一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂及其制备方法，该冻干粉剂由Apelin-13、人血清白蛋白、甘露醇、右旋糖酐和精氨酸组成，经过原料混合、活性炭吸附、过滤、微过滤和冻干等步骤制备得到；本发明所述的冻干粉剂及采用本发明制备方法所得的冻干粉剂能明显减少脑梗死体积，对于治疗局灶性脑缺血再灌注损伤具有良好的治疗效果；本发明所述的冻干粉剂及采用本发明制备方法所得的冻干粉剂能降低海马组织内MPO活性，上调APJ蛋白的表达水平，下降Iba1，GFAP及HMGB1蛋白表达水平；抑制中性粒细胞在脑缺血区的激活、黏附、聚集，减少细胞毒性物质的释放，减轻缺血区的炎症反应，发挥神经保护作用。
【专利说明】一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂及其制 备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻 干粉剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 缺血性脑卒中是目前人类致残和死亡的重要原因之一，大多数急性脑梗死是血栓 或栓子堵塞脑动脉引起的，因此在缺血性脑组织出现坏死之前，尽早再通闭塞的脑血管，及 时回复脑血流，才有望避免缺血性脑组织出现坏死。到目前为止，超早期静脉给予重组组织 型纤溶酶原激活剂的溶栓治疗是唯一获得循证医学支持并被美国食品药品管理局批准的 治疗急性缺血性脑卒中的药物治疗方法，但其治疗时间短是限制溶栓治疗的最大瓶颈，且 溶栓后再灌注引起的继发性神经损伤也限制着溶栓治疗的推广应用。因此，临床上急需具 有治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的药物，以预防和治疗缺血再灌注引起的脑损伤。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明的目的是提供一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的 冻干粉剂及其制备方法。
[0004] 本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
[0005] -种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，以重量份计，由以下成分组 成：Apelin-13 1?5份，人血清白蛋白5?20份，甘露醇5?10份，右旋糖酐1?5份和 精氨酸5?15份。
[0006] 为进一步实现本发明的目的，还可以采用以下技术方案：
[0007] 优选的一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，以重量份计，由以下 成分组成：Apelin-13 3份，人血清白蛋白20份，甘露醇8份，右旋糖酐3份和精氨酸10份。
[0008] 本发明还包括一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂的制备方法，包 括以下步骤：
[0009] (1)将重量份数为1?5份Apelin-13, 5?20份人血清白蛋白，5?10份甘露 醇，1?5份右旋糖酐和精氨酸5?15份加入300?500份的注射用水中溶解，得到混合药 液；
[0010] (2)在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0· 02?0· 05%的注射用活 性炭，搅拌吸附，过滤，得到滤液；
[0011] (3)在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2)的滤液在0?5°C下进行贮存，得到微 滤完的溶液；
[0012] (4)将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度 将冷凝器温度降至_30°C，保温1?2小时，以每小时KTC的速度将冷凝器温度降至-40°C， 保温1?2小时后抽真空，当真空度达到15?20Pa时，开始用1?2小时升高温度 至-15?-20°C，保温1?2小时，用1小时将温度升至0°C，保温1?2小时，用1小时将 温度升高至KTC，保温3?4小时，冻干结束，密封出品。
[0013] 优选的一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂的制备方法，包括以下 步骤：
[0014] (1)将重量份数为3份Apelin-13,20份人血清白蛋白，8份甘露醇，3份右旋糖酐 和精氨酸10份加入400份的注射用水中溶解，得到混合药液；
[0015] (2)在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0· 04%的注射用活性炭，搅 拌吸附，过滤，得到滤液；
[0016] (3)在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2)的滤液在0?5°C下进行贮存，得到微 滤完的溶液；
