一种小分子羊胎素的提取方法及在护肤品领域的运用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物【技术领域】的一种小分子羊胎素的提取方法及在护肤品领域的运用。其提取方法为采用同期发情获得大量的同期怀孕羊，并在怀孕85-100天时手术法取出胎羊，取躯体匀浆，反复冻融裂解细胞，高温变性、消毒、并沉淀杂蛋白，高速离心后采用30KD超滤去掉大分子杂蛋白及细菌、内源性病毒等有毒有害成分及杂质，获得纯净的小分子羊胎素产品并以1KD的超滤组件对小分子羊胎素产品进行超滤浓缩。本发明的小分子羊胎素可广泛的用于护肤品、美容产品、创伤愈合产品、保健品、科学研究等领域。本发明的方法为羊胎素的生产提供了一个重要的新途径，并首次鉴定了小分子羊胎素的组成成分，并为科学使用羊胎素提供了理论依据。
【专利说明】一种小分子羊胎素的提取方法及在护肤品领域的运用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种小分子羊胎素的提取方法及在护肤品领域的运用。
【背景技术】
[0002]羊胎素，包含了羊胎盘素(the Extract of Sheep's Placental)和羊胚胎素(theExtract of Goat's Embryo)两个不同的产品。
[0003]羊胎盘素是羊胎盘内的一种具有生物活性的物质，经提取出来后广泛用于各种化妆品、药品及健康食品中。
[0004]羊胚胎素则是存在于胎羊体内，经提取后也是广泛用于各种化妆品、药品及健康食品中。
[0005]从羊胚胎中提取活性物质要比从胎盘中提取活性物质困难得多，也珍贵得多，活性物质的成分也大不相同。羊胚胎素能够激活人体老化细胞、促进细胞再生与分裂。
[0006]1912年瑞士科学家卡尔教授首次发现羊胚胎细胞中有一种能使细胞恢复活力的物质，这种活性物质可以促使细胞分裂次数的增加，能迫使已衰退或老化的细胞重新活化或被淘汰，从而使机能衰退的器官恢复旺盛活力。卡尔教授因此而获得诺贝尔奖。该物质即为上所述的羊胚胎素。
[0007]1931年，瑞士保罗尼翰医生首次将从小羊胚胎中提取的一种活性物质注射到一名甲状旁腺受损的临危病人体内，并成功挽救了其生命，这就是羊胚胎素细胞活化疗法的最初起源，它的发现对人类在抗衰老领域的医学发展有着里程碑式的意义。亦即羊胚胎素的初次运用。
[0008]目前市场上羊胎素产品主要来源于上述羊胎盘、羊胚胎两个方面，并以羊胎盘粉、羊胚胎粉、羊胎盘提取物冻干粉、羊胚胎提取物冻干粉等不同的形式用于保健品、护肤品、药品等领域。各种产品的生产方法五花八门，生产方法专利也很多，但这些方法大多不切合实际，不够科学严谨，难以正式生产形成生产力。
[0009] 申请人:长期对羊胎素的提取方法进行研究，开发出一个实用的，科学的，严谨的，高效的羊胚胎素的提取方法，并获得一种小分子羊胎素。
[0010]本发明所述羊胎素为羊胚胎提取物，是通过生物技术方法，从85-100天胎羊中提取的一类生物活性物质，该阶段的胎羊中含有最大量的多种抗衰老因子、表皮生长因子、组织修复因子等，能促进表皮分化更新，使机体延缓衰老，增加皮肤弹性，使皮肤美白光滑，还能改善睡眠、增强免疫力、抗疲劳、防辐射等功能，克服了目前羊胎提取物存在免疫原性高、生物活性差、专一性弱、效果不明显等缺点，使其具有更强的适应性，不易过敏，更好的抗衰老、促进细胞生长和组织修复的功能。
[0011]目前羊胚胎提取物的提取工艺方法比较多，要么比较复杂要么过于粗放，不能用于实际运用。复杂的如:申请号98112918.8，一种羊胎素针剂的制造方法，在制作过程中加入丙酮、乙醇、三氯乙酸、硫酸铵等化学物质，在实际生产以及产品实用中会面临很多问题。简单的方法很多，有的纯粹是打着羊胎素的名实际生产的是羊胎粉，如申请号:98101188.8，一种制作冻干羊胎素的方法；申请号:98115761.0,羊胎素冻干粉及其生产方法。有的甚至在提取的较纯的羊胎素中添加了大量的胰酶或者胃蛋白酶酶切的蛋白肽段，而这些肽段是很复杂的混合物，限制了羊胎素的使用范围以及影响使用效果，如申请号:200610085611.6，从羊胚胎中提取活化小分子羊胎素的方法及其用途。
