂乳)和缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液)。特别是在组合物中添加这样的稳定剂时，该组合物适合冷冻干燥或喷雾干燥。
[0034]本发明还提供了通过施用包含TRAP多肽和能够与⑶40结合并激活⑶40的⑶154多肽的疫苗而增强受试者免疫反应的方法。向受试者施用有效量的包括编码能够与CD40结合的⑶154多肽的多核苷酸的疫苗以增强受试者对疫苗的免疫反应。适当地，疫苗包含编码包括人类⑶154多肽(SEQ ID N0:4)的140-149位氨基酸的多肽或其同源物的多核苷酸。因此，源自一个物种的140-149位氨基酸的同源物可用于刺激不同物种中的免疫反应。
[0035]在本文中鉴定出几种合适的多肽。适当地，多核苷酸编码来自于与受试者同一物种的⑶154多肽。适当地，将编码SEQ ID NO:5的多肽的多核苷酸用于人类受试者，将编码SEQ ID N0:6的多肽的多核苷酸用于鸡，将编码SEQ ID NO:7的多肽的多核苷酸用于鸭，将编码SEQ ID N0:8的多肽的多核苷酸用于小鼠，和将编码SEQ ID N0:9的多肽的多核苷酸用于牛。在实施例中，在鸡疫苗载体中使用人类⑶154多肽(SEQ ID N0:5)，而且证明可增强对外源抗原的免疫反应。因此，CD154多肽和受试者的其它异源组合可用于本发明的方法。CD154多肽可用于增强受试者对任何外源抗原或存在于疫苗载体中的除TRAP多肽之外的抗原性多肽的免疫反应。本领域技术人员将理解，CD154多肽可用于增强对存在于疫苗中的一种以上抗原性多肽的免疫反应。
[0036]来自⑶154的多肽至少 部分通过与其受体⑶40的结合而刺激免疫反应。在实施例中使用了与CD154多肽同源的多肽，其在受试者免疫细胞上表达并且能够与巨噬细胞和其它抗原递呈细胞上的CD40受体结合。这个配基-受体复合物的结合刺激巨噬细胞(和巨噬细胞谱系细胞，例如树突状细胞)以增强吞噬作用和抗原呈递，并同时增加已知能够激活其它局部免疫细胞(如B淋巴细胞)的细胞因子的分泌。因此，CD154肽相关分子是免疫反应及扩大的抗体产生的优选祀标。
[0037]本方法可用的潜在载体包括但不限于沙门氏菌属(肠炎沙门氏菌)、志贺菌属(Shigella)、埃希杆菌属(Escherichia)(大肠杆菌)、耶尔森菌属(Yersinia)、博德特氏菌属(Bordetella)、乳球菌属(Lactococcus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)(霍乱弧菌)、李斯特菌属(Listeria)、腺病毒(adenovirus)、痕病毒(poxvirus)、抱疫病毒(herpesvirus)、甲病毒(alphavirus)及腺相关病毒。
[0038]此外，本发明公开了增强针对顶复门寄生虫的免疫反应的方法和降低与随后感染顶复门寄生虫相关的发病率的方法。简言之，该方法包括向受试者施用有效量的包含编码TRAP多肽的第一多核苷酸序列的疫苗。TRAP多肽可以包括SEQ ID N0:l_3和11。可以以本领域的技术人员熟悉的多种方式将TRAP多肽插入载体，包括但不限于在BMCBiotechnol.2007Sept, 17:7 (I): 59 中描述的无痕定点突变系统(scarless site-directedmutation system),肠炎沙门氏菌染色体中的无痕定点诱变(Scarless and Site-directedMutagenesis)，其全部内容通过引用并入本文。也可以工程化载体使其表达TRAP多肽以及如上所述的能够增强免疫反应的其它多肽(如SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 10)。特别的，载体可以表达能够结合CD40的CD154的多肽以增强受试者对TRAP多肽的免疫反应。可选地，载体是细菌，例如肠炎沙门氏菌。
[0039]将施用的疫苗的有用剂量将根据受试者的年龄、体重和物种、施用的模式及途径、以及寻找对其产生免疫反应的病原体类型而变化。可以以任何足以激发免疫反应的剂量施用组合物。对于细菌疫苗而言，预计IO3至IOltl个细菌、IO4至IO9个细菌、或IO5至IO7个细菌的剂量范围是适当的。组合物可以只施用一次，或可以施用两次或更多次以增强免疫反应。例如，组合物可以施用两次或更多次，每次隔一周、隔两周或隔三周或隔更多周。在施用之前使细菌适当地存活，但在一些【具体实施方式】中，在施用之前将细菌杀死。在一些【具体实施方式】中，细菌能够在受试者体内复制，而在其它【具体实施方式】中，细菌不能在受试者体内复制。
