肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统及制备方法和应用，属于肿瘤基因治疗领域。本发明构建的慢病毒载体系统能协同表达GFP/RFP和白喉毒素A片段（DTA）双顺反子，驱动DTA在肿瘤细胞中高效表达，荧光蛋白的表达可用于验证所表达的DTA的有效性，同时，荧光蛋白的表达还可用于准确反映慢病毒包装细胞系的构建和慢病毒包装效果。本发明构建的慢病毒载体系统能特异抑制肿瘤细胞生长和细胞中蛋白质的合成，对肿瘤细胞有特异杀伤效果，可用于肿瘤靶向基因治疗。
【专利说明】肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统 及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 白喉毒素（diphtheriatoxin，DT)只在白喉杆菌的溶源性菌体内产生，因为只有 溶源菌才含有编码该蛋白的结构基因（Tox基因）。白喉毒素致毒机理主要是能抑制真核生 物细胞的胞内蛋白质合成而表现毒性，它能催化真核胞质内NAD+上的ADP核糖基向翻译延 伸因子-2 (EF-2)转移，从而消耗了生物正常代谢过程所需NAD+并阻断真核细胞蛋白质合 成而对细胞致死。同时，白喉毒素的毒性具有很强特异性，具体表现在两个方面：首先，它 只催化NAD+上ADP核糖基向EF-2转移，对NAD+类似物如a -NAD+，NADP+和NADH则不发生 该转移反应；其次，仅真核生物的EF-2作为该反应的受体。
[0003] 白喉毒素的毒性全部集中在白喉毒素Α片段（DTA)上，而片段Α进入细胞后能独 立地表达ADP核糖基转移活性，且编码片段A的基因长度大约只有800个碱基，有利于基 因治疗方面的操作。
[0004] Survivin蛋白（由BIRC5基因编码)在肿瘤细胞中高丰度表达，而在正常组织细胞 中表达丰度很低（很多正常器官和组织中没有发现其表达）。同时，该蛋白能增强肿瘤细 胞的抗凋亡能力，是一种抗凋亡蛋白，这些都表明该基因的异常表达与肿瘤关系紧密。
[0005] 为实现安全的基因治疗，慢病毒整合能力应尽可能被消除。非整合的慢病毒载体 由于病毒组装、反转录、前病毒的入核和病毒的整合过程是分开的，因此，它不仅能避免由 整合入基因组DNA引起插入突变的风险，而且仍具有高效感染广宿主范围的宿主细胞和静 止细胞的优势。
[0006]
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统及制备方法和应 用。
[0007] 本发明首先公开了一种非整合慢病毒载体系统，是将HIV整合酶D64突变为A的 PMDL-D64A以及另外两个包装质粒REV、VSVG连同慢病毒表达载体共转入过量表达突变 EF-2的293T细胞，即在宿主细胞中包装获得非整合慢病毒载体系统；所述的慢病毒表达载 体包括 pPR頂E-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3、pPRME- Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3 ;所述的 非整合慢病毒载体系统是利用Survivin启动子驱动白喉毒素A片段和荧光蛋白协同表达， 其出发载体为 pPR頂E-CMV-GFP-FF3 或 pPRME-CMV-dsRed-FF3。
[0008] 所述的Survivin启动子为269bp长度的Surp-P269启动子。
[0009] 其次，本发明提供了一种所述非整合病毒载体系统的制备方法，包括以下步骤： 步骤1)荧光蛋白基因的克隆：以pPR頂E-CMV-GFP-FF3或pPRME-CMV-dsRed-FF3质粒 为模板，分别高保真PCR扩增GFP和RFP基因，并分别克隆入T/A克隆载体； 步骤2) DTA克隆：以pBSDTA-II的质粒为模板，高保真PCR克隆DTA片段，PCR产物以 Apal和Notl酶按双酶切连接方法克隆入步骤1)的T/A克隆载体中，获得GFP/RFP-DTA的 T/A克隆载体； 步骤3) 口蹄疫病毒2A序列的设计和合成：根据口蹄疫病毒的2A短肽氨基酸序列，设 计并合成寡核苷酸片段，通过退火，连接插入步骤2)中获得的T/A克隆载体的GFP/RFP和 DTA之间，获得GFP/RFP-2A-DTAT/A克隆载体； 步骤4)启动子克隆：以提取的293T细胞基因组DNA为模板，高保真PCR克隆基因启 动子Surp-P269, PCR产物以Apal和Nhel酶按双酶切连接方法克隆入用同种内切酶酶切形 