重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及毕赤酵母（Pichiapastoris）所表达的重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用。rLZ-8能够治疗神经功能损伤，降低脑损伤引起的神经功能评分，减少ED-1阳性细胞数，从而降低炎性反应，并可抑制细胞凋亡。
【专利说明】重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药领域,涉及使用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用。
【背景技术】
[0002]灵芝是中医药学中一种珍贵的药用真菌，属担子菌纲多孔菌目灵芝科。灵芝免疫调节蛋白首次由Kino等从灵芝子实体提取物中分离纯化得到的真菌免疫调节蛋白，由110个氨基酸所组成，N端丝氨酸乙酰化，蛋白分子质量为12.4kD，并命名为LZ-8。很多研究表明，LZ-8具有促进细胞有丝分裂和免疫调节的作用等多种活性。重组灵芝免疫调节蛋白(Recombinant Immunoregulatory Protein of Ganoderma Lucidium, rLZ_8)是经由rLZ-8真核表达载体PichiaPink?菌株，筛选出稳定高效分泌表达的工程菌株中提取，并验证rLZ-8具有与LZ-8相同的免疫学活性与生物活性。
[0003]脑缺血是脑血管意外的一种，脑血管意外又称脑卒中、中风，是中老年人的常见病、多发病，严重威胁着人类的健康与生活。近些年来，随着科学技术的不断发展，研究学者对脑缺血病发病机制、脑组织细胞损伤级联反应等的深入研究，发现可通过抑制细胞凋亡、降低炎症反应与自由基等多种途径来缓解脑组织损伤。
[0004]本发明的重组灵芝免疫调节蛋白不仅可改善脑缺血损伤引起的行为功能障碍，而且可通过降低炎症反应、抑制细胞凋亡缓解脑组织损伤，对应用重组灵芝免疫调节蛋白研制治疗脑缺血损伤药物有一定的积极作用。
【发明内容】
[0005]本发明涉及重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用，通过一系列的实验手段和结果表明rLZ-8对大鼠局灶性脑缺血具有显著的治疗作用，具体
【发明内容】
如下:
本发明以大鼠作为研究对象，采用改良的Zea Longa法制备大鼠局灶性脑缺血模型，设计了包括阴性对照组(假手术组)，阳性药对照组(单唾液酸巳己糖神经节苷脂钠注射液(GM-1))，模型组，rLZ-8 高剂量组(70 μ g.kg—lrLZ-S 中剂量组(35 μ g.kg—OjLZ-S 低剂量组(17.5μ g *kg -1)在内的6个实验组。在给药程序方面设计为:腹腔注射，每天给药2次，假手术组与模型组注射等体积生理盐水，连续给药7天。首先，考察了 rLZ-8对神经功能损伤的治疗作用，按改良的NSS评分标准对其进行评分(16分制)，各给药组及模型组动物在造模后(当日，术后约5h)均出现不同程度神经功能障碍，rLZ-8高、低剂量组评分效果显著(/7〈0.01)，说明rLZ-8可降低神经功能评分，改善神经功能。有力说明了，rLZ-8对局灶性脑缺血的治疗作用；通过HE染色实验，假手术组脑组织神经元及胶质细胞数量、形态分布正常，细胞膜完整，胞浆均匀，细胞核位于中央，染色质分布较均匀；模型组脑组织稀疏，可见大量坏死神经元，细胞结构消失，胞核固缩深染，细胞坏死崩解，细胞间隙增大，坏死面积较大；rLZ-8高剂量组动物脑组织较模型组有不同程度的改善，表现为胞核固缩、溶解等病理改变较轻，坏死面积较小。采用PV-6000 二步法免疫组化检测试剂对实验大鼠进行ED-1阳性细胞表达的检测，结果表明与模型组比较，rLZ-8高剂量组ED-1阳性细胞数明显减少，可降低脑缺血损伤引起的炎性反应。采用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡，按照试剂盒说明书指导步骤进行试验，实验结果表明rLZ-8剂量组凋亡细胞数明显低于模型组，并且随着rLZ-8浓度的增加，细胞凋亡数逐渐减少。进一步说明了，rLZ-8对局灶性脑缺血的治疗作用。
