一种从斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制备方法
【专利摘要】一种从斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia?punctata（P.Karst.）Murrill中提取的抗氧化多糖及其制备方法。本发明的抗氧化多糖是将斑嗜蓝孢孔菌子实体磨成粉后，经热水浸提、乙醇沉淀、除蛋白、透析、冻干、离子交换和分子筛而获得。该抗氧化多糖为淡黄色粉末，分子量为151KDa，由阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖4种单糖组成，比例为1:6:29:43，同时存在α和β两种构型。易溶于热水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂。该多糖具有较强的抗小鼠红细胞溶血和一定的清除DPPH、超氧阴离子及羟基自由基的作用。本发明中斑嗜蓝孢孔菌抗氧化多糖为天然提取物，其制备方法简单，成本较低，纯度高。
【专利说明】一种从斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】,具体涉及一种斑嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia punctata(P.Karst.)Murrill，俗名:斑褐孔菌、层卧孔菌)中提取的抗氧化多糖及其制备方法。
【背景技术】
[0002]我国真菌资源丰富，许多真菌作为珍贵的药、食两用菌受到广泛关注。随着对真菌资源开发和研究的不断深入，已从中分离获得了许多活性成分，诸如腺苷、留醇类、有机酸、萜类等小分子活性物质，除此之外，还有多糖、蛋白、多糖-蛋白复合物等大分子化合物，具有良好的抗病毒、降血糖和增强免疫调节等功能，因此，食、药用真菌作为中草药中的“上上药”，其研究开发存在很大潜力。
[0003]斑嗜蓝抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill,属担子菌纲，非裙菌目，多孔菌科，主要分布在我国的吉林、辽宁、河北、陕西、江苏、浙江、湖北、湖南、福建、广西、江西、安徽、云南等地。一般寄生于栎、槭及其他阔叶树的树皮和腐木上，其子实体多年生，无菌盖，平伏贴生于基物表面可达20cm或更大。菌管多层，干时龟裂，每层厚约2~3_，并逐年缩小，形成扁半球形的子实体，其总厚度达约15mm，管孔表面初期锈褐色，后期由于被灰色菌丝所充塞而变为淡烟色至棕灰色，子实体的边缘灰黑色，管孔壁厚，完整，管口呈圆形。
[0004]目前，虽然市场上已有将斑嗜蓝孢孔菌粗提物作为保健品的商品和治疗冠心病、心绞痛的药品销售，但对斑嗜蓝孢孔菌的药理活性成分的研究报道甚少，缺少相应的理论支撑。
[0005]本发明首次从斑嗜蓝孢孔菌子实体中分离纯化得到一种具有抗氧化活性的多糖。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中的一种抗氧化多糖及其制备方法，该多糖具有一定的抗小鼠红细胞溶血、清除DPPH、超氧阴离子和羟基自由基的生物活性。
[0007]本发明提供的从斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中提取的抗氧化多糖为淡黄色粉末，分子量为151KDa，由阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖4种单糖组成，比例为1:6:29:43，同时存在α和β两种构型，易溶于热水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂。
[0008]本发明涉及的斑嗜蓝抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中的抗氧化多糖是按照如下方法制备的:
[0009](I)将斑嗜蓝抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子实体研成粉末，80~100°C热水浸提3~5h，过滤所得滤渣再次浸提，合并滤液，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子实体粗提液；
[0010](2)斑嗜蓝抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子实体粗提液经旋转蒸发浓缩后，加入3~5倍体积无水乙醇，边加边剧烈搅拌，产生沉淀。于2~6°C放置过夜，10000~20000rpm离心20~30min,收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗漆沉淀数次，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill粗提物；
[0011](3)将(2)步中得到的斑嗜蓝抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill粗提物用蒸馏水复溶，置于分液漏斗中，用Sevage法除蛋白，然后装入分子截留量为3000~1000ODa的透析袋中，在2~6°C，足量蒸馏水中透析，经冷冻干燥，即得斑嗜蓝孢孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 多糖粗粉；
[0012](4)将(3)步中得到的斑嗜蓝抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill多糖粗粉溶解于10~IOOmM Tris-Hcl (pH7.4)溶液中，上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用O~2mol/L NaCl溶液连续梯度洗脱，收集洗脱峰；
[0013](5)将洗脱峰上样于S^hadex G_75分子筛，用蒸馏水洗脱，获得抗氧化多糖。
[0014]本发明中斑嗜蓝抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill抗氧化多糖采用HPLC-ELSD进行纯度和分子量的检测，证明其是分子量为151KDa的纯品。
[0015]本发明中斑嗜蓝抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill抗氧化多糖对小鼠红细胞溶血有较好的抑制作用，对DPPH、超氧阴离子及羟基自由基也具有一定的清除作用。
[0016]将上述斑嗜蓝抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中抗氧化多糖命名为 FPAPS (Fomitiporia punctata antioxidant polysaccharide)。