成的线性pPR頂E-CMV-GFP-FF3慢病毒载体，连接形成pPRME-Surp-P269-GFP-FF3表达载 体； 步骤5)慢病毒表达载体的建立：利用双酶切连接方法将GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆载 体中的GFP/RFP-2A-DTA片段分别转移入pPRIME-Surp-P269-GFP-FF3慢病毒表达载体，获 得慢病毒表达载体 pPR頂E-Surp-P269-GFP- 2A-DTA-FF3, pPRME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3 ； 步骤6)慢病毒的包装：在转染前对宿主细胞进行无血清饥饿2小时，将位于整合酶D64 突变为A的PMDL-D64A、REV、VSVG和步骤5 )中的慢病毒表达载体混匀后，再与PEI转染试 剂混匀,共同加入宿主细胞中,6小时后将培养基替换为含体积分数为2%血清的培养基，连 续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得非整合慢病毒载体系统。
[0010] 更具体地，所述非整合病毒载体系统的制备方法，包括以下步骤： 步骤1)荧光蛋白基因的克隆：以pPR頂E-CMV-GFP-FF3或pPRME-CMV-dsRed-FF3质粒 为樽板，GFP if 向引物：5'-GCACCGGTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3' (SEQ ID NO: 1)，末端 为AgeI酶切位点(下划线表示的碱基)，GFP反向引物：5' -ATAGTTTAGCGGCCGCG GGCCCTCTA GACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'（SEQ ID N0:2)，末端为Notl酶切位点（下划线表示的碱基）； RFP if 向引物：5' -GCACCGGTGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGAC-3' (SEQ ID 勵:3)，末端为八861 酶切位点(下划线表示的碱基)，RFP反向引物：5' -ATAGTTTAGCGGC CGCGGGCCCTCTAGACAGGA ACAGGTGGTGGCG-3'（SEQ ID N0:4)，末端为Notl酶切位点（下划线表示的碱基)，高保真PCR 扩增GFP和RFP基因，PCR反应条件为：95° C变性2min，95° C变性20sec-60。C退火 20sec-72° C30sec延伸重复35个循环，72° C延伸5min，并克隆入T/A克隆载体； 步骤2) DTA克隆：以pBSDTA-II的质粒为模板，正向引物：5' -GCGGGCCCATGGACCCTGAT GATGTTG-3'（SEQ ID N0:5)，末端为Apal酶切位点（下划线表示的碱基)，反向引物： 5'-ATAGT TTAGCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTA-3' (SEQ ID N0:6)，末端为 Notl 酶切位点 (下划线表示的碱基)，高保真克隆DTA片段，PCR反应条件为：95° C变性2min，95° C变 性20sec-60。C退火20sec-72。Clmin延伸重复35个循环，72° C延伸5min，PCR产物 以Apal和Notl酶按双酶切连接方法克隆入步骤1)的T/A克隆载体中，获得GFP/RFP-DTA 的T/A克隆载体； 步骤3) 口蹄疫病毒2A序列的设计和合成：合成的核苷酸翻译后对应的氨基酸序列为： SRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID N0:7 )，根据此2A短肽氨基酸序列，设计寡核苷酸 片段，通过退火，连接插入步骤2)中获得的T/A克隆载体的GFP/RFP和DTA之间，获得GFP/ RFP-2A-DTA的T/A克隆载体； 步骤4)启动子克隆：以提取的293T细胞基因组DNA为模板，正向引物：5' -GCGGGCCC CGCGTTCTTTGAAAGCAGTC-3'（SEQ ID N0:8)，末端为Apal酶切位点（下划线表示的碱基)， 反向引物：5' -CTAGCTAGCTGCCGCCGCCGCCACCTCTG-3' (SEQ ID N0:9)，末端为 Nhel 酶切 位点（下划线表示的碱基)，高保真克隆基因启动子，PCR反应条件为：95° C变性2min， 95° C变性20sec-60° C退火20sec-72° C 