一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，有效解决冬凌草提取物的制备，及该提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用问题，该冬凌草提取物是将冬凌草粉碎为粗粉，用石油醚回流萃取2次，萃取液挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，加乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，醇提液减压浓缩至无醇味，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度0.4g/ml，作为上样药溶液，过AB-8树脂，流动上样，静置12h待充分吸附后，依次用蒸馏水、乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，本发明提取物经反复试验，证明冬凌草提取物具有提高脑缺血耐受能力，有效用于制备抗脑缺血药物，有显著的经济和社会效益。
【专利说明】
一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药，特别是一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用。
【背景技术】
[0002]脑缺血耐受实际上是外界刺激激活机体内的内源性保护机制，从而赋予机体对下一次严重损伤的抵抗能力，尽管物理性预处理手段被证实可诱导脑缺血耐受，但对机体是一种损伤，有的化学药物虽然能够提高耐受但其对耐受形成的机制还不完全清楚，化学药物长期服用的服用后的副作用，对脑缺血疾病的治疗有一定的限制。中药作用温和持久，具有综合治疗的作用，可延缓并发症的发生，其多成分、多靶点的特点在防治脑血管疾病方面有极大的优势，通过“治未病”的方式，诱导缺血耐受时机体的多种内源性保护机制，减轻缺血性脑损伤，成为安全有效的预处理手段。2010版药典记载冬凌草为唇形科植物碎米桠Rabdosia rubescenss (Hems1.)Hara的干燥地上部分，味苦、苷，微寒，归肺、胃、肝经，具有清热解毒，活血止痛之功，用于咽喉肿痛，癥瘕痞块，虫蛇咬伤。主要化学成分有单萜、二萜、三萜等萜类化合物，还含有挥发油、留体、黄酮、生物碱、氨基酸、有机酸、单糖类成分等。现代研究表明冬凌草具有很好的抗肿瘤，抗菌抗炎，增强免疫，抗氧化，降压，抗突变等作用。临床实验表明，其对一些癌症有很好的治疗作用如食管癌、贲门癌、结肠癌、肝癌等，另外，冬凌草对一些炎症也有很好的疗效如治疗化脓性扁桃体炎，急慢性咽喉炎及慢性气管炎等，冬凌草成分中的冬凌草甲素是一种低毒性、抗肿瘤活性好，被称为“紫杉醇第二”。但目前，还没有发现其对脑缺血耐受的任何报道。
【发明内容】
[0003]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，可有效解决冬凌草提取物的制备，及该提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用问题。
[0004]本发明解决的技术方案是，冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是将冬凌草粉碎为粗粉，每次加10倍重量的石油醚回流萃取2次，每次萃取lh，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加10倍重量的质量浓度50%乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为18-22%，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度0.4g/ml，作为上样药溶液，过AB-8树脂；原生药与AB-8树脂的重量比为1: 8，流动上样，静置12h待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗,弃去水液,再用3倍柱体积的质量浓度为10%的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80%的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，提取率6-8%，其中冬凌草总黄酮含量为55-60% (注:因冬凌草质量和提取中所用的溶剂质量有所不同，因此，会影响提取物中总黄酮的含量，但经反复多次试验，总黄酮含量基本在55-60%，平均为 58% )。
[0005]本发明提取物经反复试验，证明冬凌草提取物具有提高脑缺血耐受能力，有效用于制备抗脑缺血药物，从而实现冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，开拓了冬凌草的新用途和药用价值，有显著的经济和社会效益，是冬凌草药物应用上的创新。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1为本发明对脑缺血耐受模型大鼠死亡率的影响图。
[0007]图2为本发明对脑缺血耐受模型大鼠神经功能缺失评分的影响图。
[0008]图3为本发明对脑缺血耐受模型大鼠血清中NSE水平的影响图。
[0009]图4为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑梗死率的影响图。
[0010]图5为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中TNF- a、IL-1 β、IL_8含量的影响图。
[0011]图6为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中BAX含量的影响图。