[0017] (4)将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度 将冷凝器温度降至_30°C，保温1. 5小时，以每小时KTC的速度将冷凝器温度降至-40°C，保 温1. 5小时后抽真空，当真空度达到18Pa时，开始用2小时升高温度至-18°C，保温1. 5小 时，用1小时将温度升至〇°C，保温1. 5小时，用1小时将温度升高至KTC，保温3. 5小时， 冻干结束，密封出品。
[0018] 本发明还包括一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，冻干粉剂用于 降低促炎症因子mRNA的表达；所述促炎症因子为白介素1β、肿瘤坏死因子α和细胞间粘 附分子1 ;促炎症因子mRNA的表达以β-actin为内参基因，采用实时荧光定量聚合酶链反 应RT-PCR进行；
[0019] 所述的促炎症因子β-actin、白介素1β、肿瘤坏死因子α和细胞间粘附分子1 的基因序列引物为：
[0020]β-actin基因上游引物序列为：5' -ctcagttgctgaggagtccc-3'，下游引物序列 为：5, -attcgagagaagggagggct-3，，扩增长度 120bp;
[0021]白介素1β基因上游引物序列为：5' -aggacccaagcaccttcttt-3'，下游引物序列 为：5，-agacagcacgaggcattttt-3，，扩增长度 152bp;
[0022]肿瘤坏死因子α基因上游引物序列为：5'-tgcctcagcctcttctcatt-3'，下游引物 序列为：5' -cccatttgggaacttctcct-3'，扩增长度 108bp;
[0023]细胞间粘附分子1基因上游引物序列为：5' -tggggttggagactaactgg-3'，下游引 物序列为：5' -gtgccacagttctcaaagca-3'，扩增长度 118bp。
[0024] 本发明所述的冻干粉剂及采用本发明制备方法所得的冻干粉剂能明显减少脑梗 死体积，对于治疗局灶性脑缺血再灌注损伤具有良好的治疗效果；本发明所述的冻干粉剂 及采用本发明制备方法所得的冻干粉剂能降低海马组织内MPO活性，上调APJ蛋白的表达 水平，下降Ibal，GFAP及HMGBl蛋白表达水平；抑制中性粒细胞在脑缺血区的激活、黏附、聚 集，减少细胞毒性物质的释放，减轻缺血区的炎症反应，发挥神经保护作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为各实验组大鼠缺血脑组织TTC染色结果图，其中a为假手术组TTC染色结 果图，b为模型组TTC染色结果图，c为25μg/kg冻干粉剂组TTC染色结果图，d为50μg/ kg冻干粉剂组TTC染色结果图，e为100μg/kg冻干粉剂组TTC染色结果图。
[0026] 图2为冻干粉剂减轻大鼠MCAO模型的脑梗死体积对比表；其中a为模型组，b为 25μg/kg冻干粉剂组，C为50μg/kg冻干粉剂组，d为100μg/kg冻干粉剂组。
[0027] 图3为冻干粉剂降低大鼠MCAO模型髓过氧化物酶（MPO)活性图，其中a为假手术 组，b为模型组，c为冻干粉剂处理组。每个实验组选取5只大鼠，其中*代表模型组与假手 术组比较，P〈〇. 05 ;#代表冻干粉剂处理组与模型组比较，P〈0. 05。
[0028] 图4为总RNA产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中a为假手术组，b为模型组，c为冻干 粉剂处理组。
[0029] 图5为冻干粉剂减少脑卒中后炎症因子mRNA表达水平图，应用荧光定量PCR法检 测缺血30分钟再灌注24小时后缺血侧海马炎症因子mRNA的表达水平。其中5-1为炎症 因子IL-Iβ的mRNA表达水平图，5-2为炎症因子TNF-α的mRNA表达水平图，5-3为炎症 因子ICAM-I的mRNA表达水平图。管家基因β-actin作为内参基因进行一次标化。假手 术组数值设定为I. 〇进行二次标化。每个实验组选取5只大鼠。其中*代表模型组与假手 术组比较，P〈〇. 05 ;#代表冻干粉剂处理组与模型组比较，P〈0. 05。
[0030] 图6为本发明的冻干粉剂对Apelin受体APJ的蛋白表达，小胶质细胞和星形胶质 细胞的活化及HMGBl蛋白的表达的影响图，其中其中a为假手术组，b为模型组，c为冻干粉 剂处理组；A、B、C、D代表APJ、Ibal、GFAP、HMGBl在假手术组、模型组、冻干粉剂组缺血侧海 马组织内的表达（X400)。图E为APJ免疫组化半定量统计图、F为Ibal免疫组化半定量 统计图、G为GFAP免疫组化半定量统计图、H为HMGBl免疫组化半定量统计图。每个实验组 选5只大鼠，其中*代表模型组与假手术组比较，P〈0. 05 ;#代表冻干粉剂处理组与模型组 比较，P〈〇. 05。
[0031] 图7为APJ、Ibal、GFAP、HMGBl在假手术组、模型组、冻干粉剂组缺血侧海马组织 内的表达图，其中a为假手术组，b为模型组，c为冻干粉剂处理组。
