一种肿瘤双靶点放射性分子探针及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种RGD-BBN双靶点放射性分子探针及其制备方法，该探针包含RGD和BBN两个肿瘤结合模序，之间的连接剂PEG4分子（PEG=polyethyleneglycol）起到增加模序之间距离并调节体内药代动力学特性的作用。与单靶点分子探针相比，该双靶点探针能够增加肿瘤的摄取，达到更好的显像诊断效果。该探针通过双功能螯合剂HYNIC将放射性核素99mTc标记到RGD-nPEG4-BBN多肽分子上，在体内标记探针通过RGD和/或BBN的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术，对integrinαvβ3和/或GRPR阳性肿瘤进行显像诊断。
【专利说明】一种肿瘤双靶点放射性分子探针及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤诊断放射性药物，特别涉及用于integrin ανβ3阳性和/或胃泌素释放肽受体(GRPR)阳性肿瘤显像诊断的RGD-BBN双靶点放射性分子探针及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤生长过程中关键的环节是肿瘤血管生成，没有新血管生成的肿瘤在长到几个厘米大小之后便不能再继续生长。肿瘤血管生成被各种蛋白分子调控，其中最为关键的分子包括integrin ανβ3。Integrin α νβ 3是一种细胞外基质受体，它是由α和β两个亚基组成的异源二聚体跨膜糖蛋白。Integrin α νβ 3是整合素家族的重要成员，作为与新生血管相关的分子标志物之一，它高表达在新生血管内皮细胞表面和某些肿瘤细胞表面(成神经细胞瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌等)，而在已存在的血管和正常组织中不表达或表达很低。Integrin α ν β 3在肿瘤生长和转移过程中的高度限制表达，使其成为一个非常有吸引力的靶点，用于肿瘤的诊断和治疗。胃泌素释放肽受体(GRPR)属于蛙皮素样肽(bombesin-like peptide, BLP)受体家族中的一员。GRPR在正常组织和肿瘤组织中的激活作用有重要的生长效应，且在恶性肿瘤中的表达比在正常的人体组织更为普遍。在小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、神经母细胞瘤中GRPR异常表达或过度表达。GRPR在多种人类肿瘤的发生、发展、侵润等方面发挥重要作用。
[0003]研究证实含有RGD (Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的配体与integrin α νβ 3具有高亲和力和特异性。不同放射性核素标记的RGD序列配体,如RGD环肽二聚体和四聚体等已被用于肿瘤的显像和治疗研究。蛙皮素(bombesin, BBN)是一种含有14个氨基酸残基的生物活性多肽，具有广泛的生物学功能，大量研究证实，在各种肿瘤:结肠癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等中均有BBN受体的异常高表达，其中以胃泌素释放肽受体为主，BBN与GRPR具有很高的亲和力。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种RGD-BBN双靶点放射性分子探针及其制备方法，该探针包含RGD和BBN两个肿瘤结合模序,之间的连接剂PEG4分子(PEG = polyethylene glycol)起到增加模序之间距离并调节体内药代动力学特性的作用。与单靶点分子探针相比，该双靶点探针能够增加肿瘤的摄取，达到更好的显像诊断效果。该探针通过双功能螯合剂HYNIC将放射性核素99mTc标记到RGD-nPEG4-BBN多肽分子上，在体内标记探针通过RGD多肽和/或BBN的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术，对integrin ανβ3和/或GRPR阳性肿瘤进行显像诊断。
[0005]本发明的目的是通过以下技术实现的: 一种RGD-BBN双靶点放射性分子探针，包括RGD多肽、BBN多肽和放射性核素99mTc,所述RGD多肽和BBN多肽之间用PGE4连接形成RGD_nPEG4_BBN多肽，所述RGD_nPEG4_BBN多肽和99mTc用HYNIC连接，所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针为99niTc-HYNIC-RGD-nPEG4-BBN，所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针为无色透明液体针剂。
[0006]进一步的，连接所述RGD多肽和BBN多肽的连接剂为两个PGE4分子。
[0007]进一步的，所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针为99mTc-HYNIC-RGD_2PEG4_BBN。
[0008]本发明的另一目的是通过以下技术方案实现的:
一种RGD-BBN双靶点放射性分子探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤:
1)RGD-nPEG4-BBN 的合成
米用固相合成方法，从Fmoc-Met-Rink amide MBHA resin开始逐步合成BBN ;以trityl (Trt)保护侧链 histidine (His)和 glutamine (Gin),米用 Boc 保护 tryptophan(Trp),将 Fmoc 从 Glu 移除后获得产物[cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) -mPEGj -Glu- (mPEG4-Aca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)，表示为 RGD_nPEG4_BBN，得到产品经分析型HPLC和ES1-MS质谱分析确认为预期产物RGD-nPEG4-BBN ；
2)HYNIC-RGD-nPEG4-BBN 的合成
