一种人工熊胆粉及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种人工熊胆粉及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：a)将禽畜胆粉用pH＝7～9的缓冲液溶解后进行过滤，得到滤渣和滤液；b)将所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器中进行反应；c)将反应完毕后的反应液冷冻干燥后与所述滤渣混合，得到人工熊胆粉。本发明完全使用天然来源的禽畜胆汁作为人工熊胆制备的原料，不需要再添加其他化学物质，且采用常见动物胆汁，其胆源易采、易得、易加工；通过体外模拟肝肠循环过程，把禽畜胆汁生物转化为与天然熊胆粉化学等值的人工熊胆粉，作为天然熊胆替代品，保护濒危动物亚洲黑熊，促进熊胆产业健康发展。
【专利说明】一种人工熊胆粉及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物领域，特别涉及一种人工熊胆粉及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 熊胆，由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到，具有清热、平肝、明目的功效，其 主要成分是牛磺熊去氧胆酸（TUDCA)。熊胆是四大名贵动物药之一，有2000余年的入药历 史，有大量的处方都含有熊胆成分。我国每年熊胆粉产量约30吨，仍然满足不了人类健康 的需求。目前高端熊胆粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊胆粉市场需求的持续增加， 使得熊胆粉的价格节节攀升，市场价格已经超过了 5000元/kg。更为严峻的是，国内外动物 保护组织对活熊取胆的长期抵制，特别是最近的"归真堂"事件再次引起了国际国内社会的 广泛关注，给国内熊胆粉的生产和相关产业的发展带来了前所未有的阻力。
[0003] 因此，加快人工熊胆的研发，促进熊胆产业可持续发展已经提上了议事日程。但与 同属珍稀动物用药的麝香和牛黄不同，迄今为止，我国的"人工熊胆"尚未获得国家药监局 的新药批准。
[0004] 根据目前检索的专利文献，涉及人工熊胆的制备方法主要包括以下几方面：
[0005] (1)中国专利CN201010039550.6(人工熊胆粉的合成新技术）中，公开了以来源广 泛，价格低廉的禽胆为基础原料，经物理方法分离去除蛋白质、多糖、脂类杂质成分，保留与 天然熊胆粉相似的活性成分，再添加一定量熊胆特有的牛磺熊去氧胆酸、氨基酸、微量元素 等。
[0006] ⑵中国专利CN03133771.6(人工熊胆）中，公开了以牛黄熊去氧胆酸钠、鸡胆膏、 胆红素为原料制备的人工熊胆。
[0007](3)中国专利CN01112258. 7 (人造熊胆粉的制备方法），用禽胆汁在强氧化剂和还 原剂的作用下，将胆汁中的牛磺鹅去氧胆酸转化成牛磺熊去氧胆酸，然后添加胆汁色素、胆 汁酸成分，加工配制成人造熊胆粉。
[0008](4)中国专利CN02134299. 7(人工熊胆及其制造方法），将牛磺熊去氧胆酸钠、混 合胆素、多种氨基酸、矿质元素、米糠油、胆固醇、卵磷脂等混合通过一定工艺，制成人工熊 胆。
[0009] (5)中国专利CN200910172589. 2 (人工熊胆），利用兔胆、鸡胆、鸭胆、鹅胆混合而 成制成人工熊胆。但牛磺熊去氧胆酸含量达不到药典标准。
[0010] (6)中国专利CN201210162695. 4(人工熊胆），将禽胆汁中的一种或几种的混合 物、和牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁、狗胆汁中的一种或几种的混合物与化学合成的牛磺熊去氧 胆酸混合而制成人工熊胆。
[0011] (7)中国专利CN201310027917.6( -种人工熊胆粉及其制备方法），以禽胆为原 料，加入牛黄熊去氧胆酸钠制备而成。
[0012] 目前技术制备出的人工熊胆仍然存在问题，有的技术仅仅将不同禽畜胆汁混合在 一起而制成的产品的牛磺熊去氧胆酸的含量根本无法达到药典的标准。很多技术是在禽畜 胆汁混合物的基础上添加了一些化学物质比如牛磺熊去氧胆酸、胆色素、氨基酸等以使制 成品的化学成分与天然熊胆粉的成分相似，但无法真正成为熊胆替代品。
[0013] 所以为了克服现有人工熊胆制备技术缺陷，有必要提出一种新的人工熊胆制备方 法，在不添加其他化学成分的前提下，将禽畜胆汁体外模拟生物催化转化，并通过一定工艺 制成人工熊胆，使其成分与天然熊胆化学等值。
【发明内容】
[0014] 本发明所要解决的技术问题是提供一种人工熊胆粉及其制备方法，将禽畜胆粉通 过体外模拟生物催化转化制取人工熊胆粉，使其成分与天然熊胆化学等值。
[0015] 本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种人工熊胆粉的制备方 法，包括如下步骤：a)将禽畜胆粉用pH = 7?9的缓冲液溶解后进行过滤，得到滤渣和滤 液；b)将所述滤液加入装有7 a -羟基类固醇脱氢酶、7 3 -羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅 酶II的反应器中进行反应；c)将反应完毕后的反应液冷冻干燥后与所述滤渣混合，得到人 工熊胆粉。