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于提供一种小分子羊胎素的提取方法，确切地说是一种小分子羊胚胎素，是从85-100天胎龄的羊胚胎细胞中提取出来的一种具有极高生物活性的营养物质，能够提高人体细胞的分裂速度，活化人体细胞，加速老化细胞的分解排除。
[0013]本发明的目的还在于提供上述小分子羊胎素在护肤品领域的应用。
[0014]一种小分子羊胎素的提取方法，按照如下步骤进行:
[0015](I)挑选身体健康、年龄在2-3岁、发情周期正常的经产母羊作为待孕羊，所有羊均已经检疫、防疫和药浴等处理，并在饲料中补充青饲料、维生素和微量元素；
[0016](2)在待孕羊在黄体期7-14d时肌注氯前列烯醇，30h后开始观察发情，当观察到发情后12小时进行人工采精和输精，发情后24可复配一次，35天后进行B超检查，确定怀孕情况；
[0017](3)待胎羊长到85-100天时，手术法取出胎羊，置于高温灭菌的容器内，用无菌生理盐水洗净，去除眼球、大脑、肝、肺、心、肠和胃；
[0018](4)用无菌生理盐水清洗，浙干水分，称重，用消毒过的剪刀把胎羊剪碎，放入灭菌过的匀浆机内匀浆；
[0019](5)加入生理盐水与胎羊碎块进行匀浆，匀浆液加入生理盐水稀释，生理盐水的总量是胎羊质量的2-4倍，匀浆稀释液经不锈钢滤网过滤，上层50目，中层100目，下层200目；
[0020](6)匀浆滤过液置于消毒过的钢化玻璃托盘放置_30°C冰箱，冰冻过夜，或储存；
[0021](7)取出冻存的匀浆滤过液室温解冻，至完全冻融，转入无菌离心容器内，3000-5000rpm,离心8-12分钟，弃沉淀；
[0022](8)上清转入无菌耐热容器，置于60-80°C水浴，60-80°C保温20_40分钟，充分杀灭胎羊可能从母体带入的病毒以及变性杂蛋白；
[0023](9)迅速放入-30°C冰箱冷却至-1-1 °C，或冻存；
[0024](10)转移液体至灭菌的离心容器，3000-5000rpm,离心20-40分钟，弃沉淀；
[0025](11)上清转入灭菌容器，使用切向流超滤系统，根据上清的体积使用不同的系统，超滤；
[0026](12)滤膜超滤后分成两部分，浓缩液大于30KD的杂蛋白，弃用；滤过液为小于30KD的小分子蛋白；使用切向流超滤系统对滤过液进行超滤浓缩，得到浓缩液及滤过液，对浓缩液进行0.22ug过滤除菌，_80°C冻存。
[0027]步骤(11)所述切向流超滤系统为Centramate超滤系统及T系列膜包，30KD孔径。
[0028]步骤(12)所述切向流超滤系统为Centramate超滤系统及T系列膜包，30KD孔径，使用IKD膜包。
[0029]所述小分子羊胎素颜色为淡黄色，浓度越浓颜色越深，最大紫外吸收值为252nm ；PH为6.7-7.4 ；SDS-PAGE电泳条带为15KD ;纯度95% ;产率为lg/100g胎羊体重。
[0030]上述小分子羊胎素在护肤品领域的应用，用于制备除皱纹增加皮肤的光洁度及细腻度的冻干粉，所述冻干粉由以下重量份数的物质组成:小分子羊胎素3-8份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，透明质酸0.01-1份，水80-90份。
[0031]上述小分子羊胎素在护肤品领域的应用，用于制备除皱纹增加皮肤的光洁度及细腻度的溶液，所述溶液由以下重量份数的物质组成:小分子羊胎素4-8份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，水80-90份。
[0032]本发明的有益效果:
[0033]本发明采用物理方法分多级对原材料进行纯化，全程没有有机试剂或者其他化学物质的介入，且在低温下完成提取，不但保持了提取物的纯净，且最大限度的保留了羊胎中的活性物质，安全、环保、低能耗，易于标准化、规模化生产。
