一种基于纳米材料仿生载药梯度缓释骨支架的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于纳米材料仿生载药分级缓释骨支架的制备方法，包括负型的制备，浆料的制备，内层载药骨支架的制备，外层载药骨支架的制备和封装等步骤。该骨支架除满足一般骨支架对孔隙率、强度、表面形态的要求外，还实现了骨支架载药的多样性，具备装载药物的梯度缓释功能，可有效提高临床上复杂骨缺损治疗的成功率，在临床上有着广阔的应用前景。
【专利说明】一种基于纳米材料仿生载药梯度缓释骨支架的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明提出一种新型仿生载药分级缓释骨支架的制备方法，特别是一种基于纳米材料仿生载药分级缓释骨支架的制备方法。
【背景技术】
[0002]目前，应用于临床上的骨缺损修复方法中，应用组织工程技术，采用生物材料制造的仿生骨，在解决骨源不足的问题上是替代自体骨移植最佳方案之一。
[0003]熔融堆积成型技术是增材制造技术之一，该技术是将热塑性塑料聚合体材料加热熔融成丝，堆积在成型面上成型，成型速度和精度较高，可用于制作复杂内部结构的模具。生物制造是制造科学、生命科学、材料科学的交叉技术，生物活性组织的工程化制造是其主要研究领域之一。将经过改性的材料应用于生物制造领域，可以使仿生骨支架具有良好的生物相容性、生物降解性和机械强度。将药物载入骨支架，可以实现药物的梯度缓释和靶向药物的传递。 目前，针对药品开发合适的传递系统仍面临着巨大的挑战。以往，用于植入的聚合物装置是由硅胶、橡胶和聚乙烯制成。采用这些化学惰性聚合物作为给药装置的主要缺陷是其非可生物降解性，这使得药物在体内释放完后需经手术将装置取出。为了克服这一难题，许多可生物降解聚合物被合成并用于药物传递。这些聚合物在体内通过酶或非酶的途径降解生成具有生物相容性或无毒的副产物，从而可以避免通过手术取出耗尽药物的传递装置。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)由两种单体-乳酸
和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能。β -碳酸钙(β-tricalcium phosphate, β-TCP)是一种应用广泛的可降解生物陶瓷，但由单一 β-TCP作为材料的制备的骨支架有机械强度不足的缺点，由生物材料PLGA与β -TCP混合制备而成的复合材料骨支架可有效提高骨支架的机械强度。骨形态发生蛋白(Bone morphogenic proteins, BMPs)是最值得关注的生长因子之一，BMPs既能诱导干细胞向成骨细胞分化，同时对成骨细胞产生直接作用，能诱导纤维组织中基质干细胞在异位发生成骨，其极高的成骨活性预示着巨大临床应用价值。骨支架不合理的载药方式，使药物在骨支架表面聚集，从而导致较高的突释。构建用于骨修复的具有良好支架性能和负载药物梯度缓释的复合功能仿生载药支架仍需要艰难探索。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种基于纳米材料仿生载药分级缓释骨支架的制备方法。该仿生载药梯度缓释骨支架不仅要满足一般骨支架对骨缺损部位的支撑要求，还要实现药物梯度缓释诱导骨髓间充质干细胞的分化，提高成骨量。
[0005]为达到上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种基于纳米材料仿生载药梯度缓释骨支架的制备方法，工艺步骤如下:
I)负型a、负型b的设计与制造:设计出两种负型，即负型a、负型b ;负型包括三个组件，即底座、左半环和右半环；所述负型b底部开有凹槽，方便冰柱的垂直装入，避免冰柱倾倒；应用熔融堆积成型法制造出负型的各个组件，装配好后备用；
2)载药浆料的制备:将生物材料PLGA溶于二氯甲烷，后加入纳米级β-TCP和去离子7jC, PLGA与β-TCP的质量之比为4:6，置于震荡研磨仪，使浆料混合均匀，制备出两份同样的浆料Α、Β ;分别将质量为1、II的ΒΜΡ-2 (骨形态发生蛋白之一)溶解于DMSO，制备出混合溶液C丨、C u，后将C丨、C工工分别加入Α、B中，再次置于震荡研磨仪，使浆料与药物混合均匀，取出，置于真空干燥机中真空消泡，去除浆料中存在的气泡；制备好的浆料A+ C,,B+ Cii,备用;