将SBz-HYNIC和步骤I)中获得的RGD_nPEG4_BBN溶于DMF中，用DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，即得到所述HYNIC-RGD-nPEG4-BBN ；
3)99mTc-HYNIC-RGD-nPEG4-BBN 的制备
配制含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和HYNIC-RGD-nPEG4-BBN的混合液500 μ L于10 mL西林瓶中，加入1.0-1.5 mL的浓度为10^50 mCi的Na99mTcO4溶液，100° C水浴加热西林瓶，反应20~25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，即制成所述的RGD-BBN双靶点放射性分子探针。
[0009]进一步的，所述步骤3)中所述含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和HYNIC-RGD-nPEG4-BBN的混合液中，各物质的含量为:
含三苯基膦三磺酸钠5.0 mg
三轻甲基甘氨酸6.5 mg
琥珀酸二钠38.5 mg
琥珀酸12.7 mg
HYNIC-RGD-nPEG4-BBN 20 μ g。
[0010]进一步的，所述步骤I)中分析性HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备Zorbax C18半制备柱(9.4 mmX250 mm, 100入pore size),梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25 mM NH4OAc, B为乙腈，淋洗梯度设定为起始时90% A和10%B, 5 分钟时 85% A 和 15% B, 30 分钟时 65% A 和 35% B, 32-36 分钟时 50% A 和 50% B。
[0011]进一步的,所述RGD-BBN双祀点放射性分子探针可用于制备integrin ανβ3和/或胃泌素释放肽受体(GRPR)阳性肿瘤显像诊断的放射性药物药物。
[0012]本发明所述的RGD-BBN双靶点放射性分子探针与现有技术相比的有益效果为:
1、本发明RGD-BBN双靶点多肽放射性探针药物，将RGD和BBN多肽相连，以使其能同时与细胞表面以及肿瘤新生血管的integrin α ν β 3和胃泌素释放肽受体相结合，这样会进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的肿瘤显像诊断效果；2、本发明在RGD多肽和BBN多肽之间引入PEG4分子，以进一步改善药代动力学特性，特别是从非肿瘤组织的清除动力学；
3、本发明中使用HYNIC作为双功能螯合剂，同时使用tricine和TPPTS作为协同配体从而使“99mTc-HYNIC核”具有更好的体内外稳定性。
[0013]以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为RGD-2PEG4_BBN的合成步骤示意图；
图2为肿瘤RGD-BBN双靶点结合示意图；
图3为RGD-2PEG4-BBN及其99mTc标记物结构示意图；
图4为99mTc-RGD-2PEG4-BBN在Lewis肺癌C57小鼠模型中的体内分布结果；
图5为注射99niTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN后I h Lewis肺癌C57小鼠模型的伽马显像图。
[0016]
【具体实施方式】
[0017]本发明实施例中所米用的材料:Dicyclcohexylcarbodiimide (DDC,N,N’- 二环己基碳二亚胺)，N,hydroxysuccinimide (NHS, N-羟基琥拍酰亚胺)，succinic acid (琥拍酸)，disodium succinate hexahydrate (玻拍酸二钠)，trisodium triphenylpheosphine-3, 3'
，3’’-trisulfonate (TPPTS,三苯基勝三横酸钠)，N, N-Dimethylform amide (DMF,N，N_ 二甲基甲酰胺)，tricine (三轻甲基甘氨酸)均购自美国Sigma-Aldrich公司。HYNIC-NHS(联肼尼克酰胺)购自美国Noca-biochem公司。RGD多肽和BBN多肽单体购自美国P印tideInternational公司。Na99mTcO4洗脱液购自北京原子高科股份有限公司。
[0018]实施例1
一种RGD-BBN双靶点放射性分子探针，包括RGD多肽、BBN多肽和放射性核素99mTc,所述RGD多肽和BBN多肽之间用PGE4连接形成RGD_nPEG4_BBN多肽，所述RGD_nPEG4_BBN多肽和99mTc用HYNIC连接，所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针为99niTc-HYNIC-RGD-nPEG4-BBN，所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针为无色透明液体针剂。
[0019]所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针的制备方法，包括以下步骤:
1)RGD-nPEG4-BBN 的合成
米用固相合成方法，从Fmoc-Met-Rink amide MBHA resin开始逐步合成BBN ;以trityl (Trt)保护侧链 histidine (His)和 glutamine (Gin),米用 Boc 保护 tryptophan(Trp),将 Fmoc 从 Glu 移除后获得产物[cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) -mPEGj -Glu- (mPEG4-Aca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)，表示为 RGD_nPEG4_BBN，得到产品经分析型HPLC和ES1-MS质谱分析确认为预期产物RGD-nPEG4-BBN ；
2)HYNIC-RGD-nPEG4-BBN 的合成