[0034]本发明采用同期发情技术以及外科手术法开刀获取胎羊，既得到大量的同批次胎羊又保证了胎羊原料的无菌、新鲜，手术后的母羊还可以继续怀孕，生产新的胎羊，提高了母羊的使用率，减少了成本。
[0035]本发明采用分级提取、优化利用的技术方案。先提取了一种小分子天然活性小分子羊胎素后，又对大分子羊胎素进行木瓜蛋白酶酶切，得到大量具有生物活性的小分子多肽及游离氨基酸。既提高了产品的生产效率，保证了原料的最大限度利用及产品的最大使用效果；既保持了小分子羊胎素的天然活性，又避免了大分子羊胎素所具有的免疫原性等问题。
[0036]本发明采用了先进的切向流超滤技术，物理方法截取了小于30K的天然活性小分子羊胎素及酶切后的小分子多肽；同时使用切向流超滤技术浓缩，拦截并浓缩了具有天然活性的、主要分子量为1-30K的小分子羊胎素及酶切多肽。
[0037]本发明采用了超声辅助酶切技术，对大于30K的大分子羊胎素蛋白进行快速、低温水解，避免了传统蛋白质酶解的温度高、时间长的弊端。
[0038]本发明制得小分子羊胎素在理化性质参数及紫外吸收光谱图谱等优于相类似产品的羊胎素，并经清除羟自由基、超氧自由基实验、细胞培养实验、自愿者试验，皆证明其有很高的清除自由基、促进细胞生长的活性以及去除皱纹、美化皮肤的作用。
[0039]本发明制得的小分子羊胎素用途广泛，适用于工业大生产。原料来源、原料处理、生产效率、生产工艺、产品效果都有传统方法不可比拟的优势，容易建厂投产，并且低能耗，低排放，符合低碳环保要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为本发明提取的小分子羊胎素电泳图。
[0041]图2为使用本发明小分子羊胎素前后对照图。
[0042]图3为使用本发明小分子羊胎素前后对照图。
【具体实施方式】
[0043]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0044]实施例1
[0045]一种小分子羊胎素的提取方法，按照如下步骤进行:
[0046](I)挑选身体健康、年龄在2-3岁、发情周期正常的经产母羊作为待孕羊，所有羊均已经检疫、防疫和药浴等处理，并在饲料中补充青饲料、维生素和微量元素；
[0047](2)在待孕羊在黄体期7-14d时肌注氯前列烯醇，30h后开始观察发情，当观察到发情后12小时进行人工采精和输精，发情后24可复配一次，35天后进行B超检查，确定怀孕情况；
[0048](3)待胎羊长到85-100天时，手术法取出胎羊，置于高温灭菌的容器内，用无菌生理盐水洗净，去除眼球、大脑、肝、肺、心、肠和胃；
[0049](4)用无菌生理盐水清洗，浙干水分，称重，用消毒过的剪刀把胎羊剪碎，放入灭菌过的匀浆机内匀浆；
[0050](5)加入生理盐水与胎羊碎块进行匀浆，匀浆液加入生理盐水稀释，生理盐水的总量是胎羊质量的3倍，匀浆稀释液经三层不锈钢滤网过滤，上层50目，中层100目，下层200目；
[0051](6)匀浆滤过液置于消毒过的钢化玻璃托盘放置_30°C冰箱，冰冻过夜，或储存；
[0052](7)取出冻存的匀浆滤过液室温解冻，至完全冻融，转入无菌离心容器内，4000rpm,离心10分钟，弃沉淀；
[0053](8)上清转入无菌耐热容器，置于70°C水浴，70°C保温30分钟，充分杀灭胎羊可能从母体带入的病毒以及变性杂蛋白；
[0054](9)迅速放入-30°C冰箱冷却至-1-1 °C，或冻存；
[0055](10)转移液体至灭菌的离心容器，4000rpm,离心30分钟，弃沉淀；
[0056](11)上清转入灭菌容器，使用切向流超滤系统，根据上清的体积使用不同的系统，超滤；
[0057](12)滤膜超滤后分成两部分，浓缩液大于30KD的杂蛋白，弃用；滤过液为小于30KD的小分子蛋白；使用切向流超滤系统对滤过液进行超滤浓缩，得到浓缩液及滤过液，对浓缩液进行0.22ug过滤除菌，_80°C冻存。