[0017]所述的 斑嗜蓝孢孔菌抗氧化多糖可应用于治疗氧化应激水平升高引起疾病的药物的制备。
[0018]本发明具有的优点和有益效果:
[0019](I)本发明中斑嗜蓝抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖为天然提取物，具有良好的安全性；(2)本发明中斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill抗氧化多糖为纯品；(3)本发明中斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata (P.Karst.)Murrill抗氧化多糖具有良好的抗氧化效果；(4)本发明中斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill抗氧化多糖制备简单,成本低,适于大规模生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的离子交换层析图。
[0021]图2 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的凝胶色谱层析图。
[0022]图3 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的HPLC-ELSD 图。
[0023]图4是标准葡聚糖的分子量标准曲线图。
[0024]图5 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖对小鼠红细胞溶血的抑制作用图。
[0025]图6 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill 抗氧化多糖对 DPPH 的清除作用图。
[0026]图7 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖对超氧阴
离子清除作用图。
[0027]图8 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖对羟基自
由基的清除作用图。
[0028]图9 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的红外光谱图。
[0029]图10 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill 抗氧化多糖的核磁共
振氢谱图。
[0030]图11 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill 抗氧化多糖的 200 ~400nm紫外扫描图。
[0031]图12 是本发明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的HPLC-ELSD法单糖组成分析图。
[0032]图13是6种标准单糖的HPLC-ELSD法分析图。
具体实施例
[0033]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0034]实施例1、本发明抗氧化多糖的制备
[0035](I)将斑嗜蓝抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子实体研成粉末，加入20倍体积蒸馏水混匀，于80°C恒温水浴提取5h，过滤所得滤渣再次提取，合并滤液，即斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill子实体粗提液；
[0036](2)斑嗜蓝抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子实体粗提液经旋转蒸发浓缩，向其中加入4倍体积无水乙醇，边加边剧烈搅拌，产生沉淀。于4°C放置过夜，1000Orpm离心20min，收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤沉淀数次，即得斑嗜蓝孢孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 粗提物；
[0037](3)将斑嗜蓝孢孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 粗提物用蒸懼水复溶，置于分液漏斗中，加入1/4体积Sevage试剂(三氯甲烷:正丁醇=4:1)，剧烈震摇lOmin，静置30min，分液除去下层有机相和中间层白色絮状物，重复操作7次，取上层水相经旋转蒸发除去残留的有机溶剂。然后装入分子截留量为3500Da的透析袋中，在4°C，足量蒸懼水中透析2~3d,经冷冻干燥，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill多糖粗粉；
[0038](4)将斑嗜蓝抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 多糖粗粉溶解于IOmM Tris-Hcl (pH7.4)溶液中，上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用O~2mol/LNaCl溶液连续梯度洗脱，蒽酮-硫酸法跟踪监测每管洗脱液在620nm处的吸光值，得到洗脱曲线(图1 )，收集洗脱峰；
[0039](5)将洗脱峰上样于S印hadex G_75分子筛，用蒸馏水洗脱，蒽酮-硫酸法跟踪监测每管洗脱液在620nm处的吸光值，得到洗脱曲线(图2)，收集洗脱峰获得抗氧化多糖。
[0040]实施例2、本发明抗氧化多糖的纯度和分子量测定
[0041](I)将已知分子量的标准葡聚糖(Dextran Τ-10、Τ-50、Τ-70、T-100、T-200)分别用双蒸水配制成浓度为1%的标准液，0.22 μ m滤膜过滤，本发明抗氧化多糖做同样处理。
[0042](2)色谱条件:色谱柱为Shodex SUGAR KS-804糖柱(8.0 X 300mm);蒸发光散射检测器(ELSD)，柱温:室温;流动相:双蒸水；进样量:20 μ L ;空压:3 X IO5Pa
[0043](3)分子量标准曲线绘制:将标准葡聚糖分别进样20 μ L，采集图谱，以分子量Mw为纵坐标，保留时间t为横坐标，绘制标准曲线(图4)。
[0044](4)将抗氧化多糖进样20μ L，采集图谱，根据出峰情况判定纯度，图3显示单一狭窄对称峰，可以判定该多糖为纯品，将保留时间6.6min代入标准曲线(图4)，计算得到该多糖分子量为151kDa。
[0045]实施例3、本发明抗氧化多糖的清除DPPH自由基作用