[0040]对于向动物或人类的施用而言，可以以多种手段施用组合物，这些手段包括但不限于鼻内、粘膜、通过喷雾、皮内、非肠道、皮下、口服、通过气雾或肌内。点眼施用或添加到饮水或食物中也是适当的。对于鸡而言，可以将组合物施用到卵中。
[0041]本发明的一些【具体实施方式】提供增强受试者免疫反应的方法。适当的受试者包括但不限于脊椎动物，适当的哺乳动物、适当的人类和禽类，适当的家禽如鸡。也可以使用其它的动物感染模型。增强免疫反应包括但不限于，诱导受试者的免疫系统介导的治疗性或预防性效应。特别地，增强免疫反应包括但不限于抗体的产生增加、抗体重链的类别转换增强、抗原呈递细胞的成熟、辅助性T细胞的刺激、溶细胞性T细胞的刺激或T及B细胞记忆的诱导。
[0042]预计将来自相同或不同病原体的几个表位或抗原在单一疫苗中组合施用，以产生针对多个抗原的增强的免疫反应。重组疫苗可以编码来自多种病原体微生物、病毒或肿瘤相关抗原的抗原。施用能够表 达多种抗原的疫苗具有同时诱导抵抗两种或更多种疾病的免疫力的优点。例如，活的减毒细菌(如肠炎沙门氏菌13A)为激发抵抗多种抗原的免疫反应提供了适当的载体。[0043]可以使用编码抗原的外源多核苷酸构建细菌疫苗，可以使用本领域中广为人知的方法将所述多核苷酸插入至细菌基因组中的任何非必需位点或可选地质粒上携带。一个适当的插入多核苷酸的位点是在跨膜蛋白的外部部分内或将该多核苷酸与靶向用于分泌途径的外源多核苷酸的序列偶联。一个用于插入多核苷酸的适当的跨膜蛋白的例子是IamB基因。在实施例中，TRAP和⑶154多核苷酸插入IamB序列的环区9中。
[0044]外源多核苷酸包括但不限于，编码选自致病性微生物或病毒的抗原的多核苷酸，并包括以产生有效免疫反应的方式表达的多核苷酸。这样的多核苷酸可以来自致病性病毒，如流感病毒(例如M2e、红细胞凝集素、或神经氨酸酶)、疱疹病毒(例如编码疱疹病毒的结构蛋白的基因)、逆转录病毒(例如gpl60包膜蛋白)、腺病毒、副粘液病毒、冠状病毒等等。外源多核苷酸也可以获自致病性细菌，例如编码细菌蛋白(如毒素)和外膜蛋白的基因。此外，来自寄生虫(例如其它顶复门寄生虫)的外源多核苷酸是用于载体疫苗的理想候选物。
[0045]载体中也可以包括编码参与激发免疫系统的多肽的多核苷酸，如活的减毒的沙门氏菌疫苗。多核苷酸可以编码已知具有刺激效应的免疫系统分子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素，或是另一种参与免疫调节的多核苷酸。疫苗也可包括编码已知刺激免疫反应的肽(例如本文描述的CD154多肽)的多核苷酸。
[0046]以下实施例只是示例性的，而不是限制本发明或所附权利要求的范围。
[0047]实施例
[0048]实施例1.TRAP和TRAP/CD154插入物的构建
[0049]菌株和培养 条件
[0050]除非另有说明，否则首先将所有质粒保持在T0P10大肠杆菌细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。使用肠炎沙门氏菌13A引入突变。肠炎沙门氏菌菌株13A是从USDA/APHIS/NVSL获得的田野分离体，并以保藏号PTA-7871保藏于ATCC。携带质粒pKD46的细菌在30°C生长。其它细菌在37°C生长。质粒消除在37°C实施。
[0051]将Luria-Bertani (LB)培养基用于细胞的常规生长，SOC培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)用于电穿孔之后的表型表达。在适当时，将以下抗生素添加到培养基中:氨比西林(Amp) 100 μ g/ml、卡那霉素(Km) 50 μ g/ml和氯霉素(Cm) 25 μ g/ml ο
[0052]质粒
[0053]以前描述过质粒pKD46、pKD13 和 pBC-1-Scel (Datsenko 和Wanner, PNAS2000, 97:6640-6645 和 Kang 等人，J Bacteriol2004, 186:4921-4930，二者通过引用全文并入本文)。质粒PKD46编码Red重组酶酶类，其介导引入的线性DNA与染色体DNA之间的同源重组。这个质粒还包含氨比西林抗性基因而且对温度敏感，所以其需要30°C的温度以在细胞中维持生长。质粒pKD13用作重叠PCR反应中Km抗性(Kmlr)基因的扩增模板。质粒pBC-1-SceI(在37°C维持在细胞中)产生1-SceI酶，1-SceI酶剪切以下18个碱基对的稀有识别序列:5' -TAGGGATAACAGGGTAAT-3' (SEQ ID NO: 16)。质粒pBC-1-SceI还包含氯霉素抗性(Cnf )基因。
[0054]PCR