[0032]图 8 为APJ、Ibal、GFAP、HMGBl在Westernblotting的半定量统计图，其中a为 假手术组，b为模型组，c为冻干粉剂处理组，每个实验组选5只大鼠，*代表模型组与假手 术组比较，P〈〇. 05 ;#代表冻干粉剂处理组与模型组比较，P〈0. 05。
【具体实施方式】
[0033] -种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，以重量份计，由以下成分组 成：Apelin-13 1?5份，人血清白蛋白5?20份，甘露醇5?10份，右旋糖酐1?5份和 精氨酸5?15份。
[0034] 为进一步实现本发明的目的，还可以采用以下技术方案：
[0035] 优选的一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，以重量份计，由以下 成分组成：Apelin-13 3份，人血清白蛋白20份，甘露醇8份，右旋糖酐3份和精氨酸10份。
[0036] 本发明还包括一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂的制备方法，包 括以下步骤：
[0037] (1)将重量份数为1?5份Apelin-13, 5?20份人血清白蛋白，5?10份甘露 醇，1?5份右旋糖酐和精氨酸5?15份加入300?500份的注射用水中溶解，得到混合药 液；
[0038] (2)在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0· 02?0· 05%的注射用活 性炭，搅拌吸附，过滤，得到滤液；
[0039] (3)在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2)的滤液在0?5°C下进行贮存，得到微 滤完的溶液；
[0040] (4)将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度 将冷凝器温度降至_30°C，保温1?2小时，以每小时KTC的速度将冷凝器温度降至-40°C， 保温1?2小时后抽真空，当真空度达到15?20Pa时，开始用1?2小时升高温度 至-15?-20°C，保温1?2小时，用1小时将温度升至0°C，保温1?2小时，用1小时将 温度升高至KTC，保温3?4小时，冻干结束，密封出品。
[0041] 优选的一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂的制备方法，包括以下 步骤：
[0042] (1)将重量份数为3份Apelin_13,20份人血清白蛋白，8份甘露醇，3份右旋糖酐 和精氨酸10份加入400份的注射用水中溶解，得到混合药液；
[0043] (2)在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0. 04%的注射用活性炭，搅 拌吸附，过滤，得到滤液；
[0044] (3)在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2)的滤液在0?5°C下进行贮存，得到微 滤完的溶液；
[0045] (4)将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度 将冷凝器温度降至_30°C，保温1. 5小时，以每小时KTC的速度将冷凝器温度降至-40°C，保 温1. 5小时后抽真空，当真空度达到18Pa时，开始用2小时升高温度至-18°C，保温1. 5小 时，用1小时将温度升至〇°C，保温1. 5小时，用1小时将温度升高至KTC，保温3. 5小时， 冻干结束，密封出品。
[0046] 采用本发明制备方法所得的冻干粉剂能明显减少脑梗死体积，对于治疗局灶性脑 缺血再灌注损伤具有良好的治疗效果；采用本发明制备方法所得的冻干粉剂能降低海马组 织内MPO活性，上调APJ蛋白的表达水平，下降Ibal，GFAP及HMGBl蛋白表达水平；抑制中 性粒细胞在脑缺血区的激活、黏附、聚集，减少细胞毒性物质的释放，减轻缺血区的炎症反 应，发挥神经保护作用。
[0047] 本发明还包括一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，冻干粉剂用于 降低促炎症因子mRNA的表达；所述促炎症因子为白介素1β、肿瘤坏死因子α和细胞间粘 附分子1;促炎症因子mRNA的表达以β-actin为内参基因，采用实时荧光定量聚合酶链反 应RT-PCR进行；
[0048]所述的促炎症因子β-actin、白介素1β、肿瘤坏死因子α和细胞间粘附分子1 的基因序列引物为：
[0049]β-actin基因上游引物序列为：5' -ctcagttgctgaggagtccc-3'，下游引物序列 为：5, -attcgagagaagggagggct-3，，扩增长度 120bp;
[0050]白介素1β基因上游引物序列为：5' -aggacccaagcaccttcttt-3'，下游引物序列 为：5，-agacagcacgaggcattttt-3，，扩增长度 152bp;
[0051]肿瘤坏死因子α基因上游引物序列为：5'-tgcctcagcctcttctcatt-3'，下游引物 序列为：5' -cccatttgggaacttctcct-3'，扩增长度 108bp;