[0046](I)抗氧化多糖用无水甲醇做溶剂,配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，DPPH用无水甲醇配制成终浓度为lX10_4mol/L的溶液。
[0047](2)分别取上述多糖溶液0.06,0.12,0.18,0.3,0.6mL于1.5mL离心管中，用DPPH溶液补足1.2mL，等体积无水甲醇代替样品溶液的处理作为空白对照，抗坏血酸作为正对照，黑暗中放直30min。
[0048](3)在517nm处测定各处理的吸光值，每个处理做3个平行。
[0049](4)按“清除率=Ll-(As-Ab)Ai] X100%”公式计算DPPH清除率，其中Ai为不加样的DPPH溶液的吸光值，As为样品与DPPH反应后的吸光值，Ab为样品的吸光值。
[0050]该抗氧化多糖的清除DPPH自由基活性见图6，该图显示，在工作浓度为25~250ug/ml范围内，该多糖的DPPH自由基清除活性随着浓度的增大而升高，在250ug/ml时清除活性最高，为50.98%。
[0051]实施例4、本发明抗氧化多糖的超氧阴离子自由基清除作用
[0052]本研究采用ImL Tris-HCl缓冲液(mM，pH8.0)的超氧阴离子产生体系，其中含有78uM NADH, 50uM NBT, IOuM PMS以及不同浓度的试样，以没食子酸作为正对照，用Tris-HCl补足lmL，在560nm测定超氧阴离子与NBT的颜色反应。
[0053]按“清除率=(A — A1VAX 100%”公式计算试样的超氧阴离子自由基清除率，其中A为对照体系的吸光值，Al为含试样体系的吸光值。
[0054]如图7所示，本发明抗氧化多糖在工作浓度为10~300ug/mL浓度范围内，随浓度升高，其超氧阴离子清除率先升高后下降，在200ug/mL时清除率最高为68.57%。
[0055]实施例5、本发明抗氧化多糖的红外光谱分析
[0056]取本发明抗氧化多糖2mg与KBr研磨混匀,压片,用红外光谱仪在4000~500CM-1波数范围内进行红外扫描。
[0057]结果如图9所示，表明样品在波数3420.2301^(0_!1的伸缩振动)，2924.40cm_1(C-H的伸缩振动)和1637.80CHT1 (糖的水化物吸收峰)处均有多糖类物质的特征吸收峰。波数1400~1200cm—1范围内为C-H变角振动，它与C-H的伸缩振动构成了糖环的特征吸收。波数889.23CHT1处为β-D-葡聚糖的特征吸收峰，表明该多糖以β -糖苷键为主，单糖组分中含有葡萄糖，1045.18cm-1和1080.23CHT1两处是呋喃糖环特征吸收峰，表明单糖是以呋喃糖苷的形式存在。
[0058]实施例6、本发明抗氧化多糖的单糖组成分析
[0059]将本发明抗氧化多糖酸水解成单糖后，用流动相(乙腈:水=70:30)配制成IOmg/mL的溶液，色谱柱为NH2P-504E氨基柱，HPLC-ELSD法采集图谱(图12 )，图中显示4个峰值，出峰时间分别为5.2min、5.5min、6.2min和6.5min,表明该多糖的水解产物中有4种单糖成分。
[0060]同时，将六种标准单糖(阿拉伯糖、山梨醇、果糖、甘露糖、山梨醇和葡萄糖)用流动相配制成5mg/mL的标准液。首先单个进样，后混合进样，在同样条件下采集图谱，得到图13，自左至右依次为阿拉伯糖、果糖、山梨醇、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，出峰时间分别为
5.2min、5.5min、5.6min、5.8min、6.2min和6.5min。根据出峰时间可判定，本发明抗氧化多糖的4种单糖组分为阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖，根据四种单糖的峰面积估计其比例约为 1:6:29:43。`
【权利要求】
1.一种斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中提取的抗氧化多糖，所述的抗氧化多糖来自斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill,淡黄色粉末，分子量为151KDa，由阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖4种单糖组成，比例为1:6:29:43。
2.权利要求1所述的斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将斑嗜蓝抱孔菌Fomitiporiapunctata (P.Karst.) Murrill子实体研成粉末，80~100°C热水浸提3~5h，过滤所得滤渣再次浸提，合并滤液，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子实体粗提液； (2)将上步得到的斑嗜蓝抱孔菌Fomitiporiapunctata (P.Karst.) Murrill子实体粗提液经旋转蒸发浓缩，加入3~5倍体积无水乙醇，边加边剧烈搅拌，产生沉淀；于2~6°C放置过夜，10000~20000rpm离心20~30min,收集沉淀,依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗漆沉淀数次，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill粗提物； (3)将(2)步中得到的斑嗜蓝抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 粗提物用蒸馏水复溶，置于分液漏斗中，用Sevage法除蛋白，然后装入分子截留量为3000~1000ODa的透析袋中，在2~6°C，足量蒸馏水中透析，经冷冻干燥，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 多糖粗粉； (4)将(3)步中得到的斑嗜蓝抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 多糖粗粉溶解于10~IOOmM Tris-Hcl (pH7.4)溶液中，上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用O~2mol/L NaCl溶液连续梯度洗脱，收集洗脱峰； (5)将洗脱峰上样于S^hade`xG_75分子筛，用蒸馏水洗脱，获得抗氧化多糖。
3.权利要求1所述的斑嗜蓝孢孔菌抗氧化多糖在制备用于治疗因自由基等引起氧化应激水平升高导致疾病的药物方面的应用。
【文档编号】A61P39/06GK103819574SQ201410082755
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】刘方, 王银平, 刘赵昆 申请人:南开大学