[0016] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤a)中的缓冲液为磷酸盐缓冲液、 Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
[0017] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤a)包括如下过程：所述禽畜胆粉 用pH = 7?9的缓冲液溶解后，在llOOOg条件下离心lOmin后，一次或多次过滤，得到滤 渣和滤液，所述滤渣冷冻干燥保存。
[0018] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤b)包括如下过程：所述滤液加入 装有7 a -羟基类固醇脱氢酶、7 0 -羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器里室温 反应2?8h。
[0019] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤c)包括如下过程：将反应完毕后 的反应液冷冻干燥48h后与所述滤渣混合均匀，得到人工熊胆粉。
[0020] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述禽畜胆粉为鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛 胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物。
[0021] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述禽畜胆粉的主要成分和质量百分比如 下：
[0022] 总胆酸：40?65%
[0023] 氨基酸：4?9%
[0024] 微量元素：0? 5?1% ;
[0025] 其中，所述总胆酸中含有T⑶CA，所述T⑶CA占禽畜胆粉的质量百分比为40? 50%。
[0026] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述7a_羟基类固醇脱氢酶、7 0 _羟基类 固醇脱氢酶在反应器中以固定化的方式存在。
[0027] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤b)包括如下酶固定化步骤：在1% 的壳聚糖溶液中加入适量醋酸，制得壳聚糖醋酸溶液，将所述壳聚糖醋酸溶液注入到三聚 磷酸钠溶液中固化，得到壳聚糖球；将所述壳聚糖球放入盛有〇. 125%戊二醛水溶液的容 器中活化，得到活化壳聚糖微球；称取预定量的所述活化壳聚糖微球，装入层析柱，加入适 量的7 a -羟基类固醇脱氢酶和7 0 -羟基类固醇脱氢酶液，采用垂直混合方式使之结合在 微球上，得到固定化酶。
[0028] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，在所述固定化酶反应器中加入所述步骤a) 中的滤液作为反应底物溶液，加入预定量辅酶I或辅酶II，使辅酶I或辅酶II :TCDCA = 1:2?1:4(摩尔比），在20?30°C下，反应2?6h。
[0029] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述的7 a _羟基类固醇脱氢酶和7 0 _羟基 类固醇脱氢酶来源于撒丁岛梭菌、脆弱拟杆菌或产气柯林斯菌。
[0030] 本发明为解决上述技术问题而采用的另一技术方案是提供一种人工熊胆粉，由上 述制备方法制取。
[0031] 上述的人工熊胆粉，其中，所述人工熊胆粉的主要成分和质量百分含量如下：
[0032] 总胆酸：40?65%
[0033] 氨基酸：4?9%
[0034] 微量兀素：0? 5?1%;
[0035] 其中，所述总胆酸含有TUDCA和T⑶CA，所述TUDCA占人工熊胆粉的质量百分比为 23?33% ;所述T⑶CA占人工熊胆粉的质量百分比为12?30%。
[0036] 上述的人工熊胆粉，其中，所述TUDCA和T⑶CA的质量比为1?1. 5。
[0037] 本发明对比现有技术有如下的有益效果：本发明提供的人工熊胆粉及其制备方 法，是在研究动物胆汁肝肠循环过程的基础上，提出的一种仿生模拟胆汁酸肝肠循环过程， 以禽畜胆粉为基质，集成了多次过滤技术，酶固定化技术，酶转化技术来培育人工熊胆粉， 本发明方法制取的人工熊胆粉的化学成分的种类和含量都与天然熊胆粉相似，具有化学等 值的特点，而且其物理性状、鉴别特征、颜色气味、理化性质、主要成分含量及比例等方面均 符合《中国药典》（2015年）中的熊胆粉质量标准。因此，本发明技术具有以下优点：
[0038] (1)完全使用天然可食用的禽畜胆汁作为人工熊胆制备的原料，不需要再添加其 他化学物质如牛磺熊去氧胆酸、胆色素、氨基酸、微量元素等。
[0039] (2)本发明采用了几种常见动物胆汁，其胆源易采、易得、易加工。
[0040] (3)本发明采用的多次过滤技术可以将禽畜胆汁中不溶或难溶成分预先分离，降 低了对酶的毒害作用，提高了酶的使用寿命。
[0041] (4)本发明所采用的酶固定化技术和酶转化技术，不但使酶可以重复多次利用，而 且与微生物转化技术相比，酶固定转化还便于与反应系统分离，易于控制。