[0012]图7为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中Bcl-2含量及Bcl-2/Bax比率的影响图。
[0013]图8为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中Caspase-3含量的影响图。
[0014]图9为本发明对大鼠脑组织海马CAl和CA3区⑶NF阳性细胞表达率的影响图。
[0015]图10为本发明对大鼠脑组织海马CAl和CA3区BDNF阳性细胞表达率的影响图。
[0016]图11为本发明对大鼠脑组织海马CAl和CA3区NF κ Βρ65阳性细胞表达率的影响图。
【具体实施方式】
[0017]以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0018]本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
[0019]实施例1
[0020]冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是，将冬凌草Ikg粉碎为粗粉，每次加1kg石油醚回流萃取2次，每次lh，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加1kg质量浓度50%乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为19%，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度
0.4g/ml，作为上样药溶液，过AB-8树脂；原生药与AB-8树脂的重量比为1: 8，流动上样，静置12h待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗，弃去水液，再用3倍柱体积的质量浓度为10%的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80%的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，得率为7%，其中冬凌草总黄酮含量为58%。
[0021]实施例2
[0022]冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是，将冬凌草1.5kg粉碎为粗粉，每次加15kg石油醚回流萃取2次，每次lh，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加15kg质量浓度50%乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为22%，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度
0.4g/ml，作为上样药溶液，过AB-8树脂；原生药与AB-8树脂的重量比为1: 8，流动上样，静置12h待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗，弃去水液，再用3倍柱体积的质量浓度为10 %的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80 %的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，得率为8%，其中冬凌草总黄酮含量为60%。
[0023]实施例3
[0024]冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是，将冬凌草0.5kg粉碎为粗粉，每次加5kg石油醚回流萃取2次，每次lh，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加5kg质量浓度50%乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为18%，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度
0.4g/ml，作为上样药溶液，过AB-8树脂；原生药与AB-8树脂的重量比为1: 8，流动上样，静置12h待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗，弃去水液，再用3倍柱体积的质量浓度为10 %的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80 %的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，得率为6%，其中冬凌草总黄酮含量为55%。
[0025]上述冬凌草提取物经反复科学试验，证明冬凌草提取物(包括冬凌草总黄酮)可改善大、小鼠神经功能缺失评分，减少梗死面积，减轻缺血损伤，改善大脑皮质及海马区的病变；减轻因酸度过高对脑组织的损伤，降低因能量代谢障碍对脑组织的损伤；清除自由基，抑制脂质过氧化，从而减轻了脑缺血再灌注损伤程度；抑制缺血后炎症反应，及改善炎症引起的一系列级联反应介质和细胞因子，对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。
[0026]研究还表明，缺血预处理时间及强度是产生脑缺血耐受的两个主要因素。脑缺血强度太弱、时间太短不足以产生耐受，强度太强、时间过长则会导致脑组织不可逆的缺血损伤。要进行脑缺血耐受机制的研究，最重要的是建立一个良好的动物模型，找出最佳的缺血预处理时间剂量、诱导时间窗，才能进一步进行其机制的研究。脑组织神经细胞是缺血动物易受损伤的部位之一，通过观察不同缺血预处理诱导脑缺血耐受产生的不同时间窗对小鼠组织形态学的影响，发现小鼠夹闭双侧颈总动脉阻断血流1min做缺血预处理，以120h为诱导时间窗，再次夹闭双侧颈总动脉30min，脑组织水肿程度减轻，病理改变轻，呈现保护效应。通过对大鼠脑缺血耐受模型(2V0+MCA0)预处理时间剂量、诱导时间窗实验研究，发现大鼠采用短暂阻断双侧颈总动脉lOmin，以72h为诱导时间窗，再采用短暂性大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，作为再次缺血损伤模型阻断中动脉血流2h，再灌注22h后，脑组织水肿程度减轻，梗死区范围缩小，保护效应强。
