一种九味痔疮片的制备方法及其在抑制前列腺癌细胞rm-1细胞增殖药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种九味痔疮片的制备方法及应用。本发明的九味痔疮片的制备方法，由三月泡400g、虎杖150g、地榆200g、柳寄生100g、无花果叶100g、菊花50g、鸡子白20g、黄连150g、大黄50g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得大黄素含量有很大提高。本发明还提供了九味痔疮片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用。
【专利说明】一种九味痔疮片的制备方法及其在抑制前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种九味痔疮片的制备方法及其在抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用。
【背景技术】
[0002]九味痔疮胶囊标准号WS-10189 (ZD-0189) -2002，记载于国家中成药标准汇编外科妇科分册。由三月泡400g、虎杖150g、地榆200g、柳寄生100g、无花果叶100g、菊花50g、鸡子白20g、黄连150g、大黄50g作为原料药制成，具有清热解毒，燥湿消肿，凉血止血的功效。。用于湿热蕴结所致内痔出血，外痔肿痛。
[0003]现有技术中，尚未有九味痔疮胶囊在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而直接打粉，水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004]为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种九味痔疮片的制备方法。
[0005]本发明的另一个目的在于提供一种九味痔疮片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用。
[0006]本发明的目的是通过如下的方案实现的:
一种九味痔疮片的制备方法，由三月泡400g、虎杖150g、地榆200g、柳寄生100g、无花果叶100g、菊花50g、鸡子白20g、黄连150g、大黄50g作为原料药制成,所述的制备方法由下列步骤组成:取三月泡、虎杖、柳寄生，加入到0)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生药.π?η，萃取时间180-220min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，力口入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。
[0007]上述的九味痔疮片的制备方法中，所述CO2超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
[0008]上述的九味痔疮片的制备方法中，所述CO2超临界萃取中萃取压力为25 MPa。
[0009]上述的九味痔疮片的制备方法中，所述CO2超临界萃取中萃取温度为40°C。
[0010]上述的九味痔疮片的制备方法中，所述CO2超临界萃取中CO2流量2ml/g生药.mir1
[0011]上述的九味痔疮片的制备方法中，所述CO2超临界萃取中萃取时间为200min。
[0012]上述的九味痔疮片的制备方法中，所述微波萃取功率为700W。
[0013]上述的九味痔疮片的制备方法中，所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。
[0014]上述的九味痔疮片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用。
[0015]现有技术中，九味痔疮胶囊每次5-6粒，一日3次。九味痔疮胶囊服药量大，采用本发明方法制备成的九味痔疮片每片重0.3g，每次仅需3片，一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。且制备成片剂，患者随水吞下即可，服药量小且无苦味，患者易于接受。
[0016]试验一、不同方法制备的九味痔疮片中大黄素含量的比较
1、仪器及试药本发明九味痔疮片:按实施例1方法制备，使用1220g原料药，经提取制成500片，每片重0.3g。原九味痔疮胶囊，按照WS-10189 (ZD-0189) -2002标准方法制备。Agilentl200高效液相色谱仪；METTLER AE240电子分析天平；大黄素对照品(中国药品生物制品检定所)。
[0017]2、方法
照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。
[0018]色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1 %磷酸溶液(80:20)为流动相；检测波长为288nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于5000。
[0019]对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.05mg的溶液，即得。
[0020]供试品溶液的制备取本发明的九味痔疮片，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20ml，超声处理I小时，放冷，滤过，残渣用甲醇洗涤2次，每次10ml，合并滤液与洗液，蒸干，残渣加稀盐酸1ml使溶解，再加氯仿20ml，置水浴中(70°C)水解30分钟，冷却，移置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中；分取氯仿层，酸液用氯仿洗涤2次，每次10ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠适量脱水，挥去氯仿，残渣用甲醇适量使溶解并转移至1ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45--m)滤过，取续滤液，SP得。
[0021]对照产品供试品溶液的制备取本对照的九味痔疮胶囊，研细，混匀，取lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20ml，超声处理I小时，放冷，滤过，残渣用甲醇洗涤2次，每次10ml，合并滤液与洗液，蒸干，残渣加稀盐酸1ml使溶解，再加氯仿20ml，置水浴中(70°C)水解30分钟，冷却，移置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中；分取氯仿层，酸液用氯仿洗涤2次，每次10ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠适量脱水，挥去氯仿，残渣用甲醇适量使溶解并转移至1ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45--m)滤过，取续滤液，即得。
[0022]测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5--1，注入液相色谱仪，测定，即得。3、结果
结果表明，本发明九味痔疮片中大黄素的含量为0.65-1.22mg/片；而原九味痔疮胶囊中大黄素的含量为0.15mg/粒，每次服用量3片的大黄素含量为原胶囊剂含量的2-4倍，在服用量减少的情况下，大黄素含量有很大提高。
[0023]上述研究表明，采用本发明制备方法制备的九味痔疮片，有效成分含量远远高于WS-10189 (ZD-0189)-2002标准记载的方法制备的九味痔疮胶囊。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0025]实施例1
取三月泡400g、虎杖150g、地榆200g、柳寄生100g、无花果叶100g、菊花50g、鸡子白20g、黄连150g、大黄50g，将三月泡、虎杖、柳寄生加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药.min，萃取时间200min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒,干燥,压片，制成500片，每片重0.3g。