[0052]细胞间粘附分子1基因上游引物序列为：5' -tggggttggagactaactgg-3'，下游引 物序列为：5' -gtgccacagttctcaaagca-3'，扩增长度 118bp。
[0053] 以下实施例所用主要试剂的生产厂家：
[0054] 水合氯醛：天津市巴斯夫化工有限公司
[0055]TTC:Sigma公司
[0056] 焦炭酸二乙酯（DEPC) :Sigma公司
[0057] 多聚甲醛：天津市博迪化工有限公司
[0058] 髓过氧化物酶测试盒（ΜΡ0测试盒）：南京建成生物工程研究所
[0059]Apelin-13是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体本实施例所用均为Phoenix Pharmaceuticals公司提供。
[0060] 实施例1
[0061] 一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，由以下成分组成：Apelin-13 1份，人血清白蛋白20份，甘露醇5份，右旋糖酐5份和精氨酸15份。
[0062] 制备步骤如下：
[0063] (1)将重量份数为1份Apelin-13,20份人血清白蛋白，5份甘露醇，5份右旋糖酐 和精氨酸15份加入300份的注射用水中溶解，得到混合药液；
[0064] (2)在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0· 05%的注射用活性炭，搅 拌吸附，过滤，得到滤液；
[0065] (3)在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2)的滤液在0?5°C下进行贮存，得到微 滤完的溶液；
[0066] (4)将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度 将冷凝器温度降至_30°C，保温1小时，以每小时KTC的速度将冷凝器温度降至-40°C，保温 1小时后抽真空，当真空度达到15Pa时，开始用1小时升高温度至-15°C，保温1小时，用1 小时将温度升至〇°C，保温1小时，用1小时将温度升高至KTC，保温3小时，冻干结束，密 封出品。
[0067] 实施例2
[0068] 一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，以重量份计，由以下成分组 成：Apelin-13 5份，人血清白蛋白5份，甘露醇10份，右旋糖酐1份和精氨酸5份。
[0069] 制备步骤如下：
[0070] (1)将重量份数为5份Apelin_13,5份人血清白蛋白，10份甘露醇，1份右旋糖酐 和精氨酸5份加入500份的注射用水中溶解，得到混合药液；
[0071] (2)在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0. 02%的注射用活性炭，搅 拌吸附，过滤，得到滤液；
[0072] (3)在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2)的滤液在0?5°C下进行贮存，得到微 滤完的溶液；
[0073](4)将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度 将冷凝器温度降至_30°C，保温2小时，以每小时KTC的速度将冷凝器温度降至_40°C，保温 2小时后抽真空，当真空度达到20Pa时，开始用2小时升高温度至-20°C，保温2小时，用1 小时将温度升至〇°C，保温2小时，用1小时将温度升高至KTC，保温4小时，冻干结束，密 封出品。
[0074] 实施例3
[0075] -种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，以重量份计，由以下成分组 成：Apelin-13 2份，人血清白蛋白15份，甘露醇6份，右旋糖酐2份和精氨酸12份。
[0076] 制备步骤如下：
[0077] (1)将重量份数为2份Apelin-13,15份人血清白蛋白，6份甘露醇，2份右旋糖酐 和精氨酸12份加入400份的注射用水中溶解，得到混合药液；
[0078] (2)在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0· 03%的注射用活性炭，搅 拌吸附，过滤，得到滤液；
[0079] (3)在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2)的滤液在0?5°C下进行贮存，得到微 滤完的溶液；
[0080] (4)将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度 将冷凝器温度降至_30°C，保温1. 5小时，以每小时KTC的速度将冷凝器温度降至-40°C，保 温1. 2小时后抽真空，当真空度达到16Pa时，开始用1. 5小时升高温度至-16°C，保温1. 5 小时，用1小时将温度升至(TC，保温1. 5小时，用1小时将温度升高至KTC，保温3. 5小时， 冻干结束，密封出品。
[0081] 实施例4
