一类基于基质金属蛋白酶组织抑制剂-2的抗肿瘤药物制备及用图
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一类基于基质金属蛋白酶组织抑制剂的抗肿瘤药 物及其用途。
【背景技术】：
[0002] 基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs)属于一类Zn2+依赖性内肽 酶，特别是一种分子量为66kDa的跨膜胶原酶（膜型基质金属蛋白酶，MT-1-MMP/MMP-14)， 在正常组织低表达或不表达，但在大部分肿瘤组织中均有较高表达，在很多人类肿瘤的形 成和发展过程中发挥关键作用。鉴于MMP-14的膜定位关系，近年被认为是研宄肿瘤治疗的 一个重要分子靶点。研宄报道，MMP-14涉及前列腺癌、肾癌、乳腺癌、黑素瘤及卵巢癌等的侵 袭和转移过程，并与病人治疗预后较差及生存期短都有密切关系。因此，有效地利用MMP-14 作为靶点，可以提高药物的输送效率，而且，抑制其表达还可以降低肿瘤的恶性度，提高患 者生存率。
[0003] 基质金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs)属于一类古老的真核蛋白；哺乳动物TIMPs家族至少含有四 个成员，即??ΜΡ1、??ΜΡ2、??ΜΡ3和??ΜΡ4,它们的生物学功能极其广泛，主要通过直接或与 微环境中组分产生复杂的相互作用关系调控细胞行为。TMPs家族成员??ΜΡ2,可以通过依 赖或非依赖性抑制MMP-2的活性两种方式重塑细胞外基质，抑制肿瘤血管生成，抑制肿瘤 生长，或涉及自身免疫性疾病、关节炎、心血管疾病等的发生和发展过程。然而，近年临床试 验中开展的TIMP2治疗，并未取得良好的效果。
[0004] 研宄还指出，??ΜΡ2与肿瘤细胞的结合方式存在一种MMP-14依赖性途径，具有一 定的特异性，也就是说，如果细胞表面存在MMP-14,并且有??ΜΡ2的参与，就会形成一个三 分子结构的复合体MMP-14/TIMP2/MMP-2,该机制目前多应用于肿瘤细胞的体外侵袭和迀移 研宄中。但在体内，肿瘤的侵袭尤其是转移具有时间和空间的依赖性，单一因素并不能促 使其即刻发生。基于上述两点，本实验室首次利用??ΜΡ2作为一种药物输送载体，并根据它 与MMP-2及MMP-14之间的复杂作用关系作为靶向依据，将具有高效细胞毒性的化疗药物输 送至肿瘤部位。
[0005] 辅基蛋白（LDP)的空间结构可以形成一个疏水口袋，保护具有强烈杀伤肿瘤细胞 活性的稀二炔发色团（Active enediyne chromophore，AE)，在体外可以通过基因工程方法 构建，且具有稳定的生物学活性；此外，LDP蛋白所含的相关基团可以进行定点修饰，与其 它抗肿瘤药物结合，如平阳霉素及紫杉醇等。本实验室已有平阳霉素（pingyangmycin, PYM) 与巯基化LDP进行偶联的实验研宄报道。
[0006] 在实验研宄的基础上，制备得到基于Ι?ΜΡ2的药物输送蛋白 LDP-HMP2 (HMP2-based protein, TIBP)，它不仅能够作为药物输送载体，还可以发挥一定 的生物学调控功能，更具有使用安全性特征。本发明所述一类基于基质金属蛋白酶组织抑 制剂-2的抗肿瘤药物的制备及用途，迄今尚未见有国内外的相关报道。
【发明内容】
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[0007] 本发明的目的之一是，提供一类基于基质金属蛋白酶组织抑制剂_2的抗肿瘤药 物，其既具有靶向性，又具杀伤性的抗肿瘤作用。
[0008] 本发明的目的之二是，提供一种药物输送载体的选择方案，利用天然存在的基质 金属蛋白酶组织抑制剂-2作为研宄对象，应用安全性好。
[0009] 本发明的目的之三是，提供该输送蛋白的编码基因。
[0010] 本发明的目的之四是，提供以上述蛋白为活性成分的抗肿瘤药物及其用途。