[0026]经检测，成品中大黄素的含量为1.22mg/片。
[0027]实施例2
取三月泡400g、虎杖150g、地榆200g、柳寄生100g、无花果叶100g、菊花50g、鸡子白20g、黄连150g、大黄50g，将三月泡、虎杖、柳寄生加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力30MPa，温度50°C，CO2流量3ml/g生药.min，萃取时间180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒,干燥,压片，制成500片，每片重0.3g。
[0028]经检测，成品中大黄素的含量为0.87mg/片。
[0029]实施例3
取三月泡400g、虎杖150g、地榆200g、柳寄生100g、无花果叶100g、菊花50g、鸡子白20g、黄连150g、大黄50g，将三月泡、虎杖、柳寄生加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力15MPa，温度30°C，CO2流量Iml/g生药.π?η，萃取时间220min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片，制成500片，每片重0.3g。
[0030]经检测，成品中大黄素的含量为0.65mg/片。
[0031]实施例4:九味痔疮片抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖的实验研究资料 1.实验材料
1.1实验用细胞株
小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0032]1.2实验药物研究药物:本发明九味痔疮片:按实施例1方法制备。
[0033]药液储液:称取10mg九味痔疮片，溶于5ml无水乙醇中，0.2--m滤器过滤，500--ldoff管分装，-20°C存储，同时0.2--m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0034]1.3实验试剂
DMEM ( GIBCO公司Cat.N0.12100-061 Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.N0.11810-033 Lot.N0.1088387) ;Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);无水乙醇(溜博亚杜兰经贸有限公司)；MTT (B1sharp 批号:0793):PBS (实验室自配);
1.4实验器材
莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX 190);CO2培养箱(FORMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号:Sff-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号:S/N 020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:KA-1000);0.2--m 滤器(MILLIP0RE 型号:SLGP033RB);lcm 培养皿(NEST 公司)、96孔培养板(NEST公司)；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0035]2.实验方法
1)RM-1细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养(1cm培养皿)，当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，100rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X 14个/ml。
[0036]2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180--1，培养板放入细胞培养箱中(37°C，5%C02)常规培养。
[0037]3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入九味痔疮片溶液，继续培养24h。
[0038]4) 24h 后加入 20--1 MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT),继续培养 4h。
[0039]5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200--1 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0040]6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0041]7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(%)=(对照孔OD值-给药孔OD值)、对照孔OD值X 100%。实验重复3次。
[0042]3.统计处理
采用Microsoft Excel 2007软件中的相关分析和Student t检验,数据以mean土S.D.表不O
[0043]4.实验结果
MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对RM-1细胞增殖抑制有差异(P〈0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P〈0.01)，当剂量达到15_20mg/ml时有极显著性差异(P〈0.001)。
[0044]表1九味痔疮片对RM-1细胞增殖抑制影响研究(X土 SD)
【权利要求】
1.一种九味痔疮片的制备方法，由三月泡400g、虎杖150g、地榆200g、柳寄生100g、无花果叶100g、菊花50g、鸡子白20g、黄连150g、大黄50g作为原料药制成，其特征在于，所述的制备方法由下列步骤组成:取三月泡、虎杖、柳寄生，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l-3ml/g生药.π?η，萃取时间180_220min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩,加到DlOl大孔吸附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。
2.根据权利要求1所述的九味痔疮片的制备方法，其特征在于，所述CO2超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
3.根据权利要求1所述的九味痔疮片的制备方法，其特征在于，所述CO2超临界萃取中萃取压力为25 MPa。
4.根据权利要求1所述的九味痔疮片的制备方法，其特征在于，所述CO2超临界萃取中萃取温度为40 °C。
5.根据权利要求1所述的九味痔疮片的制备方法，其特征在于，所述CO2超临界萃取中CO2 流量 2ml/g 生药.min。
6.根据权利要求1所述的九味痔疮片的制备方法，其特征在于，所述CO2超临界萃取中萃取时间为200min。
7.根据权利要求1所述的九味痔疮片的制备方法，其特征在于，所述微波萃取功率为700W。
8.根据权利要求1所述的九味痔疮片的制备方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。
9.权利要求1所述的九味痔疮片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用。
【文档编号】A61K35/54GK104161852SQ201410371512
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】彭立增, 孙建林, 朱富强 申请人:济南爱思医药科技有限公司