3)内层载药骨支架61的制备:将浆料A+C丨负压灌入负型a，将灌入浆料的负型a在低温真空环境下冷冻干燥后，取出，拆除负型，所得骨支架经后处理得到内层载药骨支架G1 ；
4)冰柱制备:将去离子水灌入到负型a中，低温冷冻，待完全结冰后，拆除负型，取出冰柱，将冰柱装入负型b中心位置；
5)外层载药骨支架G2的制备:将浆料B+C π负压灌入已装有冰柱的负型b，将灌入浆料的负型b在低温真空环境下冷冻干燥后，取出，拆除负型，得到外层载药骨支架G2 ;将支架62中心的冰柱升华后，形成具有环状外形的外层载药骨支架G2 ；
6)骨支架的封装:将浆料B+C π负压灌入外层载药骨支架G2的中心孔洞中，使浆料灌至距底部1/3高度处，冷冻干燥；取出后，将内层载药骨支架G1装入外层载药骨支架G2的中心孔洞中；最后将浆料B+ C11负压灌入外层载药骨支架G2中心孔洞中，灌满孔洞封装内层载药骨支架G1，冷冻干燥，最终制得仿生载药梯度缓释骨支架。
[0006]所述冷冻干燥的条件为:温度为-42—-48°C之间，冷冻干燥机内部的真空度为18-45pa，处理时间 46-48h。
[0007]所述浆料A+ C I的载药浓度为2.42X10—4 mol/kg，浆料B+ C11的载药浓度为
6.06X 10 5mol/kg。
[0008]本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点:
1.本发明设计了一种新型负型，该负型底部开有凹槽，能够有效保证冰柱的垂直装入，避免冰柱出现倾倒。
[0009]2.本发明引入冰柱来制造出具有环状外形的骨支架。保证了骨支架的良好外形，为解决如何制备环状骨支架的难题提供了一种可靠解决方案。
[0010]3.本发明采用骨形态发生蛋白作为装载药物，有效的保证了载药骨支架促进成骨细胞分化。
[0011]4.本发明对载药骨支架采用分级制造，在内外两个支架上，可以装载不同剂量、不同种类的药物，实现了骨支架载药的多样化。
[0012]5.本发明分别制造了含不同剂量药物的两种骨支架，经装配后，实现了目标骨支架的分级载药，为药物的梯度释放提供了可能。
[0013]6.本发明可通过调整负型的尺寸形状，来获取不同尺寸形状的仿生载药骨支架，因此，该方法可以实现骨缺损部位植入支架的定制化制造，可有效提高临床复杂骨缺损治疗的成功率。
【专利附图】
【附图说明】[0014]图1为仿生载药梯度缓释骨支架结构示意图。
[0015]图2为内部载药骨支架G1制备流程图。
[0016]图3为仿生载药梯度缓释骨支架制备流程图。
【具体实施方式】
[0017]以下通过具体实例来对本发明进行说明，结合附图详细说明如下:
如图1所示，一种基于纳米材料仿生载药梯度缓释骨支架的制备方法，工艺步骤如下:
1)负型a、负型b的设计与制造
使用CATIA V5R19 (France, Dassault System)设计出两种负型，即负型a、负型b。负型包括三个组件，即底座、左半环和右半环。其中负型b底部开有凹槽，方便冰柱的垂直装入，避免出现冰柱倾倒的状况。借助于熔融堆积成型技术制造出负型组件，将负型的三维实体模型以STL格式保存，导入熔融堆积成型设备，以ABS为材料，制造出负型组件，去除负型表面的残留丝线，装配，获得支架的组合式负型模具。
[0018]2)载药浆料的制备
取0.6gPLGA溶于Iml 二氯甲烷，后加入1.4g纳米级β -TCP，最后加4ml去离子水，置于震荡研磨仪，震荡频率设置为15Hz，震荡lh，使浆料混合均匀，取出备用，此种浆料需制备同样的两份A、B。用电子天平称取质量分别为1:6.5mg、I1:1.625mg的BMP-2，取两只试管，在试管内滴加0.5ml的DMSOJf 1、II两份BMP-2加入到两只试管内，震荡，待充分溶解后，即制备出 BMP-2 与 DMSO 的混合溶液 C1: (0.5mlDMS0+6.5mg BMP-2)、C π: (0.5ml DMSO+ 6.5mg BMP-2)，将C ^C11分别加入A、B中，再次置于震荡研磨仪，震荡频率设置为15Hz，震荡0.2h，使浆料与BMP-2溶液混合均匀，取出，置真空干燥机中真空消泡，去除浆料中存在的气泡，制备出载药浆料A+ CmB+ C11,备用。