[0042] (5)通过体外模拟肝肠循环过程，把禽畜胆汁生物转化为与天然熊胆粉化学等值 的人工熊胆粉，作为天然熊胆替代品，不仅具有保护濒危动物亚洲黑熊的社会意义，还具有 促进熊胆产业健康发展经济价值。
【具体实施方式】
[0043] 下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0044] 1、鸡、鸭、鹅胆粉的制备
[0045] 鸡胆、鸭胆、鹅胆从屠宰场购买得到。首先确定胆的数量和重量。用75%酒精分别 对鸡胆、鸭胆、鹅胆局部进行消毒，然后分别剖取胆汁。将取出的胆汁冷冻干燥48h，分别得 到鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉，放置干燥器中保存备用。
[0046] 2、人工熊胆粉的制备
[0047] (1)禽畜胆粉的处理
[0048] 使用pH 7. 0?9. 0的缓冲液溶解禽畜胆粉（鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉）配制1L 溶液，超声充分溶解，所述缓冲液优选磷酸盐缓冲液（PBS)、Tris-HCl缓冲液（三羟甲基氨 基甲烷）或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（Gly-NaOH);将禽畜胆粉溶液在llOOOg条件下离心 lOmin后，多次过滤，上清液（滤液）作为禽畜胆粉处理液在4°C保存，备用；滤渣冷冻干燥， 保存备用。
[0049] 所述禽畜胆粉不局限于鸡胆粉、鸭胆粉和鹅胆粉，可以为鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、 牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉等禽畜胆粉中的一种或多种混合物。较佳地，禽畜胆粉的主 要成分和质量百分比如下：
[0050] 总胆酸：40?65%
[0051] 氨基酸：4?9%
[0052] 微量兀素：0? 5?1% ;
[0053] 其中，所述总胆酸中含有T⑶CA，所述T⑶CA占禽畜胆粉的质量百分比为40? 50%。
[0054] 除上述主要成分外，禽畜胆粉还含有其他成分，包括：水分、胆色素、维生素、胆固 醇、脂肪酸等。
[0055] (2)固定化酶的制备
[0056] 在1%的壳聚糖（水溶性）溶液中加入适量醋酸，磁力搅拌30min制得壳聚糖 醋酸溶液。将上述溶液用高压注射泵注入到l〇〇mL3% (w/v)的三聚磷酸钠溶液中固化 1?2h，得到粒度均匀、形状规则的白色的壳聚糖球，然后过滤，用去离子水洗涤多次。将 制备好的壳聚糖球放入盛有〇. 125%戊二醛水溶液的烧杯中，并置于37°C，170g下的摇床 中，活化2?4h，即得活化壳聚糖微球。称取10g活化好的壳聚糖微球，装入小型层析柱， 加入适量的7 a-羟基类固醇脱氢酶和7 0-羟基类固醇脱氢酶液，所述7 a-羟基类固醇 脱氢酶（7 a-HSDH)和7 0-羟基类固醇脱氢酶（7 0-HSDH)来自于微生物，如撒丁岛梭菌 (Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555)、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis ATCC25825)或产气柯林斯菌（Collinsella aerofaciens ATCC25986)。采用垂直混合方式 结合4?6h，固定完毕，放出酶液，并用PBS缓冲液冲洗固定后酶柱3?5次。结果检测表 明7 a-羟基类固醇脱氢酶和7 0-羟基类固醇脱氢酶的固定率大于90%。
[0057] 禽畜胆汁是混合物，成分复杂。如果用含有7 a _羟基类固醇脱氢酶、7 0 _羟基类 固醇脱氢酶的微生物来转化禽畜胆汁，存在微生物代谢产物复杂不易分离的问题；如果单 纯用7 a-羟基类固醇脱氢酶、7 0-羟基类固醇脱氢酶来转化禽畜胆汁，禽畜胆汁中的复杂 成分很容易使酶中毒失活。本实施例采用的酶固定化技术和酶转化技术，不但使酶可以重 复多次利用，而且与微生物转化技术相比，酶固定转化还便于与反应系统分离，易于控制。
[0058] (3)生物催化转化
[0059] 在固定化酶柱中加入第（1)步制备好的禽畜胆粉溶液处理后的滤液作为反应底 物溶液，加入辅酶I或辅酶II，使辅酶1(或辅酶II) :T⑶CA= 1:2?1:4(摩尔比），在20? 30°C下，反应2?6h。
[0060] (4)反应液的处理
[0061] 将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h，得固体反应产物。最后将在第（1)步得到的 滤渣与反应产物混合均匀，即得人工熊胆粉。
[0062] 3、样品中主要胆汁酸的含量测定
[0063] 取适量禽畜胆粉（鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、熊胆粉）和本发明方法制取的人工熊 胆粉分别置于不同的量瓶（50mL)中，加入甲醇适量，超声（功率300W，频率25kHz)10min使 之溶解，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得。取上述溶液各10 U L，注入高效 液相色谱仪，检测器采用蒸发光散射检测器，每个样品重复测定3次。根据标准曲线，测得 TUDCA和TCDCA的量，除以初始禽畜胆粉或人工熊胆粉的质量即为禽畜胆粉或人工熊胆粉 中TUDCA和T⑶CA所占百分比。对照品T⑶CA和TUDCA来自于中国药品生物制品检定所。 检测结果如表1所示。