[0027]本申请通过复制上述小鼠脑缺血耐受模型、大鼠脑缺血耐受模型为研究对象，观察冬凌草提取物对脑缺血耐受模型动物的作用，深入探讨其内源性保护作用及相关细胞因子和神经营养因子的变化。为临床应用冬凌草干预和治疗缺血性脑中风提供实验依据，有关试验资料如下:
[0028]I实验材料
[0029]1.1实验药物
[0030]本发明冬凌草提取物(包括冬凌草总黄酮)。
[0031]尼莫地平片，主要成分:尼莫地平。适用于各种原因蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛和急性脑血管病恢复期的血液循环改善。批号:130660，厂家:亚宝药业集团股份有限公司。
[0032]脑络通胶囊，主要成分:丹参、川芎、黄芪、甲基橙皮苷、盐酸托哌酮、维生素B6。功能主治:通经活络，补血活气，具有扩张血管，增加脑血流量作用，用于脑动脉硬化，脑血栓，中风后遗症等各种脑血管疾病，气虚血瘀证引起的头痛，眩晕，半身不遂，肢体发麻，神疲乏力等症。批号:130901，厂家:吉林金宝药业股份有限公司。
[0033]1.2实验试剂
[0034]注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号:C1206807 ；
[0035]氯化钠注射液，河南双鹤华利药业有限公司，批号:130629 ；
[0036]水合氯醛，天津市光复精细化工研究所，批号:20120827 ；
[0037]甲醛(分析纯)，烟台市双双化工有限公司，批号:20130702 ；
[0038]羧甲基纤维素钠，天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号:20120418 ；
[0039]75%医用酒精，新乡市三伟消毒制剂有限公司，批号:20131020 ；
[0040]红四氮唑:上海山浦化工有限公司，批号:20120508 ；
[0041]磷酸氢二钠，天津市致远化学试剂有限公司，批号:20130402 ；
[0042]磷酸二氢钠，天津市化学试剂三厂，批号:20051028 ；
[0043]Rat NSE 检测试剂盒，厂家:R&D，批号:20131202B ；
[0044]Rat TNF-αELISA检测试剂盒，厂家:R&D，批号:20131202B;
[0045]Rat IL-8ELISA 检测试剂盒，厂家:R&D，批号:20131202B ;
[0046]Rat IL-lβELISA检测试剂盒，厂家:R&D，批号:20131202B;
[0047]Rat BAX ELISA 检测试剂盒，厂家:R&D，批号:20131202B ；
[0048]Rat Bcl_2ELISA 检测试剂盒，厂家:R&D，批号:20131202B ；
[0049]Rat Casp_3ELISA 检测试剂盒，厂家:R&D，批号:20131202B ;
[0050]1.3实验仪器
[0051]MCAO线栓，北京沙东生物技术有限公司，产品号:2838-A4 ；
[0052]SHHW21600S型电热恒温三用水浴锅，上海跃进医疗器械有限公司生产；
[0053]FA2204B电子天平，上海精密科学仪器有限公司生产；
[0054]KDC-160HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；
[0055]B1RAD-68。酶标仪，68OMicroplate Reader, B1-Rad Laboratories ；
[0056]可调式移液器，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；
[0057]专业图像分析系统，NIS-ElementsAR4.10.01。
[0058]1.4实验动物
[0059]Wistar大鼠，雄性，SPF级，体重260_280g，山东鲁抗医药股份有限公司，合格证号:0017228o实验室合格证号SYXK(豫)2010-001。
[0060]2实验方法
[0061]2.1分组与给药:取体重280?300g左右的雄性大鼠128只，随即均匀分为8组即:假手术组，缺血再灌注损伤组，BIT模型组，尼莫地平组，脑络通胶囊组，大、中、小剂量冬凌草提取物组，每组16只。尼莫地平组(阳性对照药为尼莫地平片，给药剂量为20mg/kg,临用前用0.5% CMC配成药物浓度2mg/ml，lml/100g,临床用量的10倍);脑络通胶囊组(阳性对照药为脑络通胶囊，给药剂量为500mg/kg，临用前用0.5% CMC配成药物浓度50mg/ml，lml/100g，临床用量的10倍)；大、中、小剂量冬凌草提取物组(200mg/kg、10mg/kg、50mg/kg,临用前用 0.5% CMC配成药物浓度20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml, lml/100g);假手术组、缺血再灌注损伤组、BIT模型组(灌服同体积0.5% CMC)。
[0062]2.2造模方法:
[0063]2.2.1第一次缺血损伤方法一脑缺血预处理模型