[0019]3)内层载药骨支架G1的制备
如图2所示，将载药浆料A+ C i负压载入负型a ;将灌入浆料的负型a置于-42°C的低温环境中3h后，将冷冻干燥机内部的真空度降到18-30pa之间，之后每隔2小时抽真空一次，使真空度保持在18-30pa之间；该操作48h后，取出负型，拆除负型；后将所得骨支架用刀片裁切成2mm高，即得内层载药支架G1 (PLGA/β-TCP+ ΒΜΡ-2 (2.42 X 10_4mol/kg))。
[0020]4)制备冰柱
如图3所示，将去离子水滴加到负型a，置于冷冻干燥机中迅速冷冻，、拆除负型，取出冰柱，装入负型b中心位置。
[0021]5)外层载药骨支架G2的制备
将浆料B+ C11负压载入已装有冰柱的负型b，注意要使浆料充分灌入负型，将灌入浆料的负型b置于-42°C的低温环境中3h后，将冷冻干燥机内部的真空度降到18-30pa之间，之后每隔2小时抽真空一次，使真空度保持在18-30pa之间；该操作48h后，取出负型，拆除负型，即得到具有环状外形的骨支架G2 (PLGA/ β -TCP+ BMP-2 (6.06 X 10_5mol/kg))。
[0022]6)载药支架的封装
将浆料B+ C11负压载入G2中心孔洞中，将浆料灌至距底部1/3高度处，冻干，冷冻干燥完成后，将G1装入G2的中心孔洞中，将浆料B+ C11负压载AG2中心孔洞中，完全灌满孔洞，冻干，实现封装。
【权利要求】
1.一种基于纳米材料仿生载药梯度缓释骨支架的制备方法，其特征在于，工艺步骤如下: 1)负型a、负型b的设计与制造:设计出两种负型，即负型a、负型b;负型包括三个组件，即底座、左半环和右半环；所述负型b底部开有凹槽，方便冰柱的垂直装入，避免冰柱倾倒；应用熔融堆积成型法制造出负型的各个组件，装配好后备用； 2)载药浆料的制备:将生物材料PLGA溶于二氯甲烷，后加入纳米级β-TCP和去离子水，置于震荡研磨仪，使浆料混合均匀，制备出两份同样的浆料A、B ;分别将质量为1、II的骨形态发生蛋白BMP-2溶解于DMSO，制备出混合溶液C丨、C11,后将C M C11分别加入A、B中，再次置于震荡研磨仪，使浆料与药物混合均匀，取出，置于真空干燥机中真空消泡，去除浆料中存在的气泡；制备好的浆料A+ CmB+ C u，备用； 3)内层载药骨支架61的制备:将浆料A+C丨负压灌入负型a，将灌入浆料的负型a在低温真空环境下冷冻干燥后，取出，拆除负型，所得骨支架经后处理得到内层载药骨支架G1 ； 4)冰柱制备:将去离子水灌入到负型a中，低温冷冻，待完全结冰后，拆除负型，取出冰柱，将冰柱装入负型b中心位置； 5)外层载药骨支架G2的制备:将浆料B+C π负压灌入已装有冰柱的负型b，将灌入浆料的负型b在低温真空环境下冷冻干燥后，取出，拆除负型，得到外层载药骨支架G2 ;将支架62中心的冰柱升华后，形成具有环状外形的外层载药骨支架G2 ； 6)骨支架的封装:将浆料B+C π负压灌入外层载药骨支架G2的中心孔洞中，使浆料灌至距底部1/3高度处，冷冻干燥；取出后，将内层载药骨支架G1装入外层载药骨支架G2的中心孔洞中；最后将浆料B+ C11负压灌入外层载药骨支架G2中心孔洞中，灌满孔洞封装内层载药骨支架G1，冷冻干燥，最终制得仿生载药梯度缓释骨支架。
2.根据权利要求1所述的基于纳米材料仿生载药梯度缓释骨支架的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的条件为:温度为-42—-48°C之间，冷冻干燥机内部的真空度为18-45pa，处理时间 46-48h。
3.根据权利要求1所述的基于纳米材料仿生载药梯度缓释骨支架的制备方法，其特征在于，所述浆料A+ C1的载药浓度为2.42 X 10_4 mol/kg，浆料B+ C11的载药浓度为6.06X105mol/kg。
【文档编号】A61L27/54GK103908702SQ201410084819
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】高海涛, 林柳兰, 董洋洋, 陆宇杰, 胡庆夕 申请人:上海大学