30sec延伸重复35个循环，72° C延伸 5min，PCR产物以Apal和Nhel酶按双酶切连接方法克隆入用同种内切酶酶切形成的线性 PPRME-CMV-GFP-FF3 慢病毒载体，连接形成 pPRME- Surp-P269-GFP-FF3 表达载体； 步骤5)利用酶切连接方法将GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆载体中的GFP/ RFP-2A-DTA片段分别转移入pPRME-Surp-P269-GFP-FF3慢病毒表达载体，获得 pPRME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3，pPRME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3 ; 步骤6)慢病毒的包装：在转染前对宿主细胞进行无血清饥饿2小时，将位于整合酶D64 突变为A的PMDL (D64A)、以及其他两个包装质粒REV、VSVG和步骤5)中的慢病毒表达载 体混匀后，再与PEI转染试剂混匀后，加入至宿主细胞培养基中，6小时后将细胞培养基替 换为含2%的血清的培养基，连续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得整合缺陷型 的 pPRME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3 和 pPRME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3 慢病毒。 [0011] 本发明还要求保护一种所述非整合慢病毒载体系统的应用，将所述的非整合慢病 毒载体系统应用于制备肿瘤靶向基因治疗药物。
[0012] 表达白喉毒素DTA慢病毒的宿主细胞为改建的HEK293T细胞系，该细胞系过量 表达突变的蛋白延伸因子2 (EF-2)，突变的氨基酸位点为717 (甘氨酸GGA定点突变 为精氨酸CGA)，该细胞系来自于专利(专利申请号：201310500310. 5)，该细胞系命名为 HEK293T[mEF-2(G717R)]〇
[0013] 本发明的有益效果在于： (1) 通过载体构建的方式，构建了由Surp-P269启动子驱动的荧光蛋白GFR/RFP和DTA 协同表达的慢病毒载体，GFR/RFP和DTA之间用口蹄疫病毒的2A片段进行藕联； (2) 利用位于整合酶D64突变为A的PMDL(D64A)、和其他两个包装质粒REV、VSVG连同 慢病毒表达载体，对DTA和GFP/RFP双顺反子协同表达的慢病毒进行了包装，获得非整合的 慢病毒载体系统； (3) 通过对蛋白质合成能力（荧光蛋白和荧光素酶的表达能力）以及肿瘤细胞的存活能 力进行比较，发现构建的协同表达荧光蛋白和白喉毒素的慢病毒载体不仅能有效监测病毒 的包装过程，同时，Surp-P269驱动的慢病毒对肿瘤细胞具有靶向性； (4) 本发明构建的慢病毒表达载体系统对肿瘤细胞具有特异杀伤能力，该系统病毒的 产生可用荧光蛋白进行实时监测，经体外实验证实，所构建的慢病毒载体系统能抑制蛋白 质的合成和细胞的生长。
[0014] (5)与专利申请号：201310500310. 5的启动子相比，Survivin的启动子更短，更利 于基因工程的操作，短的启动子使得慢病毒的负载更小，更有利于慢病毒的包装，从而提高 病毒的滴度。另外CMV启动子不是肿瘤特异的启动子，它是广谱的启动子，在正常组织和细 胞里面都能获得高效表达，因而造成肿瘤基因治疗的副作用高。而Survivin的启动子与专 利201310500310. 5中使用的启动子活性在正常组织和细胞中表达范围和水平不同，因此 可以弥补肿瘤基因治疗的不足，它们存在互补的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1 :Surp-P269启动子驱动荧光蛋白和白喉毒素A片段协同表达的慢病毒载体构 建图。
[0016] 图2 :慢病毒的包装和肿瘤清除模型的流程图。
[0017] 图3 :荧光蛋白监测慢病毒的包装和病毒包装细胞系的建立。
[0018] 图4 :过量表达DTA的慢病毒载体感染肿瘤细胞系后的生存分析。
【具体实施方式】
[0019] 表达白喉毒素A片段的慢病毒载体系统是将整合酶D64突变为A的PMDL-D64A、其 他两个包装质粒REV、VSVG和表达载体共转入HEK293T [mEF-2 (G717R)]细胞，即在宿主细胞 中包装获得非整合慢病毒载体系统；其表达载体包括PPR頂E-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3 和 pPRME-Surp-P269-RFP-2A-DTA - FF3。