[0058]步骤(11)所述切向流超滤系统为Centramate超滤系统及T系列膜包,30KD孔径。
[0059]步骤(12)所述切向流超滤系统为Centramate超滤系统及T系列膜包,30KD孔径，使用IKD膜包。
[0060]所述小分子羊胎素颜色为淡黄色，浓度越浓颜色越深，最大紫外吸收值为252nm ；PH为6.7-7.4 ；SDS-PAGE电泳条带为15KD ;纯度95% ;产率为lg/100g胎羊体重。其电泳图如图1所示。
[0061]实施例2
[0062](I)通过手术方法解剖母羊，得到无菌的胎羊，置于无菌容器内，用生理盐水洗净，去除眼球、大脑、肝、肺、心、肠和胃。
[0063](2)用无菌生理盐水清洗，浙干水分，称重。
[0064](3)加入无菌纯水与胎羊碎块进行匀浆，匀浆液加入纯水稀释，纯水的质量是胎羊质量的3倍，匀浆稀释液经三层不锈钢滤网过滤，上层20目，中层50目，下层100目。
[0065](4)匀浆滤过液置于无菌容器放置_30°C冰箱，冰冻过夜，或储存。
[0066](5)取出冻存的匀浆滤过液室温解冻，转入无菌耐热容器，置于70°C水浴，70°C保温30分钟。
[0067](6)迅速冷却，-30摄氏度冻存。
[0068](7)解冻，转移液体至离心容器，4000rpm, 10分钟，弃沉淀。
[0069](8)上清转入无菌容器,使用pall公司切向流超滤系统,30k孔径,超滤。
[0070](9) 30K滤膜超滤后分成两部分，一部分是大于30K的大蛋白，一部分小于30k的小分子多肽，对大于30KD的组分离心，4000转离心20分钟，去沉淀；用木瓜蛋白酶进行超声辅助酶切，95-98摄氏度保温溶液3?5分钟以中止酶解反应，静止10分钟并快速降温低于10摄氏度。
[0071](10)对上述水解液离心，4000rpm，20分钟，去除酶切后产生的沉淀。保留上清，上清液经30KD超滤膜超滤，收集小于30KD的组分；再使用pall公司切向流超滤系统，IkD孔径，对小于30KD的组分浓缩,采用核酸蛋白测定仪(Eppendorf B1Photometer Plus)测定其浓度值，蛋白浓度模式，280nm检测，统一浓度。编号为:A2，SDS-PAGE电泳检测，主条带为12K大小的小分子多肽。A2即为优化小分子羊胎素原液，备用。
[0072](11)对第9步超滤小于30K的组分进一步提取纯化,使用pall公司切向流超滤系统，IkD孔径，超滤，超滤后得到两个组分，浓缩液为小于30K超滤组分的高浓缩产物，采用核酸蛋白测定仪(Eppendorf B1Photometer Plus)测定其浓度值，蛋白浓度模式，280nm检测，统一浓度，编号为Al，即为天然活性的小分子多肽原液，SDS-PAGE电泳主要分子量在12KD左右，透过液其分子量小于IKD，SDS-PAGE电泳不能检出条带。
[0073](12)把A1、A2作为原料分别冻存。需生产成品时解冻，按生产需要量取一定体积的原料，称取甘露醇，按质量百分比5%终浓度称取；称取海藻糖，按质量百分比5%终浓度称取，二者加入Al或A2溶解(最终质量百分为6% ),定容,用0.22um滤器过滤，采用核酸蛋白测定仪(Eppendorf B1Photometer Plus)测定其浓度值,蛋白浓度模式,280nm检测，备用。
[0074](13)另外称取无菌透明质酸钠，加入适量无菌PBS溶解，使其浓度为1%，取适量1%的透明质酸溶液加入上述已加辅料(甘露醇、海藻糖)的羊胎素液，使透明质酸在溶液里的终浓度为0.05%，超净工作台上分装，分装体积Iml/管。冻干机冻干，使用时加入3ml的无菌溶解用水溶解，直接涂抹于脸部等需要美容护肤的部位。
[0075](14)对A1、A2原料按照第(12)、(13)步的步骤加工成成品，分别获得产品I及产品2，两种产品皆具有具有高效去除羟自由基、超氧自由基的活性。
[0076]Al，分子量小于30KD的天然活性小分子多肽及小蛋白，主要分子量经SDS-PAGE检测主要在12KD左右，具有清除羟自由基、超氧自由基、促进细胞生长的活性以及去除皱纹、美化皮肤的作用，质谱鉴定出有54中蛋白的多肽片段或小蛋白。