[0064] 表1禽畜胆粉、天然熊胆粉和本发明制取的人工熊胆粉主要胆汁酸含量（％ )
【权利要求】
1. 一种人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 将禽畜胆粉用pH = 7?9的缓冲液溶解后进行过滤，得到滤渣和滤液； b) 将所述滤液加入装有7 a -羟基类固醇脱氢酶、7 3 -羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或 辅酶II的反应器中进行反应； c) 将反应完毕后的反应液冷冻干燥后与所述滤渣混合，得到人工熊胆粉。
2. 如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中的缓冲液 为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
3. 如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤a)包括如下过 程：所述禽畜胆粉用pH = 7?9的缓冲液溶解后，llOOOg条件下离心lOmin后，多次过滤， 得到滤渣和滤液，所述滤渣冷冻干燥保存。
4. 如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤b)包括如下过 程：所述滤液加入装有7 a -羟基类固醇脱氢酶、7 3 -羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II 的反应器里室温反应2?6h。
5. 如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤c)包括如下过 程：将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h后与所述滤渣混合均匀，得到人工熊胆粉。
6. 如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述禽畜胆粉为鸡胆粉、 鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物。
7. 如权利要求1或6所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述禽畜胆粉的主要 成分和质量百分比如下： 总胆酸：40?65% 氨基酸：4?9% 微量兀素：〇? 5?1% 其中，所述总胆酸中含有T⑶CA，所述T⑶CA占禽畜胆粉的质量百分比为40?50%。
8. 如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述7 a -羟基类固醇脱 氢酶、7 0 -羟基类固醇脱氢酶为和辅酶I或辅酶II在反应器中以固定化的方式存在。
9. 如权利要求8所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤b)包括如下酶 固定化步骤：在1 %的壳聚糖溶液中加入适量醋酸，制得壳聚糖醋酸溶液，将所述壳聚糖醋 酸溶液注入到三聚磷酸钠溶液中固化，得到壳聚糖球；将所述壳聚糖球放入盛有0. 125% 戊二醛水溶液的容器中活化，得到活化壳聚糖微球；称取预定量的所述活化壳聚糖微球，装 入层析柱，加入适量的7 a -羟基类固醇脱氢酶和7 3 -羟基类固醇脱氢酶液，采用垂直混合 方式使之与微球结合，得到固定化酶。
10. 如权利要求9所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，在所述含有固定化酶的 反应器中加入所述步骤a)中的滤液作为反应底物溶液，加入预定量辅酶I或辅酶II，使辅 酶I或辅酶II:TCDCA = 1:2?1:4(摩尔比），在20?30°C下，反应2?6h。
11. 如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述7 a-羟基类固醇脱 氢酶和7 3 -羟基类固醇脱氢酶来源于撒丁岛梭菌、脆弱拟杆菌或产气柯林斯菌。
12. -种人工熊胆粉，其特征在于，由权利要求1-11任一项权利要求所述的制备方法 制取。
13. 如权利要求12所述的人工熊胆粉，其特征在于，所述人工熊胆粉的主要成分和质 量百分含量如下： 总胆酸：40?65% 氨基酸：4?9% 微量兀素：〇? 5?1% ; 其中，所述总胆酸含有TUDCA和T⑶CA，所述TUDCA占人工熊胆粉的质量百分比为23? 33% ;所述ra)CA占人工熊胆粉的质量百分比为12?30%。
14.如权利要求13所述的人工熊胆粉，其特征在于，所述TUDCA和TCDCA的质量比为 1 ?1. 5。
【文档编号】A61P27/02GK104382941SQ201410588581
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】王伯初, 谭君, 祝连彩, 季庆治, 娄德帅, 徐英, 张小利 申请人:上海凯宝药业股份有限公司