[0006]经过上述重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用的一系列实验结果表明，rLZ-8能够治疗和缓解实验大鼠的神经损伤和生存状态，抑制脑组织细胞凋亡而治疗脑缺血损伤。
[0007]说明书【专利附图】
【附图说明】 图1各组大鼠体重变化
其中，S为假手术组，M为模型组，GM-1为阳性药对照组，H为rLZ-8高剂量组，Z为rLZ_8中剂量组，L为rLZ-8低剂量组
图2各组大鼠脑组织形态学观察(HE染色，40 X )
其中，A为假手术组，B为模型组，C为GM-1组，D为rLZ-8高剂量组，E为rLZ_8中剂量组，F为rLZ-8低剂量组
图3造模8天后各组ED-1阳性细胞(40 X )
其中，A为假手术组，B为模 型组，C为GM-1组，D为rLZ-8高剂量组，E为rLZ_8中剂量组，F为rLZ-8低剂量组
图4造模8天后各组凋亡细胞(4 0 X )
其中，A为假手术组，B为模型组，C为GM-1组，D为rLZ-8高剂量组，E为rLZ_8中剂量组，F为rLZ-8低剂量组具体实施方法
实施例1:rLZ-8对神经功能损伤的治疗作用 1.实验材料
大鼠，体重250-300g，雌雄各半，由吉林大学实验动物中心提供。单唾液酸巳己糖神经节苷脂钠注射液(GM-1 )，北京四环制药有限公司，手术器械。
[0008]2.实验方法
采用改良的Zea Longa法制备大鼠局灶性脑缺血模型，术后待大鼠完全清醒后，每天按改良的NSS评分标准对其进行评分(16分制)。实验设假手术组，模型组，阳性药对照组，rLZ-8 高剂量组(7(^8*1^1)、1^-8中剂量组(354 8*1^-1)、1^-8低剂量组(17.548.!^_0。腹腔注射，每天给药2次，假手术组与模型组注射等体积生理盐水，连续给药7天。阳性对照药为单唾液酸巳己糖神经节苷脂钠注射液(GM-1)。
[0009]3.实验结果
表1显示，各给药组及模型组动物在造模后(当日，术后约5h)均出现不同程度神经功能障碍，以模型组神经功能评分最高，rLZ-8高、低剂量组评分可明显改善似)，说明rLZ-8可降低神经功能评分,改善神经功能。
[0010]表1各组大鼠NSS评分结果(X 土 s，n=12)
【权利要求】
1.重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用。
2.如权利要求1所述的治疗局灶性脑缺血损伤的应用，其特征在于重组灵芝免疫调节蛋白可降低由脑缺血损伤引起的神经功能评分。
3.如权利要求1所述的治疗局灶性脑缺血损伤的应用，其特征在于重组灵芝免疫调节蛋白可减少ED-1阳性细胞数，降低炎性反应，治疗脑缺血损伤。
4.如权利要求1所述的治疗局灶性脑缺血损伤的应用，其特征在于重组灵芝免疫调节蛋白可降低凋亡细胞数，抑制脑组织细胞凋亡。
5.如权利要求1所述的制备治疗局灶性脑缺血药物，其特征在于该药物制剂核心成分是由权利要求1所述的重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)和任选的药学可接受的辅剂组成。
6.如权利要求1所述的药物制剂给药途径为口服和非肠道给药，其中，口服包括口服液，片剂，丸剂和胶囊；非肠.道给药包括外用药和注射剂。
【文档编号】A61P29/00GK103463618SQ201310402259
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】孙非, 梁重阳, 张喜田 申请人:张喜田, 孙非