[0064]所有大鼠经10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔麻醉，仰卧固定手术台上，酒精颈部消毒，然后用手术刀作颈部正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，除假手术组、缺血再灌注损伤组外，其余各组大鼠用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，分别阻断血流lOmin，然后恢复灌流，假手术组、缺血再灌注损伤组只暴露双侧颈总动脉，但不阻断血流。动物苏醒后，分别给予相应药物，每天I次，连续给药3天，缺血预处理72h后，即第4次给药后Ih进行MCAO术。
[0065]2.2.2再次缺血损伤方法-大脑中动脉阻塞缺血再灌注损伤模型
[0066]大鼠水合氯醛麻醉，仰卧固定，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，除假手术组大鼠外，其余各组大鼠结扎ECA与CCA，以动脉夹夹闭颈内动脉远心端后，于颈外动脉与颈内动脉分叉处作一切口，从切口处插入线栓，插入深度20_左右，结扎入口处，线栓外留I?2_，缝合皮肤。2h后轻轻提拉所留线头至略有阻力，实现再灌注。假手术组大鼠只暴露动脉，但不阻断血流。手术过程中保持室温23?25°C。
[0067]2.3神经症状评分
[0068]按照Zea Longa5级评分法，于术后24h(即再灌注22h)进行评定，O分及昏迷不醒者或死亡者剔除。评分标准为无明显神经症状，计O分；不能完全伸展左侧前爪，计I分；向左侧旋转，计2分；行走时向左侧倾倒,计3分；不能自行行走,计4分；死亡,计5分。
[0069]2.4血清制备
[0070]再灌注22h后，眼球取血，分离血清，_20°C冰箱保存，用于NSE的测定。
[0071 ] 2.5脑组织取材及处理
[0072]取血后迅速断头完整取脑，立即放入_20°C低温冰箱中，冷却15min后，去掉嗅球、小脑和低位脑干后的剩余部分沿冠状面切成3部分，(第一刀在视交叉冠状面前1_处即第一部分为脑前极至视交叉冠状面前Imm处，第二刀在视交叉冠状面后Imm处即第二部分为视交叉冠状面前后1_处，第二部分约为2_的薄片；第三部分为视交叉冠状面后1_处至尾端的脑组织)。
[0073]2.6脑梗死面积测定
[0074]取第2片脑切片迅速放入以pH = 7.2磷酸缓冲液配置的I % TTC磷酸盐溶液中，随后放入恒温箱中，37°C避光孵育15min，其间轻轻翻动，以利充分染色。取出脑片至于10%甲醛液中避光保存24h，蓝色背景下拍照，正常脑组织为玫瑰红色，梗死部位为白色。用扫描仪扫描图像，输入图像分析系统，计算梗死区域的面积，求出梗死区域面积占总面积的百分比。
[0075]2.7脑组织匀浆制备
[0076]第一部分脑组织，矢状切取左侧脑组织(插线栓侧脑组织)，称重，用生理盐水制备10 %脑匀浆，脑匀浆经3000r/min离心1min，取上清液，分装，至_20 V冰箱保存，用于脑匀浆中 TNF- a、IL-8、IL-1 β、Bcl-2, BAX、Casp-3 的含量测定。
[0077]2.8HE染色及免疫组织化学染色
[0078]第三部分脑组织，常规石蜡包埋，按步骤进行常规HE染色，采用SP免疫组织化学染色法进行BDNF、⑶NF及NF κ Bp65染色。
[0079]2.8.1图像处理
[0080]参照Kato分级方法，光学显微镜下对缺血侧皮质区组织学改变进行分级，标准如下:I级，皮层神经元细胞水肿，变形，无神经元死亡；II级，少数神经元细胞死亡，梗死面积小于缺血侧皮质总面积的1/3 JII级，成片神经元死亡，梗死面积大于左侧皮层总面积的1/3小于总面积的2/3 ;IV级，大片神经元死亡，梗死面积大于左侧皮层总面积的2/3。
[0081]2.8.2免疫组化图像分析
[0082]在Olympus光学显微镜下观察免疫组化染色切片，Olympus数字显微照相机采集图像，在各组动物缺血侧(左侧)皮层、海马区各选取两个视野，计BDNF，⑶NF及NF κ Bp65阳性表达细胞数目，计算阳性细胞表达率。
[0083]2.9 血清中 NSE，脑匀浆中 TNF- a、IL-8、IL-1 β、BAX、Casp-3, Bcl-2 含量的测定
[0084]检测原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被神NSE (或TNF-a、BAX、Casp-3、Bcl-2)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过孵育并彻底洗涤。用底物TMP显色，TMP在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的NSE(或TNF-α、IL_8、IL-1 β、BAX、Casp-3、Bcl-2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定(OD)值，计算样品浓度。
[0085]操作步骤:从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4°C保存。设置标准品孔和样本孔，标准品孔加各种不同浓度的标准品50μ I。样本孔先加待测样本10 μ 1，再加样本稀释液40 μ I ;空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HPR)标记的检测抗体100 μ 1，用封板膜封住反应孔，37°C水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置lmin，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。每孔加入底物A、B各50μ 1，37°C避光孵育15min。每孔加入终止液50 μ 1，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
[0086]绘制标准曲线:在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归，按曲线方程计算各样本浓度值。
[0087]3统计学处理方法