[0020] 实施例1 表达绿色荧光蛋白和白喉毒素A片段的非整合慢病毒载体系统的制备方法包括以下 步骤： 步骤1)绿色荧光蛋白基因的克隆：以PPRME-CMV-GFP-FF3质粒为模板，正向引 物：5' -GC ACCGGTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3, (SEQ ID N0:1)，末端为 Agel 酶切 位点（下划线表示的碱基)，反向引物：5 ' -ATAGTTTAGCGGCCGCGGGCCCTCTAGACTTGTACAGCT CGTCCATGC-3'（SEQ ID N0:2)，末端为Notl酶切位点（下划线表示的碱基)，高保真PCR扩 增GFP基因，并克隆入T/A克隆载体；
【权利要求】
1. 一种非整合慢病毒载体系统，其特征在于：将HIV整合酶D64突变为A的PMDL-D64A 以及另外两个包装质粒REV、VSVG连同慢病毒表达载体共转入过量表达突变EF-2的293T 细胞，即在宿主细胞中包装获得非整合慢病毒载体系统；所述的慢病毒表达载体包括 pPRME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3、pPRME- Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3 ;所述的非整合 慢病毒载体系统是利用Survivin启动子驱动白喉毒素A片段和荧光蛋白协同表达，其出发 载体为 PPRME-CMV-GFP-FF3 或 pPRME-CMV-dsRed-FF3。
2. 根据权利要求1所述的非整合慢病毒载体系统，其特征在于：所述的Survivin启动 子为269bp长度的Surp-P269启动子。
3. 如权利要求1所述的非整合病毒载体系统的制备方法，其特征在于：其制备方法包 括以下步骤： 步骤1)荧光蛋白基因的克隆：以pPR頂E-CMV-GFP-FF3或pPRME-CMV-dsRed-FF3质粒 为模板，分别高保真PCR扩增GFP和RFP基因，并分别克隆入T/A克隆载体； 步骤2) DTA克隆：以pBSDTA-II的质粒为模板，高保真PCR克隆DTA片段，PCR产物以 Apal和Notl酶按双酶切连接方法克隆入步骤1)的T/A克隆载体中，获得GFP/RFP-DTA的 T/A克隆载体； 步骤3 ) 口蹄疫病毒2A序列的设计和合成：根据口蹄疫病毒的2A短肽氨基酸序列，设 计并合成寡核苷酸片段，通过退火，连接插入步骤2)中获得的T/A克隆载体的GFP/RFP和 DTA之间，获得GFP/RFP-2A-DTAT/A克隆载体； 步骤4)启动子克隆：以提取的293T细胞基因组DNA为模板，高保真PCR克隆基因启 动子Surp-P269, PCR产物以Apal和Nhel酶按双酶切连接方法克隆入用同种内切酶酶切形 成的线性pPR頂E-CMV-GFP-FF3慢病毒载体，连接形成pPRME-Surp-P269-GFP-FF3表达载 体； 步骤5)慢病毒表达载体的建立：利用双酶切连接方法将GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆载 体中的GFP/RFP-2A-DTA片段分别转移入pPRME-Surp-P269-GFP-FF3慢病毒表达载体，获 得慢病毒表达载体 pPR頂E-Surp-P269-GFP- 2A-DTA-FF3, pPRME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3 ； 步骤6)慢病毒的包装：在转染前对宿主细胞进行无血清饥饿2小时，将位于整合酶D64 突变为A的PMDL-D64A、REV、VSVG和步骤5 )中的慢病毒表达载体混匀后，再与PEI转染试 剂混匀,共同加入宿主细胞中,6小时后将培养基替换为含体积分数为2%血清的培养基，连 续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得非整合慢病毒载体系统。
4. 如权利要求1所述的非整合慢病毒载体系统的应用，其特征在于：所述的非整合慢 病毒载体系统应用于制备肿瘤靶向基因治疗药物。
【文档编号】A61K48/00GK104099370SQ201410337976
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】刘宽灿, 兰小鹏, 林宝顺, 赵猛, 陈敏, 高安定, 张蕊 申请人:中国人民解放军南京军区福州总医院