将SBz-HYNIC和步骤I)中获得的RGD_nPEG4_BBN溶于DMF中，用DIEA调节pH值至
8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，即得到所述HYNIC-RGD-nPEG4-BBN ；3)99mTc-HYNIC-RGD-nPEG4-BBN 的制备
配制含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和HYNIC-RGD-2PEG4-BBN的混合液500 μ L于10 mL西林瓶中，加入1.0-1.5 mL的浓度为10^50 mCi的Na99mTcO4溶液，100° C水浴加热西林瓶，反应20~25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，即制成所述的RGD-BBN双靶点放射性分子探针。
[0020]进一步的，所述步骤3)中所述含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和HYNIC-RGD-nPEG4-BBN的混合液中，各物质的含量为:
含三苯基膦三磺酸钠5.0 mg
三轻甲基甘氨酸6.5 mg
琥珀酸二钠38.5 mg
琥珀酸12.7 mg
HYNIC-RGD-nPEG4-BBN 20 μ g。
[0021]进一步的，所述步骤I)中分析性HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备
Zorbax C18半制备柱(9.4 mmX 250 mm, 100人pore size),梯度淋洗36分钟，流速
2.5mL/min，其中流动相A为25 mM NH4OAc, B为乙腈，淋洗梯度设定为起始时90% A和10%B, 5 分钟时 85% A 和 15% B, 30 分钟时 65% A 和 35% B, 32-36 分钟时 50% A 和 50% B。
[0022]进一步的,所述RGD-BBN双祀点放射性分子探针可用于制备integrin α νβ 3和/或胃泌素释放肽受体(GRPR)阳性肿瘤显像诊断的放射性药物。
[0023]实施例2
本实施例以99mTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN多肽放射性分子探针及其制备方法为例。
[0024]RGD-BBN双靶点放射性分子探针中包括RGD多肽和BBN多肽以及放射性核素99mTc。所述RGD-BBN多肽和99mTc用HYNIC连接，RGD和BBN之间用两个PGE4分子连接。所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针为99mTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN，为无色透明液体针剂。
[0025]99mTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN 制备方法如下:
1) RGD-2PEG4-BBN 的合成:采用固相合成方法，从 Fmoc-Met-Rink amide MBHA resin开始逐步合成 BBN。以 trityl (Trt)保护侧链 histidine (His)和 glutamine (Gin),采用 Boc 保护 tryptophan (Trp)0 将 Fmoc 从 Glu 移除后获得产物[cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)-PEG4]-Glu-(PEG4-Aca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-Met-NH2)(表示为RGD-2PEG4-BBN)。得到产品经分析型HPLC和ES1-MS质谱分析确认为预期产物RGD-2PEG4-BBN。参见图1。
[0026]2 )HYNIC-RGD-2PEG4-BBN 的合成:将 SBz-HYNIC 和 RGD_2PEG4_BBN 溶于 DMF 中，用DIEA调节pH值至8.5-9.0,室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干。
[0027]3)99niTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN 的制备:配制含三苯基膦三磺酸钠(TPPTS) 5.0mg,三轻甲基甘氨酸(tricine)6.5 mg，琥拍酸二钠38.5 mg，琥拍酸12.7 mg和20 μ g的HYNIC-RGD-2PEG4-BBN的混合液500 μ L于10 mL西林瓶中，加入1.0-1.5 mL的浓度为10^50 mCi的Na99mTcO4溶液，100 ° C水浴加热西林瓶反应20~25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制成RGD-BBN双靶点放射性分子探针。
[0028]对依据本发明方法制备的RGD-2PEG4_BBN双靶点多肽放射性分子探针99mTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN 取样进行放射性 HPLC 分析(使用 LabAlliance HPLC 系统，配备
放射性在线检测器和Zorbax C18分析柱(4.6 mm x 250 mm, 300人pore size),梯度淋洗
25分钟，流速1.0 mL/min，其中流动相A为25 mM NH4OAc(pH 5.0)，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始至2分钟时90% A和10% B, 5分钟时85% A和15% B, 20分钟时80% A和20% B,25 分钟时 90% A 和 10% B), 99mTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN 的标记率 >95%，经 S印-Pak C18 柱纯化后放射化学纯度>98%。
[0029]图3 为 99niTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN 的化学结构示意图。