[0055]在表1中列出了用于PCR的所有引物。通常，PCR的反应条件如下:在总体积50 μ L中含有大约0.1 μ g纯化的基因组DNA、质粒或PCR产生的DNA(Qiagen，Valencia, CA, USA)、IX 克隆的 Pfu 聚合酶缓冲液、5U Pfu 聚合酶(Stratagene La Jolla, CA, USA)、ImM dNTP(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway, NJ)和每个引物 1.2 μ M。使用 DNA 引擎热循环仪(Bio-Rad，Hercules, CA, USA)在以下扩增条件下进行扩增:94°C，2分钟；94°C持续30秒、58°C持续60秒、72°C持续90秒(每lkb)，共进行30个循环；和72°C持续10分钟以进行最后的延伸。每个PCR产物经过凝胶纯化(Qiagen，Valencia, CA, USA)，并以25 μ L的EB缓冲液洗脱以制备用于重叠延伸PCR的模板，或者以50 μ L的EB缓冲液洗脱，经乙醇沉淀，并重悬于5μ L的ddH20中，以使其通过电穿孔进入肠炎沙门氏菌中。
[0056]表1引物序列
[0057]
【权利要求】
1.一种疫苗，其包含编码TRAP多肽的第一多核苷酸序列，其中所述TRAP多肽是SEQ IDN0:2。
2.根据权利要求1所述的疫苗，还包含: 编码能与CD40结合的CD154多肽的第二多核苷酸序列，所述的CD154多肽具有50个以下的氨基酸并包含SEQ ID NO:4的140-149位氨基酸，或其中所述⑶154多肽选自SEQID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 中的一个。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其中疫苗包含: 一个以上拷贝的第一多核苷酸序列， 一个以上拷贝的第二多核苷酸序列，或 二者皆有。
4.根据权利要求2所述的疫苗，其中第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列按照处于阅读框内的方式连接。
5.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗，其中第一多核苷酸包含于载体内。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其中载体选自病毒、细菌和脂质体。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其中载体是细菌。
8.根据权利要求7所述的疫苗，细菌在其表面上包含TRAP多肽。
9.根据权利要求7或8所述的疫苗，其中细菌选自沙门氏菌属、杆菌属、埃希氏菌属和乳酸菌属。
10.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗，其中第一多核苷酸插入到编码跨膜蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
11.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗在制备用于增强受试者中针对艾美球虫属寄生虫的免疫反应的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中疫苗通过选自口服、鼻内、或卵内的方法施用。
13.根据权利要求11所述的用途，其中增强的免疫反应包括增强的抗体反应或增强的T细胞反应。
14.根据权利要求11所述的用途，其中受试者是家禽类物种或哺乳动物的成员。
15.根据权利要求11所述的用途，其中在向受试者施用前杀死包含疫苗的载体。
16.根据权利要求11所述的用途，其中包含疫苗的载体在受试者体内不能复制。
17.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗在制备用于降低受试者中与艾美球虫属寄生虫感染相关的发病率的药物中的用途。
18.根据权利要求 11所述的用途，其中疫苗通过肠胃外的方法施用。
【文档编号】A61K39/012GK103893747SQ201410081760
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2008年11月3日 优先权日:2007年11月1日
【发明者】W·博特吉, B·哈格斯, L·博格曼, Y·M·权, K·乔菜, M·考克斯, S·莱顿, S·艾-阿什拉姆, J·巴尔塔, G·特列斯 申请人:阿肯色大学评议会, 德克萨斯A&M大学体系, 圭尔夫大学