[0082] 一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，以重量份计，由以下成分组 成：Apelin-13 3份，人血清白蛋白20份，甘露醇8份，右旋糖酐3份和精氨酸10份。
[0083] 制备步骤如下：
[0084] (1)将重量份数为3份Apelin_13,20份人血清白蛋白，8份甘露醇，3份右旋糖酐 和精氨酸10份加入400份的注射用水中溶解，得到混合药液；
[0085] (2)在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0· 04%的注射用活性炭，搅 拌吸附，过滤，得到滤液；
[0086] (3)在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2)的滤液在0?5°C下进行贮存，得到微 滤完的溶液；
[0087] (4)将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度 将冷凝器温度降至_30°C，保温1. 5小时，以每小时KTC的速度将冷凝器温度降至-40°C，保 温1. 5小时后抽真空，当真空度达到18Pa时，开始用2小时升高温度至-18°C，保温1. 5小 时，用1小时将温度升至〇°C，保温1. 5小时，用1小时将温度升高至KTC，保温3. 5小时， 冻干结束，密封出品。
[0088] 实施例5
[0089]冻干粉剂用于降低促炎症因子mRNA的表达；所述促炎症因子为白介素1β、肿瘤 坏死因子α和细胞间粘附分子1;促炎症因子mRNA的表达以β-actin为内参基因，采用 实时荧光定量聚合酶链反应RT-PCR进行；
[0090]所述的促炎症因子β-actin、白介素1β、肿瘤坏死因子α和细胞间粘附分子1 的基因序列引物为：
[0091]β-actin基因上游引物序列为：5' -ctcagttgctgaggagtccc-3'，下游引物序列 为：5, -attcgagagaagggagggct-3，，扩增长度 120bp;
[0092] 白介素1β基因上游引物序列为：5' -aggacccaagcaccttcttt-3'，下游引物序列 为：5，-agacagcacgaggcattttt-3，，扩增长度 152bp;
[0093]肿瘤坏死因子α基因上游引物序列为：5'-tgcctcagcctcttctcatt-3'，下游引物 序列为：5' -cccatttgggaacttctcct-3'，扩增长度 108bp;
[0094]细胞间粘附分子1基因上游引物序列为：5' -tggggttggagactaactgg-3'，下游引 物序列为：5' -gtgccacagttctcaaagca-3'，扩增长度 118bp。
[0095] 动物试验
[0096] 1.动物实验分组：取成年的Wister成年雄性大鼠36只，体重在280g?320g，随 机分成三组，每组12只，分为假手术对照组（I组）；缺血再灌注组（II组），10μL生理盐 水；缺血再灌注冻干粉剂组（III组），本实验的冻干粉剂采用实施例1的配方所得。
[0097] 2.动物局灶性脑缺血MCAO模型的制备：
[0098] 大鼠术前禁食12小时，禁水2小时。按0.31111/10(^体重，经腹腔注射10%水 合氯醛麻醉，麻醉成功后仰卧位固定在手术台上。常规备皮、消毒。沿着颈部正中稍偏右 侧切开皮肤及筋膜（切口长约3?4cm)，用止血钳和玻璃分针钝性分离出右侧颈总动脉 (CCA)、颈外动脉（ECA)、颈内动脉（ICA)，并避免损伤迷走神经及周围的小血管。结扎右侧 颈外动脉及颈总动脉近心端，微动脉夹夹闭右侧颈内动脉，颈总动脉分叉处预留结扎线， 打一活结，松紧适宜，备用。右侧颈总动脉剪一小口，将事先备好的线栓（线头直径约为 0.38±0.02mm)自颈总动脉切口处缓慢插入（深度约为18±0.5mm)，感觉到明显阻力时即 停止插入，此处即为大脑中动脉开口处。插线过程中遇到阻力时不要用力过度，以免刺破动 脉。记录下缺血时间，扎紧备线，局部止血、逐层缝合皮肤后将线栓尾端固定好。将动物侧 卧位置于单独的笼内。缺血30分钟或2小时后，缓慢地轻拉线栓，使其头端回撤至CCA内 即可。操作完成后，手术缝合伤口，结束手术，建成大鼠急性局灶性脑缺血模型。假手术组 不插入线栓，其余步骤同上。在整个手术过程中，室温保持在25±0.5°C左右，并用烤灯助其 复温，复温温度保持在37 °C左右。
[0099] 2. 1局灶性脑缺血大鼠神经功能评分测定
[0100] 采用改良的Zea-Longa5级评分法，在缺血2小时再灌注24小时后采用双盲法进 行神经功能评分。0分：无任何神经功能缺损症状出现；1分：不能完全伸展左前肢；2分： 行走时向对侧转圈，并出现追尾现象；3分：行走时出现向对侧倾倒现象；4分：丧失意识， 完全不能自发行走。神经功能评分在1分到3分之间者被认为模型制作成功，可以用于后 续实验，而评分为1分或4分者为失败模型，不符合实验要求，被剔除。实验过程中，对于手 术中出血过多、出现呼吸困难、造模不成功、处死时发现蛛网膜下腔出血及死亡的动物均应 排除，并采取随机抽样原则补齐，并重新造模。
[0101] 2. 2行为学测定