[0088]运用SPSS17.0for windows进行数据资料的统计分析,计量资料采用平均数土标准差(X ±5)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way AN0VA)分析，方差检验齐者用最小显著差数(LSD)法,方差不齐者用Games-Howell法检验，等级资料米用Ridit检验，以P〈0.05为差异有统计学意义。
[0089]4实验结果
[0090]4.1冬凌草提取物(包括冬凌草总黄酮)对脑缺血耐受模型大鼠神经功能缺失评分、死亡率的影响结果见表1、图1、图2
[0091]表I对脑缺血耐受模型大鼠神经功能缺失评分、死亡率的影响()
[0092]组别动物(只) 剂量神经功能缺失死亡率
(mg/kg) 评分(分)(％)
假手术组 _丨2 -0.00±0.00**^0.00
缺血再灌注损伤组 8 - 2.88±0.8450.00
BITftiH.11 - !.9U0.9431.25
尼莫地平组 12 201.17±0.39**δδ25
脑络通胶囊组 11 500 1.27±0.47*iA31.25
大剂量冬凌草提取物组 13 2001.23±0.49**δδ18.75
中剂量冬凌草提取物组 13 1001.15±0.38**αδ18.75
小剂量冬凌草提取物组_9_50_1.44±0.53δα_43.75
[0093]注:与缺血再灌注损伤组比较，ΛΡ〈0.05，△△?〈().01 ;与811'模型组比较，扑〈0.05，**Ρ〈0.01
[0094]大鼠MCAO后出现一定的死亡率及不同程度的神经功能缺损症状，表现为右侧前爪不能完全伸展，行走时向右侧旋转或倾倒，甚至不能行走。与缺血再灌注损伤组相比，BIT模型组及各给药组死亡率明显降低且可显著改善模型大鼠神经缺失症状(Ρ〈0.01)，与BIT模型组相比，尼莫地平组，大、中剂量冬凌草提取物均能显著改善大鼠神经缺失症状(Ρ〈0.01)，脑络通胶囊组能够明显改善大鼠神经缺失症状(Ρ〈0.05)。
[0095]4.2冬凌草提取物对脑缺血耐受模型大鼠血清中NSE水平、脑面积梗死率的影响结果见表2、图3、图4
[0096]表2对脑缺血耐受模型大鼠血清中NSE水平、脑面积梗死率的影响()
[0097]
组别动物剂量NSE脑面积梗死率
C只) Cmg/kg)Cng/ml)(%)
假手术组组12-5.37±0.50**αλ0.00±0.0()**λα
缺血再灌注损伤组8-12.80±0.3541.28±11.36
BIT 模型组11-8.37±0.64λλ33.72±9.57λ
尼莫地平组12206.49土 0.99**δλ30.40±7.10λλ
脑络通胶囊组115()()5.76±1.01**δ/λ25.10±9.37*δδ
[0098]
大剂量冬凌草提取物组 13 200 5.58±?.93**ΛΛ 24.16±5.45**ΛΛ 中剂量冬凌草提取物组 13 I(K) 6.27±1.19**δδ 29.05±9.42αδ 小剂量冬凌草提取物组9_50_7.00±1.40δδ_33.01 土 8.57λ
[0099]注:与缺血再灌注损伤组比较，ΛΡ〈0.05，△△?〈().01 ;与811'模型组比较，扑〈0.05，**Ρ〈0.01
[0100]由图3、图4和上表可知，与假手术组比较，缺血再灌注损伤组血清NSE水平显著增高(P〈0.01);与缺血再灌注损伤组比较，BIT模型组血清NSE水平显著降低(P〈0.01);与BIT模型组比较，尼莫地平组，脑络通胶囊组，大、中剂量冬凌草提取物组血清NSE水平均显著降低(P〈0.01)。与缺血再灌注损伤组比较，BIT模型组及小剂量冬凌草提取物组脑梗死百分比明显降低(P〈0.05)，尼莫地平组，脑络通胶囊组，大、中剂量冬凌草提取物组脑梗死面积百分比显著降低(P〈0.01);与BIT模型组比较，大剂量冬凌草提取物组脑梗死面积百分比明显降低(P〈0.05)，脑络通胶囊组脑梗死面积百分比显著降低(P〈0.01)。
[0101]4.3冬凌草提取物(包括冬凌草总黄酮)对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中TNF- a、IL-1 β、IL-8含量的影响结果见表3、图5
[0102]表3对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中TNF-a、IL-1 β、IL-8含量的影响)
[0103]
【权利要求】
1.一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是将冬凌草粉碎为粗粉，每次加10倍重量的石油醚回流萃取2次，每次萃取lh，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加10倍重量的质量浓度50%乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为18-22%，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度0.4g/ml，作为上样药溶液，过AB-8树脂；原生药与AB-8树脂的重量比为I: 8，流动上样，静置12h待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗，弃去水液，再用3倍柱体积的质量浓度为10%的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80%的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，提取率6-8%，其中冬凌草总黄酮含量为55-60%。
【文档编号】A61P9/10GK104127485SQ201410333111
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】苗明三, 曹珊, 白明, 方晓艳 申请人:河南中医学院