[0011] 目前国内外文献报道有关TIMP2在抗肿瘤研宄中的应用，大多涉及到其可能存在 的作用机制，极少有利用TIMP2作为载体，输送高效抗肿瘤药物进行临床前或临床治疗的 研宄。
[0012] 本发明通过基因工程技术构建基于??ΜΡ2,同时包含LDP蛋白（HMP2-based protein，TIBP)的重组载体，并通过毕赤酵母分泌表达系统制备目的蛋白，经纯化及相关的 活性评价，获得一种多功能的药用蛋白，有效避免原核表达系统中包涵体复性的不利因素， 更好地保证其生物学活性。
[0013] 本发明所提供的一种药物输送蛋白，其结构为：辅基蛋白LDP-连接肽（G4S) 2-基 质金属蛋白酶组织抑制剂-2 0?ΜΡ2);所述蛋白具有SEQ ID N0:4氨基酸序列。
[0014] 其中，所述辅基蛋白LDP具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列，共110个氨基酸；所 述基质金属蛋白酶组织抑制剂-20?ΜΡ2)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列，共194个氨 基酸。此外，辅基蛋白LDP与??ΜΡ2之间的连接肽具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
[0015] 另一方面，本发明提供所述输送蛋白的编码基因，具有SEQ ID N0:5所示核苷酸序 列。
[0016] 基于基质金属蛋白酶组织抑制剂_2的输送蛋白能够携带的化疗药物，包括但不 限于烯二炔类抗肿瘤化合物如力达霉素发色团AE、还可以为平阳霉素，紫杉醇等。本发明选 择活性较强的力达霉素发色团AE进行研宄。
[0017] 再一方面，本发明还提供一种基于??ΜΡ2的高效抗肿瘤药物TIBP-AE在裸鼠移植 瘤模型中的治疗作用。优选地，所述抗肿瘤药物应用于治疗人食管鳞癌。
[0018] 综上所述，本发明通过基因工程技术构建一种新型蛋白，既能够靶向基质金属蛋 白酶，又含有强烈杀伤肿瘤细胞活性的烯二炔发色团的保护蛋白LDP。目前，尚未见有利用 基质金属蛋白酶组织抑制剂-2作为药物输送载体的报道。
[0019] 本发明的优点在于，所述基于??ΜΡ2的多功能蛋白TIBP，能够较好地保留??ΜΡ2的 生物学功能，而且属于一种天然存在的组织抑制剂，具有应用安全性特点，表现出更好的应 用前景。此外，基于TIMP2的新型抗肿瘤药物TIBP-AE对人食管鳞癌细胞KYSE150裸鼠移 植瘤的治疗效果显著，因而，此种药物输送载体的选择具有较好的创新性。
【附图说明】：
[0020] 图I-TIBP的基因构建示意图、表达菌株的筛选、鉴定及纯度检测
[0021] 其中：图IA为TIBP的基因构建示意图；
[0022] 图IB为不同菌株蛋白表达水平的电泳图谱（I :蛋白分子量标准，2 :对照，3-5 :分 别为不同菌株的蛋白分泌情况）；
[0023] 图IC为纯化产物的Western blot检测结果；
[0024] 图ID为TIBP纯度的HPLC检测结果。
[0025] 图2-TIBP与肿瘤细胞之间的结合关系分析
[0026] 其中：图2A为不同来源细胞MMP-2及MMP-14表达水平的Western blot检测结 果；
[0027] 图2B为免疫共沉淀法分析TIBP与细胞之间存在的结合方式。
[0028] 图3-ELISA法分析不同浓度TIBP及对照蛋白LDP与KYSE150细胞、HT1080细胞、 H460细胞和A549细胞的结合情况。
[0029] 图4-共聚焦方法检测TIBP与KYSE150细胞的结合及被摄取情况
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[0033] 图5-食管鳞癌组织芯片分析TIBP及对照蛋白的选择性结合能力
[0034] 其中：图5A为TIBP对人食管鳞癌组织的结合情况；
[0035] 图5B为对照蛋白LDP对人食管鳞癌组织的结合情况；
[0036] 图5C为结合情况的分类标准；
[0037] 图为根据分类标准对TIBP组结合情况的统计学分析；