[0102] 本实验结果显示，手术后大鼠多在2小时内清醒，假手术组大鼠均正常活动，未出 现神经缺损症状。缺血2小时再灌注24小时后大鼠出现明显的神经缺损症状，表现为：大 鼠活动减少，反应迟钝，右侧Horner征阳性，不能完全伸展左前肢，行走时向左侧转圈，出 现追尾现象，甚至向左侧倾倒。但是给予本发明冻干粉剂处理后，神经功能缺损症状得到明 显改善。
[0103] 表1冻干粉剂对大鼠MCAO模型神经功能缺损症状的影响（无土s)
[0104]
【权利要求】
1. 一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，其特征在于：以重量份计，由 以下成分组成：Apelin-13 1飞份，人血清白蛋白5?20份，甘露醇5?10份，右旋糖酐1飞份 和精氨酸5~15份。
2. 根据权利要求1所述的一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，其特征 在于：以重量份计，由以下成分组成：Apelin-13 3份，人血清白蛋白20份，甘露醇8份，右 旋糖酐3份和精氨酸10份。
3. -种如权利要求1所述的治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂的制备方 法，其特征在于：包括以下步骤： 将重量份数为1飞份Apelin-13, 5?20份人血清白蛋白，5?10份甘露醇，1飞份右旋糖 酐和精氨酸5~15份加入300~500份的注射用水中溶解，得到混合药液； 在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0. 02、. 05%的注射用活性炭，搅拌吸 附，过滤，得到滤液； 在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2)的滤液在0~5°C下进行贮存，得到微滤完的溶 液； 将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度将冷凝器 温度降至_30°C，保温1~2小时，以每小时10°C的速度将冷凝器温度降至-40°C，保温广2小 时后抽真空，当真空度达到15~20Pa时，开始用1~2小时升高温度至-15~-20°C，保温1~2小 时，用1小时将温度升至〇°C，保温1~2小时，用1小时将温度升高至10°C，保温:T4小时， 冻干结束，密封出品。
4. 根据权利要求3所述的治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂的制备方法， 其特征在于：包括以下步骤： (1) 将重量份数为3份Ape 1 in-13, 20份人血清白蛋白，8份甘露醇，3份右旋糖酐和精 氨酸10份加入400份的注射用水中溶解，得到混合药液； (2) 在步骤（1)所得混合药液中加入混合药液质量的0. 04%的注射用活性炭，搅拌吸 附，过滤，得到滤液； (3 )在无菌条件下用微孔滤膜过滤步骤（2 )的滤液在(T5°C下进行贮存，得到微滤完的 溶液； (4)将微滤完的溶液分装后放置于冷冻干燥机制品室板层，以每小时15°C的速度将冷 凝器温度降至_30°C，保温1. 5小时，以每小时10°C的速度将冷凝器温度降至_40°C，保温 1. 5小时后抽真空，当真空度达到18Pa时，开始用2小时升高温度至-18°C，保温1. 5小时， 用1小时将温度升至〇°C，保温1. 5小时，用1小时将温度升高至10°C，保温3. 5小时，冻干 结束，密封出品。
5. 根据权利要求3或4所述的一种治疗局灶性脑缺血再灌注炎症反应的冻干粉剂，其 特征在于：冻干粉剂用于降低促炎症因子mRNA的表达；所述促炎症因子为白介素10、肿瘤 坏死因子a和细胞间粘附分子1;促炎症因子mRNA的表达以P-actin为内参基因，采用 实时荧光定量聚合酶链反应RT-PCR进行； 所述的促炎症因子0-actin、白介素1 0、肿瘤坏死因子a和细胞间粘附分子1的基 因序列引物为： 3 -actin基因上游引物序列为：5' _(：1^381^8(^8388381：(^(3-3'，下游引物序列为：5'- attcgagagaagggagggct-3，，扩增长度 120bp ; 白介素10基因上游引物序列为：5' -aggacccaagcaccttcttt-3'，下游引物序列为： 5，-agacagcacgaggcattttt-3，，扩增长度 152bp ; 肿瘤坏死因子a基因上游引物序列为：5'-tgcctcagcctcttctcatt_3'，下游引物序列 为：5' -cccatttgggaacttctcct-3'，扩增长度 108bp ; 细胞间粘附分子1基因上游引物序列为：5' -tggggttggagactaactgg-3'，下游引物序 列为：5' -gtgccacagttctcaaagca-3'，扩增长度 118bp。
【文档编号】A61K38/10GK104399064SQ201410606832
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】白波, 陈京, 刘文彦, 程葆华, 王春梅, 路海, 武菲, 潘衍有, 杨春青, 薛建军, 薛庆节 申请人:济宁医学院