[0030]99mTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN 在荷 Lewis 肺癌 C57 小鼠生物分布:将荷 Lewis 肺癌C57小鼠随机分成分成4组，每组5只。经尾部静脉注射10 yCi/只，选取注射后I h、2h、4 h和8 h四个时间点，准确计时，摘眼球取血，短颈处死，取主要脏器，称重并测量放射性CPM计数，经衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量率(％ID/g)。在Lewis肺癌C57小鼠模型中，99mTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN的肿瘤具有较高的摄取(如图4所示)。图5为荷Lewis肺癌C57小鼠注射99mTc-HYNIC-RGD_2PEG4_BBN的伽马显像图(箭头指示肿瘤部位)。注射后I h肿瘤清晰可见(图5左)，通过过量的未标记的RGD-2PEG4-BBN能够有效封闭99mTc-HYNIC-RGD-2PEG4-BBN的肿瘤摄取(图5右)，证明了肿瘤显像的特异性(箭头指示肿瘤部 位)。
【权利要求】
1.一种RGD-BBN双靶点放射性分子探针，包括RGD多肽、BBN多肽和放射性核素99mTc,其特征在于，所述RGD多肽和BBN多肽之间用PGE4连接形成RGD_nPEG4_BBN多肽，所述R⑶-nPEG4-BBN多肽和99mTc用HYNIC连接，所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针为99mTc-HYNIC-RGD-nPEG4-BBN,所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针为无色透明液体针剂。
2.根据权利要求1所述的RGD-BBN双靶点放射性分子探针，其特征在于，连接所述RGD多肽和BBN多肽的连接剂为两个PGE4分子。
3.根据权利要求2所述的RGD-BBN双靶点放射性分子探针，其特征在于，所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针为99mTc-HYNI C-RGD-2PEG4-BBN。
4.一种如权利要求1所述的RGD-BBN双靶点放射性分子探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: 1)RGD-nPEG4-BBN 的合成 米用固相合成方法，从Fmoc-Met-Rink amide MBHA resin开始逐步合成BBN ;以trityl (Trt)保护侧链 histidine (His)和 glutamine (Gin),米用 Boc 保护 tryptophan(Trp),将 Fmoc 从 Glu 移除后获得产物[cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) -mPEGj -Glu- (mPEG4-Aca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)，表示为 RGD-nPEG4-BBN，得到产品经分析型HPLC和ES1-MS质谱分析确认为预期产物RGD-nPEG4-BBN ； 2)HYNIC-RGD-nPEG4-BBN 的合成 将SBz-HYNIC和步骤I)中获得的RGD_nPEG4_BBN溶于DMF中，用DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，即得到所述HYNIC-RGD-nPEG4-BBN ；
3)99mTc-HYNIC-RGD-nPEG4-BBN 的制备 配制含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和HYNIC-RGD-nPEG4-BBN的混合液500 μ L于10 mL西林瓶中，加入1.0-1.5 mL的浓度为10^50 mCi的Na99mTcO4溶液，100° C水浴加热西林瓶，反应20~25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，即制成所述的RGD-BBN双靶点放射性分子探针。
5.根据权利要求4所述的RGD-BBN双靶点放射性分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中所述含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和HYNIC-RGD-nPEG4-BBN的混合液中，各物质的含量为: 含三苯基膦三磺酸钠5.0 mg 三轻甲基甘氨酸6.5 mg 琥珀酸二钠38.5 mg 琥珀酸12.7 mg HYNIC-RGD-nPEG4-BBN 20 μ g。
6.根据权利要求4所述的 RGD-BBN双靶点放射性分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中分析性HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备Zorbax C18半制备柱(9.4 mmX250 mm, 100A poresize)，梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25 mM NH4OAc, B为乙腈，淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B，5分钟时85% A和15% B，30分钟时65% A和35% B，32-36分钟时50% A和50% B。
7.—种如权利要求1所述的RGD-BBN双靶点放射性分子探针的应用，其特征在于，所述RGD-BBN双靶点放射性分子探针可用于制备integrin α ν β 3和/或胃泌素释放肽受体(GRPR)阳性肿 瘤显像诊断的放射性药物。
【文档编号】A61K103/10GK103800923SQ201410084837
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】王凡, 刘昭飞, 贾兵, 史继云, 董诚岩, 赵慧云 申请人:北京大学, 佛山瑞迪奥医药有限公司