[0038] 图5E显示与癌组织/癌旁组织具有结合特异性的典型代表。
[0039] 图6-通过活体成像实验观察TIBP对KYSE150、HT1080和H460裸鼠移植瘤的靶向 情况
[0040] 图7-TIBP和TIBP-AE分别抑制人食管鳞癌KYSE150裸鼠移植瘤的生长情况其中： 图7A为实验过程中，移植瘤的生长曲线图；
[0041] 图7B为实验过程中，对照组及给药组的裸鼠体重变化曲线图。
【具体实施方式】：
[0042] 以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。
[0043] 《实施例1》重组表达载体pHBM-TIBP的构建
[0044] 力达霉素辅基蛋白LDP与??ΜΡ2组成的TIBP基因序列，由南京金斯瑞生物科技有 限公司合成，并经过OptimumGene?密码子优化技术处理。分子生物学实验中使用的PCR引 物由Invitrogen?公司合成。TIBP的全长序列主要包含编码LDP的核苷酸序列以及编码 TIMP2的核苷酸序列，二者之间通过柔性连接肽（G 4S)2连接，全长基因序列（图1A)插入到 pHBM-9005质粒获得表达载体，经过Sal I内切酶线性化后，回收目的条带，电转化至毕赤 酵母Pichia pastoris GSl 15感受态细胞，获得含有目的基因序列的表达菌株。所述菌株 被命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115-TIBP，于2015年04月10日送交中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其编号为CGMCC No. 10712。
[0045] 《实施例2》TIBP的诱导表达、纯化及鉴定
[0046] 利用实施例1中获得的含重组表达载体的菌株进行小规模诱导表达，筛选出高效 表达菌株。主要步骤为：挑取MD平板上长出的单菌落，分别接种至BMGY培养基（1 %酵母 提取物，2%蛋白胨，1.34% ΥΝΒ，4Χ10-5%生物素，IOOmM pH 6.0磷酸钾缓冲液，1%甘油）， 28-30 °C，280-300rpm，培养至对数期（OD6qq= 2-6)。转接 0.5mL 培养液至 50mL BMGY 培 养基（500mL摇瓶，按彡10%量装瓶），28-30°0,28〇-300印111，培养24-3611。于室温〇?1')， 3, 000 Xg离心5min，弃上清后收集菌体，细胞沉淀转移至50mL BMMY培养基（1 %酵母提取 物，2%蛋白胨，1.34% YNB，4X10_5%生物素，IOOmM pH 6.0磷酸钾缓冲液，1%甲醇）中， 28°C，280-300rpm，培养96h (每隔24h添加100%甲醇至终浓度为1.0% )。取少量发酵液 至I. 5mL Eppendorf管中，于RT，5, 000 Xg离心5min，收集上清。通过12% SDS-PAGE检测 蛋白的表达情况（图1B)。筛选获得的菌株经过发酵条件优化后，进行较大规模的表达。收 取发酵液上清，进行蛋白纯化；由于TIBP的C-末端带有六聚组氨酸标签，因此主要采用GE Healthcare公司产品HisTrap亲和层析柱（5mL)进行纯化，详细步骤可参阅说明书。纯化 产物采用Western blot方法进行鉴定（图1C)，分子量大小与预期接近。之后，通过高效液 相色谱（HPLC，S3000柱，流动相0.1 M PBS，pH 6. 8,1. OmL/min)法检测蛋白纯度；纯化后的 TIBP纯度达95 %以上（图1D)，产量约18mg/L。
[0047] 《实施例3》TIBP与肿瘤细胞亲合能力的分析
[0048] ( 一）：Western blot检测不同肿瘤细胞MMP-2,-14的表达水平
[0049] 取对数生长期的人鳞癌细胞系A431、人非小细胞肺癌细胞系H460和A549、人纤维 肉瘤细胞系HT1080、人胰腺癌细胞系PANC-1、人结肠癌细胞系HCT-15以及人食管鳞癌细胞 系KYSE150