[0077]A2，分子量小于30KD的活性小分子多肽，经SDS-PAGE检测其分子量主要在12KD
左右，具有清除轻自由基、超氧自由基活性。
[0078]本品经100名志愿者使用，发现能够明显的去除皱纹，增加皮肤的光洁度及细腻度。使用效果见图2-3 (该志愿者为女性，65岁，艺术家，使用Al产品)。
【权利要求】
1.一种小分子羊胎素的提取方法，其特征在于，按照如下步骤进行: (1)挑选身体健康、年龄在2-3岁、发情周期正常的经产母羊作为待孕羊，所有羊均已经检疫、防疫和药浴等处理，并在饲料中补充青饲料、维生素和微量元素； (2)在待孕羊在黄体期7-14(1时肌注氯前列烯醇，30卜后开始观察发情，当观察到发情后12小时进行人工采精和输精，发情后24可复配一次，35天后进行8超检查，确定怀孕情况； (3)待胎羊长到85-100天时，手术法取出胎羊，置于高温灭菌的容器内，用无菌生理盐水洗净，去除眼球、大脑、肝、肺、心、肠和胃； (4)用无菌生理盐水清洗，浙干水分，称重，用消毒过的剪刀把胎羊剪碎，放入灭菌过的匀浆机内匀浆； (5)加入生理盐水与胎羊碎块进行匀浆，匀浆液加入生理盐水稀释，生理盐水的总量是胎羊质量的2-4倍，匀浆稀释液经不锈钢滤网过滤，上层50目，中层100目，下层200目； (6)匀衆滤过液置于消毒过的钢化玻璃托盘放置-30-(:冰箱，冰冻过夜，或储存； (7)取出冻存的匀浆滤过液室温解冻，至完全冻融，转入无菌离心容器内，3000-5000^111,离心8-12分钟，弃沉淀； (8)上清转入无菌耐热容器，置于60-801水浴，60-801保温20-40分钟，充分杀灭胎羊可能从母体带入的病毒以及变性杂蛋白； (9)迅速放入-301冰箱冷却至或冻存； (10)转移液体至灭菌的离心容器，3000-500011)111，离心20-40分钟，弃沉淀； (11)上清转入灭菌容器，使用切向流超滤系统，根据上清的体积使用不同的系统，超滤； (12)滤膜超滤后分成两部分，浓缩液大于301(0的杂蛋白，弃用；滤过液为小于301(0的小分子蛋白；使用切向流超滤系统对滤过液进行超滤浓缩，得到浓缩液及滤过液，对浓缩液进行0.22118过滤除菌，-801冻存。
2.根据权利要求1所述小分子羊胎素的提取方法，其特征在于，步骤(11)所述切向流超滤系统为06111:1^111211:6超滤系统及I系列膜包，301(0孔径。
3.根据权利要求1所述小分子羊胎素的提取方法，其特征在于，步骤(12)所述切向流超滤系统为&11廿肅社6超滤系统及I系列膜包，30X0孔径，使用11(0膜包。
4.根据权利要求1所述小分子羊胎素的提取方法，其特征在于，所述小分子羊胎素颜色为淡黄色，浓度越浓颜色越深，最大紫外吸收值为252=111 ；？！！为6.7-7.4 ；808~？^62电泳条带为151(0 ；纯度95% ；产率为18/1008胎羊体重。
5.权利要求1所述小分子羊胎素在护肤品领域的应用，其特征在于，用于制备除皱纹增加皮肤的光洁度及细腻度的冻干粉，所述冻干粉由以下重量份数的物质组成:小分子羊胎素3-8份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，透明质酸0.01-1份，水80-90份。
6.权利要求1所述小分子羊胎素在护肤品领域的应用，其特征在于，用于制备除皱纹增加皮肤的光洁度及细腻度的溶液，所述溶液由以下重量份数的物质组成:小分子羊胎素4-8份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，水80-90份。
【文档编号】A61K8/02GK104382825SQ201410685145
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】曾凡一, 黄淑帧 申请人:上海滔滔转基因工程股份有限公司